Здесь описан метод для изоляции микрососудов мозга крыс и для подготовки проб мембраны. Этот протокол имеет явное преимущество производства обогащенного microvessel образцы с приемлемым белка выход из отдельных животных. Образцы могут затем использоваться для анализа надежных белка на мозг микрососудистой эндотелия.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Простой и воспроизводимый метод подготовить образцы мембраны из микрососудов мозга свежевыделенных крыса
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) является динамической барьер ткани, которая реагирует на различные раздражители, патофизиологические и фармакологические. Такие изменения, вытекающие из этих стимулов может значительно модулировать доставки лекарств в мозг и выдвижением, вызывают значительные трудности в лечении центральной нервной системы (ЦНС) заболеваний. Многие BBB изменения, которые влияют на фармакотерапии, включать белки, которые локализованы и выражены на уровне эндотелиальных клеток. Действительно такие знания о физиологии BBB в здоровье и болезни вызвал значительный интерес к изучению этих мембранных белков. С точки зрения исследований фундаментальной науки это подразумевает потребность в простой, но надежный и воспроизводимый метод для изоляции микрососудов из ткани мозга, добываемых из подопытных животных. Чтобы подготовить образцы мембраны из свежевыделенных микрососудов, важно, что препаратов примере быть обогащенный в эндотелиальных клетках, но ограничены в присутствии других типов клеток, нервно-сосудистого подразделения (т.е., астроциты, микроглии, нейронов, pericytes). Дополнительным преимуществом является возможность готовить образцы из отдельных животных с целью захвата истинной изменчивость белков в экспериментальной населения. В этой рукописи предоставляются подробности относительно метода, который используется для изоляции микрососудов мозга крыс и подготовки образцов мембраны. Microvessel обогащения, от образцов, полученных, достигается с помощью четырех шагов центрифугирования, где декстрана включен в буфере выборки. Этот протокол может быть легко адаптирована в других лабораториях для их собственных конкретных приложений. Было показано, что образцы, созданные из этого протокола дают надежные экспериментальные данные от белка анализа экспериментов, которые могут значительно облегчить понимание BBB ответы на физиологические, патофизиологические и фармакологические стимулы.
Введение
Гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) существует на стыке центральной нервной системы (ЦНС) и кровообращения и играет важную роль в поддержании гомеостаза головного мозга. В частности BBB функций для точного управления вещества концентрации в внеклеточной жидкости мозга и чтобы эффективно поставки этих питательных веществ, которые необходимы ткани мозга выполнять значительные метаболические требования ЦНС1. Эти роли подразумевают, что BBB, который существует в первую очередь на уровне микрососудистой эндотелиальных клеток, должны обладать дискретных механизмов, которые позволяют некоторые вещества, чтобы получить доступ к паренхимы мозга, обеспечив....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все изложенные ниже процедуры были одобрены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) и соответствовать национальных институтов здравоохранения (НИЗ) и животных исследования: In Vivo экспериментов (прибытие) руководящих принципов представления докладов. Процедурные поток для протокола изображен на рисунке 1.
1. Установка для процедуры
- Подготовка мозга microvessel буфера (BMB). Начните с весом 54,66 g D-маннит, 1,90 g EGTA и базы 2-amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (то есть, Tris) 1,46 g в чистый стакан. Добавление 1.0 Л деионизированной воды. Смешайте компоненты в ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Экспериментальный поток для изоляции микрососудов мозга крыс и для подготовки проб мембраны microvessel показан на рисунке 1. С помощью процедуры, представленные здесь, свидетельствует успешное изоляции нетронутыми микрососудов от мозга крысы (рис. 2A). Эти суда были получены после завершения центрифугирования с декстрана и сразу же до начала ultracentrifugation подготовить образцы мембраны (т.е. После завершения шага 4.10). На э.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В этой статье описан простой и эффективный метод подготовки образцы протеина мембраны из микрососудов, свежезаваренным изолированы от ткани мозга крысы. Несколько подходов для изоляции микрососудов мозга крыс и/или поколение мембранных препаратов от изолированных microvasculature поступили в литературе13,20,,2122 , 24. Хотя в принципе аналогично Протокол изоля.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего сообщать.
Благодарности
Эта работа была поддержана грантов от национальных институтов здравоохранения (R01-NS084941) и биомедицинских исследований Комиссии Аризона (ADHS16-162406) PTR. WA получил прошлом поддержки от предварительного докторских назначение национальных институтов здравоохранения обучения Грант (T32-HL007249).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Коктейль ингибиторов протеазы | Sigma-Aldrich | #P8340 | Компонент буфера микрососудов головного мозга |
| D-маннитол | Sigma-Aldrich | #M4125 | Компонент буфера микрососудов головного мозга |
| EGTA | Sigma-Aldrich | #E3889 | Компонент буфера микрососудов головного мозга |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | #T1503 | Компонент буфера микрососудов головного мозга |
| Декстран (MW 75,000) | Spectrum Chemical Mftg Corp | #DE125 | Декстран, используемый на этапах центрифугирования для отделения микрососудов от паренхимы мозга |
| Zetamine | MWI Animal Health | #501072 | Общий анестетик |
| Ксилазин | Western Medical Supply | #5530 | Общий анестетик |
| 0,9% физиологический раствор | Western Medical Supply | Н/Д | Общий анестетик разбавляющая |
| фильтровальная бумага (диаметр 12,5 см) | VWR | #28320-100 | Используется для удаления мозговых оболочек из мозговой ткани |
| Центрифужные пробирки | Sarstedt | #60.540.386 | Одноразовые пробирки используются для этапов центрифугирования декстрана |
| Pierce™ Coomassie Plus (Bradford) Assay | ThermoFisher Scientific | #23236 | Измерение концентрации белка в мембранных препаратах |
| Wheaton Overhead Power Homogenizer | DWK Life Sciences | #903475 | Требуется для гомогенизации образцов |
| 10,0мл стеклянной ступки и измельчителя тканей | пестика DWK Life Sciences | #358039 | Требуется для гомогенизации образцов |
| Соляная кислота | Sigma-Aldrich | #H1758 | Требуется для регулировки pH буферов |
| Бычья сыворотка Альбумин | ThermoFisher Scientific | #23210 | Стандарт белка для Брэдфордского анализа |
| Стандартные щипцы | Fine Science Tools | #91100-12 | Используется для препарирования мозговой ткани |
| Friedman-Pearson Rongeurs | Fine Science Tools | #16020-14 | Используется для вскрытия черепа с целью изоляции мозга |
| Конические центрифужные пробирки 50 мл | ThermoFisher Scientific | #352070 | Используются для сбора мозговой ткани после изоляции |
| Стекло Пастер Пипец | ThermoFisher Scientific | #13-678-20C | Используются для аспирации клеточного мусора после декстрановых вращений |
| Этанол, безводный | Sigma-Aldrich | #459836 | Используются для очистки тканей шлифовальной машины; разбавляются до 70% дистиллированной водой |
| Ультрацентрифужные пробирки | Beckman-Coulter | #41121703 | Используются для ультрацентрифугирования образцов |
Ссылки
- Rolfe, D. F., Brown, G. C. Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals. Physiol Rev. 77 (3), 731-758 (1997).
- Brzica, H., Abdullahi, W., Ibbotson, K., Ronaldson, P. T.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
