Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Обогащение и характеристика опухоли иммунной и неиммунизированных микросреды в установленных подкожной мышиных опухоли

9.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/57685

⸱

7 июня 2018 г.

 ,  , 
1Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Baylor College of Medicine, 2Interdepartmental Graduate Program in Translational Biology and Molecular Medicine, Baylor College of Medicine

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы описываем метод для разделения и обогатить компоненты иммунной и неиммунизированных микроокружения опухоли в установленных подкожной опухоли. Эта техника позволяет для отдельного анализа иммунной инфильтрата опухоли и опухоли неиммунизированных фракций, допускающие всеобъемлющей характеристика иммунной микроокружения опухоли.

Аннотация

Иммунных микроокружения опухоли (время) недавно был признан критическим посредника лечения реакции в солидных опухолей, особенно для immunotherapies. Последние клинические достижения в иммунотерапии подчеркивают необходимость для воспроизводимых методы точно и тщательно характеризовать опухоли и ее ассоциированных иммунной инфильтрата. Опухоль ферментативного пищеварения и анализ потока гранулярных позволяют широкий характеристика многочисленных подмножеств иммунных клеток и фенотипы; Однако глубина анализа часто ограничивается Флюорофор ограничений на дизайн панели и необходимость приобретения большой опухоли образцы наблюдать редких иммунитета населения интерес. Таким образом мы разработали метод эффективной и высокой пропускной способности для разделения и обогащение иммунной инфильтрата опухоль от компонентов неиммунизированных опухоли. Описанные опухоли пищеварение и центробежной сепарации на основе плотности техника позволяет отдельные характеристики опухоли и опухоли иммунной инфильтрата фракций и сохраняет клеточной жизнеспособности и таким образом, обеспечивает широкую характеристику опухоли Иммунологические состояние. Этот метод был использован для характеристики обширные пространственные иммунной гетерогенность в солидных опухолей, который еще раз демонстрирует необходимость последовательного всей опухоли иммунологические методы профилирования. В целом этот метод обеспечивает метод эффективной и гибкой для иммунологической характеристики подкожной мышиных солидных опухолей; Таким образом, этот инструмент может использоваться для лучше характеризуют опухолевой иммунологические особенности и в доклинической оценке новых иммунотерапевтических стратегий.

Введение

ЭТИМ супрессивной недавно было признано в качестве отличительной чертой рака и известен играть значительную роль в разработке, прогрессии и защита твердых опухоли рака, а также уменьшить их подверженность иммунотерапия1. ВРЕМЯ состоит из многочисленных клеточных подмножеств и фенотипы, все из которых обеспечивают критический взгляд в состояние иммунологической опухоли. Эти иммунологические подмножества может быть далее разбиты на клетки лимфоцита или миелоидной происхождения, которые вместе составляют большинство врожденного и адаптивного иммунного ответа2,3. Последние достижения в области рака иммунотерапия продемонстрировали, что иммунотерапевтических стратегии (т.е., иммунных КПП ингибиторы, химерных антигена рецепторов Т-клетки и т.д.) имеют потенциал, чтобы побудить прочный рака регрессии; Однако они по-прежнему относительно неэффективными в твердые опухоли рака4,5. Многочисленные группы показали критическое препятствие, что время может играть на успех лечения6,7, и таким образом, сохраняется необходимость точно оценить новые immunotherapies в параметре доклинические, уделяя особое внимание их возможность модулировать или преодолеть время8.

Нынешние попытки характеризовать время обычно используют либо микроскопии или проточная цитометрия наряду с антитела обозначая стратегии выявления клеточных иммунных подмножеств и их особенности9,10. Эти две стратегии обеспечивают уникально различную информацию, как микроскопии позволяет пространственных признательность сотовой подмножеств и проточной цитометрии обеспечивает высокую пропускную способность и более широкой количественная оценка клеточных изменений. Несмотря на недавние улучшения в флуоресцентные мультиплекс иммуногистохимии, оптимизации спектральных тепловизионных систем, которые теперь может поддерживать до 7 параметры, ограниченной группы размер затрудняет широкий уровень иммунной профилирования и таким образом эта техника часто зарезервировано для более сосредоточены анализы. В результате проточной цитометрии остается одним из наиболее широко используемых иммунной, методы профилирования. Несмотря на широкое использование в характеристике времени методы, используемые для обработки и окраски являются довольно переменной. Чаще всего протоколы используют опухоль отделения фермента (то есть, коллагеназы, DNase, и т.д.) и ручной диссоциации методы для достижения одной ячейки суспензий, следуют антитело пятная и анализ7. Несмотря на преимущества каждого метода многочисленные группы показали большой изменчивости, который может быть вызван через эти методы11. Это крайне затрудняет сопоставление кросс исследование профилирования микроокружения опухоли, даже при оценке той же модели мышиных опухоли. Кроме того эти методы предоставляют ограниченный потенциал для оценки опухоли сотовой и опухоли иммунной проникновения компонентов независимо друг от друга, поскольку оба компонента перемежаются после переваривания. Количество образцов затем ограничивает мультипанельные окрашивание и анализа, который становится серьезной проблемой при попытке характеризовать редкие иммунологические подмножеств (то есть, опухоль – специфичные Т-клетки)12. Более последние методы массового цитометрии, или цитометрии на время полета (CyTOF), позволяют высокой мерного фенотипического анализа сотовой подмножеств с некоторых систем, поддерживающих конструкций группа более чем 42 независимых параметров13. Несмотря на огромную мощь CyTOF технологии в иммунной профилирование он остается ограниченным из-за расходов, анализ опыта и доступ к оборудованию. Кроме того, многие протоколы CyTOF рекомендуем очистки иммунных подмножеств для улучшения соотношения сигнал шум14, и поэтому мы предлагаем, что наш метод обогащения могут быть использованы вверх по течению от CyTOF анализа для повышения качества данных.

Здесь мы описываем пищеварение микроокружения опухоли и анализа, метод, который включает в себя опухоли иммунной проникновения разделения. Цель данного метода должна позволить независимым высок объём профилирование иммунной инфильтрата опухоли и опухоли сотовой фракций для широкого характеристика микроокружения опухоли. С помощью этого метода, мы еще больше продемонстрировать важность проведения анализа всей опухоли, как модель подкожной твердых опухолей было установлено значительное пространственная неоднородность иммунологические. В целом этот метод можно более точно и последовательно сравнить между выборками потому что оно обогащает иммунной сотовой подмножеств внутри опухоли и позволяет для независимого профилирования опухолевых клеток и иммунных фракций опухоли.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все методы, описанные здесь были одобрены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) колледж Бейлор.

1. опухоли урожай и пищеварение

Примечание: Время, необходимое для урожая составляет ~ 3-5 мин/опухоли и время, необходимое для обработки ~ 1 ч + 2-3 мин/опухоли.

  1. Усыпить мышей углекислый газ вдыханием и спрей каждой мыши вниз с 70% этанол до сбора урожая для предотвращения загрязнения волос. Хирургического удаления подкожной опухоли от мышей и убедитесь, что опухоли, свободны от каких-либо загрязняющих ткани (то есть, волос, кожи, брюшины, и т.д.). Место каждого опухоли в 1,8 мл базового RPMI 1640 СМИ без плода бычьим сывороточным (ФБС) в 24-ну пластине. Для больших урожаев Держите пластины холодной на льду сохранять клеточной жизнеспособности.
    Примечание: Если требуется стерильности, все опухоли Анатомирование будет нужно выполнить в области биобезопасности, кабинет с стерильные хирургические инструменты (т.е., ножницы, пинцет и т.д.), а также любые дальнейшие шаги. Опухоли с длинной диаметром 0,5 - 1 см являются оптимальными, и потребует больших или меньших опухолей, масштабирование реагентов.
  2. Используйте ножницы, чтобы вырезать опухоли на менее чем 1 мм3 штук в каждой скважине.
  3. Подготовка 10 x коктейль пищеварение, растворяя коллагеназы я в 10 мг/мл, коллагеназа IV на 2500 ЕД/мл и DNase I на 200 ед/мл в базовый RPMI 1640 СМИ (без FBS).
    Примечание: Пищеварение коктейль могут быть подготовлены заранее день и хранятся при температуре-20 ° C; Однако длительного хранения не рекомендуется как ферменты потеряет деятельности с течением времени один раз распущен.
  4. Добавить 200 мкл 10 x диссоциации коктейль, содержащий коллагеназы I, IV коллагеназы и DNase I к каждой скважины с 1 мм3 штук.
  5. Разрешить образцов дайджест за 1 ч при 37 ° C при слегка покачивая на 60-100 об/мин с помощью орбитальных пластины шейкер.
    Примечание: Повышение температуры до 37 ° C в течение ферментативного пищеварения может привести к активации иммунных клеток.
  6. После 1 h нейтрализации реакции, добавив 1 мл RPMI 1640 СМИ с 5% ЭДТА FBS и 2 мм для каждой скважины.
  7. Пипетка опухоли пищеварение и оставшиеся части опухоли в стрейнер клеток 40 мкм, сидящего на вершине 50 мл пластиковых пробирок.
    Примечание: Отрежьте кончик офф кончик Пипетка 1 мл опухоли пищеварения проще передать ситечко.
  8. Используйте 10 мл шприц плунжерный механически дезагрегировать части опухоли через стрейнер. Периодически промывать фильтр с 2 мл дополнениями RPMI 1640 СМИ (содержащая 5% FBS) и повторять до тех пор, пока ячейка ситечко ясно опухоли.
    Примечание: Примерно 4-10 мл всего СМИ должно быть достаточно для адекватного промойте ситечко опухоли.
    Примечание: Место образцы на льду до завершения этого шага для всех образцов для сохранения клеточной жизнеспособности.
  9. Настройте каждый 50 мл пластиковых пробирок на том же, используя дополнениями RPMI 1640 средств массовой информации.
    Примечание: Регулировка громкости имеет решающее значение для балансировки центрифуги. Пропустить этот шаг может привести к центрифуге повреждения или травмы.
  10. Центрифуга для клеточных суспензий (5 мин, 805 x g, 4 ° C), отменить supernatants и вновь приостановить в 2 мл дополнениями RPMI 1640 средств массовой информации.
    Примечание: Мобильный агрегат может образоваться после центрифугирования, что трудно Ресуспензируйте. Используйте 5 мл Серологические Пипетки и перемешать быстро разорвать его перед продолжением.

2. разделение фракций иммунной и опухоли сотовой

Примечание: Время, необходимое для этого шага составляет примерно 1 час.

  1. Добавьте 3 мл средний градиент плотности в нижней части пластиковых пробирок 15мл. Подготовить и ярлык достаточно трубы для каждого опухоли.
  2. Слой 2 мл суспензии клеток опухоли на вершине градиент средней плотности, закупорить медленно вниз стороне трубки для предотвращения смешивания двух слоев.
  3. Осторожно поместите многослойных труб в центрифуге и спина на 20 мин в 805 x g, 20 ° C, без тормозов.
    Примечание: Очень важно для проверки надлежащего баланса и убедитесь, что тормоза не используется во время центрифугирования. Любое нарушение этого процесса приведет к слоя смешивания и полный пример восстановления будет сложно.
  4. Тщательно передачи опухоли, проникнув лейкоцитов (сезам) слой и слой Топ СМИ к новой трубки 15 мл с помощью пипетки передачи. Отменить все оставшиеся среднего градиента плотности и Ресуспензируйте Пелле опухоли в нижней части трубки в 2 мл дополнениями RPMI 1640.
    Примечание: После центрифугирования там будет четыре видимые слои сверху донизу, который соответственно соответствуют: СМИ, Тилс, средний градиент плотности и Пелле опухолевых клеток. Смотрите Рисунок 2A для примера различных слоев.
  5. Центрифуга для обоих TIL и образцы опухоли в отдельные трубки (5 мин, 805 x g, 4 ° C) и удалить супернатант.
  6. Ресуспензируйте TIL образца в 200 мкл и Пелле опухоли в 2 мл дополнениями RPMI 1640 средств массовой информации. Держите на льду сохранять жизнеспособность.

3. покрытие и окрашивания

Примечание: Время, необходимое для покрытия составляет 30 s/опухоли; время, необходимое для окрашивания поверхности составляет 1 ч; время, необходимое для окрашивания внутриклеточных — 40 мин; время, необходимое для анализа потока цитометрии 1 - 4 мин/опухоли.

  1. Подготовить и подсчитывает лейбл 96-Ну U-дно пластина для каждого иммунной, окрашивание группа и дополнительные пластины для ячейки.
    Примечание: Как правило, три тарелки подготовлены в общей сложности: лимфоцитов сосредоточена группа тарелку, миелоидной сосредоточена группа тарелку и блюдо количество клеток.
  2. Аликвота сингл клеточных суспензий в каждый из окрашивание панель плиты и набор тома в пластину игр.
    Примечание: Количество пластина используется для вычисления общее количество ячеек добавляется каждый окрашивание панель, тем самым позволяя точной клеток населения. Проточный цитометр с 96-луночных пластины выборки и объемный анализ возможностей может обеспечить количество клеток / мкл каждого образца и таким образом, подсчитать количество ячеек добавляется каждый окрашивание панели. Количество пластин может быть приобретено на следующий день после фиксации на ночь при 4 ° C, полоскание с СУИМ буфера (фосфат буфер солевой раствор (PBS) с 2% FBS) и resuspending в набор объем буфера СУИМ.
  3. Вымойте клетки дважды с 200 мкл Дульбекко фосфатный буфер (DPBS) на сэмпл, центрифугирование (5 мин, 805 x g, 4 ° C) и отменяя супернатант между каждой промыть, чтобы удалить любые бесплатные FBS.
  4. Добавьте 50 мкл ФК блока, смешать образцов с помощью многоканальных дозаторов и проинкубируйте втечение 20 мин при 4 ° C.
  5. Добавьте 50 мкл 2 x сосредоточены внеклеточного таргетинга антитела и поправимо жизнеспособности пятно смесь, смешайте с помощью многоканальных дозаторов и Инкубируйте 30 мин в темноте на RT или 4 ° C.
    Примечание: Точного окрашивания условия для антитела зависит от инструкции производителя. Все окрашивание разведений должны быть в DPBS, с не добавлен FBS для предотвращения насыщения поправимо жизнеспособности красителя. Пожалуйста, смотрите Таблицу материалы/оборудование для оптимального разведений окрашивание панели, используемые в этой рукописи. В 2 x концентрации антител и поправимо жизнеспособности, окрашивание раствора готов предоставить окончательный 1 x пятнать концентрация в 100 мкл окрашивание объема при добавлении блока ФК.
  6. Стирать образцы дважды с буфером СУИМ, центрифугирование (5 мин, 805 x g, 4 ° C) и отменяя supernatants между каждой промывки.
  7. Ресуспензируйте в 200 мкл 1 x фиксации/permeabilization решение и инкубировать на ночь при 4 ° C, защищать от света.
    Примечание: Эксперимент может быть приостановлена на ночь на данный момент: хранить пробы на 4 ° C, защищать от света.
  8. На следующий день, центрифуга пластины (5 мин, 805 x g, 4 ° C) и удалить супернатант.
  9. После промойте 200 мкл 1 x permeabilization буфера, центрифуг (5 мин, 805 x g, 4 ° C) и удалить супернатант.
  10. 100 мкл 1 x концентрации внутриклеточного антитело пятная группы подготовленный в буфере 1 x permeabilization и Инкубируйте 30 мин в темноте на RT или 4 ° C (это зависит от окрашивания рекомендаций от производителя).
  11. Промыть после того, как с 1 x permeabilization буфера (5 мин, 805 x g, 4 ° C), удалить супернатант и полоскать во второй раз с буфером СУИМ (PBS с 2% FBS).
  12. Ресуспензируйте образцы в 300 мкл буфера СУИМ (PBS с 2% FBS), передавать образцы цитометрии расходомерных трубок и выполнять анализ цитометрия потоков.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Наши результаты показывают значительное преимущество TIL отделение от опухоли неиммунизированных компонентов, как описано в протоколе. Кроме того мы с помощью метода описаны продемонстрировать значительный иммунологические неоднородность установленных солидных опухолей.

Серьезной проблемой с много методов диссоциации опухоли является потеря жизнеспособности образца, чаще всего в результате суровых пищеварение условия (то ест...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

ВРЕМЯ состоит из разнообразных и сложных клеточных компонентов и молекул. Последние данные свидетельствуют о том, что точная характеристика этой среды может обеспечить более глубокого понимания лечения успеха или неудачи и может даже помочь определить механизмы терапевтического сопротивления. Например повышение уровня внутриопухолевых различных иммуносупрессивные клеток (т.е., MDSCs, регуляторных клеток T и т.д.) могут смягчить эффекторных иммунных реакций и отменить иммунотерапевтических эффекты. С дру...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

JMN признает финансовую поддержку от национального института Генеральной медицинских наук (T32GM088129) и Национального Института стоматологии и челюстно-лицевой исследований (F31DE026682), оба из национальных институтов здравоохранения. Содержание является исключительно ответственности авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения национальных институтов здоровья. Этот проект был поддержан также цитометрии и сортировка сердечник клетки в колледж Бейлор с финансирования из низ (P30 AI036211 Р30 CA125123 и S10 RR024574) и экспертной помощи Джоэл м. Sederstrom.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Самцы C57BL/6 мышей в возрасте от 6 до 12 недельJackson Laboratory Н/ДМыши, используемые в наших исследованиях опухолей
MEER Мышиная линия сингенных раковых клеток, приобретенная от соавтора N/AE6/E7 Антиген ВПЧ, экспрессирующий клеточную линию эпителиального рака тонзиллярной эпителии мыши 
70% изопропиловый спирт EMD Milipore PX1840
Набор хирургических инструментов для мышейWorld Precision Instruments Набордля МЫШЕЙВ первую очередь нужны только ножницы, пинцет и скальпель.
24-луночный планшет Denville Scientific Inc.T1024Или любая 24-луночная пластина с плоским дном. 
RPMI-1640 медиаSigma-AldrichR0883
коллагеназа I EMD Milipore234153
коллагеназа IVWorthington Biochemical CorporationLS004189
DNase I Sigma-Aldrich11284932001
Низкоскоростной орбитальный шейкерBioExpress (поставщик: Genemate) С-3200-ЛСИли любой орбитальный вибростенд.
Терморегулирующий инкубаторFisher Scientific13-255-27Или любой другой терморегулируемый инкубатор
FBSSigma-AldrichF8192
EDTAAMRESCOE177
1 мл Пипетка и наконечникиEppendorf13-690-032Или любой другой пипетка и наконечники
40 мкм Клеточные фильтрыFisher Scientific22363547
Центрифужные пробирки 50 млDenville Scientific Inc.C1062-P
15 мл Конические трубкиDenville Scientific Inc.C1012
10 мл Шприц Luer-Lok без иглBD309604
Lymphoprep Density Gradient MediumSTEMCELL Technologies7811
Transfer PipettesDenville Scientific Inc.P7212
96-луночные U-образные днищевые пластиныDenville Scientific Inc.
DPBSSigma Aldrich D8573
FoxP3 Набор буферов для окрашивания транскрипционного фактора ThermoFisher Scientific00-5523-00Фикс/пермеабилизационный буфер и пермеабилизационный буфер
терморегулируемая центрифугаEppendorf 5810 R
Attune NxT Проточный цитометрThermoFisher ScientificN/AДля объемного подсчета 96-луночных клеток 
Очищенный Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (мышиный блок BD Fc)  Клон 2.4G2 ThermoFisher Scientific553141Fc Block
LIVE/DEAD Фиксируемый набор для окрашивания синими мертвыми клетками, для возбуждения ультрафиолетаThermoFisher ScientificL34962Фиксируемое окрашивание жизнеспособности
CD45 Моноклональное антитело (30-F11), APC-eFluor 780ThermoFisher Scientific47-0451-80
TCR бета-моноклональное антитело (H57-597), APCThermoFisher Scientific17-5961-82
CD8-α Антитела (KT15), ПЭСанта Круз Биотехнологияsc-53473 
Моноклональное антитело CD4 (GK1.5), PE-Cyanine5ThermoFisher Scientific15-0041-81
MHC Class II (I-A/I-E) Моноклональное антитело (M5/114.15.2), Alexa Fluor 700ThermoFisher Scientific56-5321-82
Моноклональное антитело CD11c (N418), PE-Cyanine5ThermoFisher Scientific15-0114-82
F4/80 Моноклональное антитело (BM8), eFluor 450Моноклональное антитело ThermoFisherScientific 48-4801-80
CD11b (M1/70), моноклональное антитело APCThermoFisherScientific 17-0112-81
Моноклональное антитело Ly-6G (Gr-1) (RB6-8C5), PEThermoFisher Scientific12-5931-82
CD274 (PD-L1, B7-H1) моноклональное антитело (MIH5), PE-цианин7ThermoFisher Scientific25-5982-80
CD273 (B7-DC) моноклональное антитело (122), PerCP-eFluor 710ThermoFisher Scientific46-9972-82
Ki-67 моноклональное антитело (B56), BV711BD Biosciences563755

Ссылки

  1. Fouad, Y. A., Aanei, C. Revisiting the hallmarks of cancer. American Journal of Cancer Research. 7 (5), 1016-1036 (2017).
  2. Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. -X. Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment. Nature Immunology. 14 (10), 1014-1022 (2013).
  3. Whiteside, T. L. The tumor microenvironment and its role in promoting tumor growth. Oncogene. 27 (45), 5904-5912 (2008).
  4. Chiou, V. L., Burotto, M. Pseudoprogression and Immune-Related Response in Solid Tumors. Journal of Clinical Oncology. 33 (31), 3541-3543 (2015).
  5. Menon, S., Shin, S., Dy, G. Advances in Cancer Immunotherapy in Solid Tumors. Cancers. 8 (12), 106(2016).
  6. Denkert, C., et al. Tumor-Associated Lymphocytes As an Independent Predictor of Response to Neoadjuvant Chemotherapy in Breast Cancer. Journal of Clinical Oncology. 28 (1), 105-113 (2010).
  7. Lee, Y., et al. Therapeutic effects of ablative radiation on local tumor require CD8+ T cells: changing strategies for cancer treatment. Blood. 114 (3), 589-595 (2009).
  8. Stakheyeva, M., et al. Role of the immune component of tumor microenvironment in the efficiency of cancer treatment: perspectives for the personalized therapy. Current Pharmaceutical Design. 23, (2017).
  9. Gerner, M. Y., Kastenmuller, W., Ifrim, I., Kabat, J., Germain, R. N. Histo-Cytometry: A Method for Highly Multiplex Quantitative Tissue Imaging Analysis Applied to Dendritic Cell Subset Microanatomy in Lymph Nodes. Immunity. 37 (2), 364-376 (2012).
  10. Bayne, L. J., Vonderheide, R. H. Multicolor Flow Cytometric Analysis of Immune Cell Subsets in Tumor-Bearing Mice. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), (2013).
  11. Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis. Journal of Immunological Methods. 405, 97-108 (2014).
  12. Casadevall, A., Fang, F. C. Rigorous Science: A How-To Guide. mBio. 7 (6), 01902-01916 (2016).
  13. Yao, Y., et al. CyTOF supports efficient detection of immune cell subsets from small samples. Journal of Immunological Methods. 415, 1-5 (2014).
  14. Kay, A. W., Strauss-Albee, D. M., Blish, C. A. Application of Mass Cytometry (CyTOF) for Functional and Phenotypic Analysis of Natural Killer Cells. Methods Mol. Biol. 1441, 13-26 (2016).
  15. Pachynski, R. K., Scholz, A., Monnier, J., Butcher, E. C., Zabel, B. A. Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model. Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

CD45
Обогащение и характеристика опухоли иммунной и неиммунизированных микросреды в установленных подкожной мышиных опухоли
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.