Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Оценка жизнеспособности синтетических бактерий консорциума на интерфейсе в Vitro хост микробов кишечника

11K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/57699

⸱

4 июля 2018 г.

 ,  , 
1Center for Microbial Ecology and Technology (CMET), Ghent University

В этой статье

Краткое содержание

Гут хост микробных взаимодействий были оценены с использованием новаторский подход, сочетая синтетических устные сообщества, в пробирке желудочно-кишечного пищеварения и модель эпителия тонкой кишки. Мы представляем метод, который может быть адаптирован для оценки клеток вторжение патогенов и многовидового биопленки, или даже для тестирования, живучести составов пробиотик.

Аннотация

Взаимодействие между принимающей и микробиоты давно признали и подробно описано. Рот похож на других разделах желудочно-кишечного тракта, как резидентов микробиоты происходит и предотвращает колонизация внешних бактериями. Действительно более чем 600 видов бактерий находятся в полости рта, и один человек может нести около 100 различных в любое время. Устные бактерии обладают способностью придерживаться различных ниш в устной экосистеме, таким образом став интегрированы в резидентов микробных сообществ и пользу роста и выживания. Однако поток бактерий в кишечнике во время глотания предложил нарушить равновесие кишка микробиоты. В самом деле пероральный P. амёба смещается бактериальный состав в подвздошной микрофлоры. Мы использовали синтетический сообщества как упрощенное представление природной Устные экосистемы, для выяснения выживания и жизнеспособности бактерий полости рта, в условиях имитации желудочно-кишечного транзита. Четырнадцать видов были отобраны, подвергается в vitro слюнных, желудочного и кишечного пищеварения процессы и представлены многосредовой ячеечная модель, содержащих Како-2 и HT29-MTX клетки для имитации эпителии слизистой кишки. Эта модель служил разгадать влияние проглатывания бактерий на клеток, участвующих в энтерогепатической циркуляции. Использование синтетических сообществ позволяет управляемость и воспроизводимость. Таким образом эта методология может быть адаптирована к оценке жизнеспособности возбудителя и последующие изменения связанных воспаление, колонизации потенциала пробиотик смесей, и в конечном счете, потенциальные бактериальных воздействия на пресистемной циркуляции.

Введение

Люди сожительствовать с бактериями, которые присутствуют на столько же, сколько клеток человека1. Следовательно важно из важнейших для получения всестороннего понимания человеческого микрофлора. Полости представляет собой уникальную среду, в том, что оно разделено в несколько меньших обитания, таким образом, содержащего большое разнообразие бактерий и биопленки в этих разных местах. Будучи открытой экосистемы, некоторые виды во рту могут быть временные посетителей. Однако некоторые микроорганизмы колонизировать вскоре после рождения и формы организованной биоплёнки2. Они встречаются на поверхности зубов выше десневая щель, поддесневых щелевая, язык, слизистой поверхности и протезирования зубов и пломб3. Бактерии могут также присутствовать как хлопьев и планктонные клеток в просвет канала зуба, вперемешку с некротическими целлюлозы ткани или приостановлено в жидкой фазы.

Существует активная, непрерывной перекрестных помех между клетки хозяина и резидентов микробиоты4. Бактерии общаться внутри и между видами, и лишь небольшая часть природного колонизаторов может придерживаться тканей, в то время как другие бактерии придают этим основным колонизаторов. Например привязки ячеек между микроорганизмов является ключевым для интеграции вторичных колонизаторов в устной биопленки и сложных сетей взаимодействия микробной клетки4. Около 70% бактерий агрегатов в образец слюны формируются Porphyromonas sp., Streptococcus sp., процессы sp., Veillonella sp. и неизвестными Bacteroidetes. F. nucleatum является промежуточным колонизатором в поддесневой биопленки и агрегатов с конца колонизаторов P. амёба, т. denticola и Tannerella Форсития, которые замешаны в пародонтит5. Кроме того Streptococcus mitis занимает слизистых оболочек и стоматологическая местообитаний, а S. sanguinis и S. gordonii предпочитают колонизировать зубы3. Таким образом, S. sanguinis присутствует в нижних резцов и клыков, а Actinomyces naeslundii были обнаружены в верхнем вестибуларный6.

Кроме того коренные микрофлора играет роль в поддержании здоровья человека2. -Резидентов микробиоты участвует в иммунной системе образования и в предотвращении расширения патогена. Это сопротивление колонизация происходит потому что родной бактерии могут быть лучше адаптированы на прикрепление к поверхности и более эффективным в метаболизирующих доступные питательные вещества для роста. Хотя пробиотических штаммов выживают желудочно-кишечного тракта и остаются активными, сохранения автохтонных бактерий, проглотил из верхнего расположения желудочно-кишечного тракта не был полностью описан. Таким образом мы подвергнуты искусственный сообщества, представитель устные экосистемы, имитируемых желудочно-кишечного транзита условий. Жизнеспособность бактериальных клеток была оценена с помощью многосредовой модели, напоминающие эпителии кишечника. Текущий кишки тренажеры предлагают подходящие воспроизводимость результатов с точки зрения анализа Люминал микробной сообщества7. Однако бактериальной адгезии и хост Микроб взаимодействия отдельно рассматриваются, как сочетание клеточных линий с микробных сообществ является сложной задачей8. Напротив мы представляем основы, которая обеспечивает потенциальные механистическое объяснение событий успешной колонизации, сообщили о кишечнике интерфейс. Действительно эта модель может совместно использоваться с моделью статическое кишки для оценки воздействия микробных сообществ на хост поверхности сигнализации.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. штаммов и культура условия

Примечание: Синтетические устные сообщества была написана штаммы обычно присутствует в устной микрофлора3.

  1. Получить следующие штаммы из американской коллекции типа культуры (ЦУВД): Aggregatibacter actinomycetemcomitans (ATCC 43718), фузобактерии nucleatum (ATCC 10953), Porphyromonas амёба (ATCC 33277), процессы Интермедиа (ATCC 25611), Streptococcus mutans (ATCC 25175), Streptococcus sobrinus (ATCC 33478), Actinomyces naeslundii (ATCC 51655), Стрептококк гордони (ATCC 49818), актиномицеты viscosus (ATCC 15987) и Streptococcus mitis (ATCC 49456).
  2. Приобрести Veillonella parvula от Лейбниц Институт DSMZ-немецкий коллекции микроорганизмов и клеточных культур (DSM 2007), Streptococcus sanguinis из коллекции BCCM/LMG бактерий (LMG 14657) и использование Стрептококк salivarius штамм Туве-R9и Streptococcus oralis10.

2. Разработка многовидовыми сообщества представитель устные микрофлора

Примечание: Создание синтетических сообщества для имитации потенциал адгезии бактерий полости рта в эпителии кишечника в пробирке . Рост бактерий на плиты агара крови, дополнена 5 гемин мкг/мл, 1 мкг/мл менадиона и стерильный 5% дефибринированной крови лошади, как описано в Эрнандес-Санабриа и др. (2017) 11. Вкратце:

  1. Растворите 100 мг гемин в 2 мл 1 M NaOH, добавить 100 мл дистиллированной воды газобетона. Хранить в темных контейнере. Стерилизуйте через фильтр 0,22 мкм, перед добавлением в среде.
  2. Растворите 100 мг менадиона в 20 мл 96% этанола. Стерилизуйте через фильтр 0,22 мкм, перед добавлением в среде.
  3. Подготовка 1 Л крови агар среды (см. Таблицу материалы) согласно инструкциям изготовителя и автоклав. Пусть прохладно перед добавлением крови лошади и дополнений. Перемешать и залить пластины.
  4. Готовят настой изменение сердца мозга (BHI) отвар как сообщалось ранее12. Добавьте 5 мкг/мл гемин и 1 мкг/мл менадиона после автоклавирования.
  5. Отказаться от 9 мл среды в Хангейт трубы и закрыть с резиновой пробкой и алюминиевой крышкой. Очистка труб с N2/CO2 (90% / 10%).
  6. Получить 1 мл анаэробной среды с помощью шприца и поместите его в пробки microcentrifuge 1,5 мл. Выбрать один колоний каждого бактериального вида, Ресуспензируйте в средне- и передачи обратно в анаэробных модифицированных BHI. Проинкубируйте 48 ч при 37 ° C, за исключением S. salivarius, которое должны быть инкубирован за 24 ч.
  7. При необходимости подтвердите чистоты культур перед сборкой синтетических сообщества. Вкратце:
    1. Извлечь ДНК из жидкого культур как Эрнандес-Санабриа и др. (2010) 13 и усилить гена 16S рРНК, используя праймеры 27F (AGAGTTTGATYMTGGCTCAG) и 1492R (TACGGYTACCTTGTTACGACT) и Следующая программа: 5 минут при 95 ° C, 30 циклов за 1 мин., 95 ° c 55 ° C за 1 мин и 72 ° C для 1,5 мин, после чего окончательное расширение шаг 5 мин при 72 ° C.
    2. Очистить продукт PCR с коммерческим комплект (см. Таблицу материалы), следуя инструкциям производителя.
    3. Выполните последовательность реакции очищенной продукции в общем объеме 10 мкл, содержащий 0,5 мкл красителя (см. Таблицу материалы), 3.2 пмоль M13f грунт (CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC), 2.0 мкл 5 x последовательности буфер, и 20 ng шаблона, используя коммерческие последовательности системы с kit (см. Таблицу материалы).
      Примечание: Мы имели эта процедура выполняется коммерчески.
    4. Выполните поиск взрыв на всех последовательностей (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) чтобы определить ближайший известный Таксон и сравнить с последовательностью исходный штамм, используя RDP классификатор онлайн инструмент (http://rdp.cme.msu.edu/) и Сина Выравнивание службы (https://www.arb-silva.de/aligner/).
  8. Мера количества клеток в конце инкубации, используя проточной цитометрии и SYBR зеленый/пропидий йодидом пятно, как описано в Эрнандес-Санабриа и др. (2017) 11. развести культур – 105 клеток мл-1, с использованием модифицированных BHI.
  9. Добавьте 1 mL S. mitis 75 мл анаэробных BHI и температуре до стационарной фазы (6 ч). После, собирайте 0,75 мл каждого разреженных штамм и перемешать в анаэробных условиях.
  10. После всех культур были неоднозначными, взять 1 мл микромира и добавить в 75 мл BHI. Инкубировать синтетических сообщества под 10% CO2, 10% H2, 80% N2 для 48 ч при 37 ° C и 200 об/мин (см. Таблицу материалы).
  11. Измерить плотность клеток как 2.8. перед тем как представить сообщество в ячейки модели. Состав сообщества можно оценить с количественного PCR реального времени, используя праймеры и отжига температура в таблице 1 Сломка и др. (2017) 10. Кроме того, используйте 16S рРНК гена ампликон виртуализации для предоставления информации о первоначальных членов нынешнего13,14. Для либо подтверждающий личность протокол используйте cDNA как шаблон для обозначения бактерий, активно переписывание белков и ДНК как шаблон выявить наличие/отсутствие штаммов.

3. Общая культура клеток практики

Примечание: Для общих аспектов культуры клеток, авторы ссылаются на мастер и Стейси (2007)15. Получения клеточных линий, используемых от Европейской коллекции о подлинности клеточных культур (Како-2 ECACC 86010202 и 12040401 ECACC HT29-MTX-E12, общественного здравоохранения Англии, Великобритания). Реагенты для культуры клеток могут быть приобретены (см. Таблицу материалы), если не указано иное.

  1. Техническое обслуживание и пассированый Како-2 и HT29-MTX клеточных линий
    Примечание: Како-2 и HT29-MTX клетки обычно выращивается в 25 см2 культуры ткани флаконы содержащие дополнениями DMEM среднего (Таблица 1). Клетки являются trypsinized по достижении 60-70% слияния.
    1. Удалите средство культуры клеток из колбы. Мыть дважды с 5 мл PBS без Ca++/Mg++.
    2. Добавьте 2 мл 0,5 мг/Л раствора трипсина и 0,22 г/Л этилена диамин tetraacetic кислоты (ЭДТА). Распределить раствор трипсина, нежно перемещая колбу. Удаление 1,5 мл раствора трипсина и инкубировать настой при 37 ° C за 10 мин.
    3. Проверить под микроскопом, если клетки отсоединяются от поверхности колбы. Инкубируйте дополнительные 5 мин, при необходимости.
    4. Добавьте 5 мл дополнениями клетки культуры средств массовой информации в колбу для инактивации трипсина. Накапайте вверх и вниз для получения однородной одноклеточного подвеска.
    5. Сразу же возьмите 50 мкл аликвота суспензию клеток и смешать с стерильных Трипановый синий 0,4% раствор в пропорции 1:1 (v/v) для клеток Caco-2 или 1:5 v/v для HT29-MTX. Смесь, закупорить и нагрузки в Счетной палате (см. Таблицу материалы).
    6. Количество жизнеспособных клеток (белая светлые клетки) под микроскопом (см. инструкции производителя).
    7. Семян в новой колбу на плотности 4 x 105 клеток/см2 и 1 х 104 клетки/см2, Како-2 и HT29-MTX, соответственно.
      Примечание: (1) ЦАС-2 клетки дифференцировать и образуют плотные соединения, после достижения confluency. Чрезвычайно важно избежать более confluency до trypsinization. Разрастание клеток в колбе может вызвать сбой в ячейке отряд после trypsinization или ячейки сгустки. (2) HT29-MTX клетки производит слизь клеток с высокой метаболической активности16. Эти функции может вызвать быстрое подкисление СМИ культуры клеток, особенно если клетки находятся в высокой плотности. Буфер HEPES могут быть добавлены в среде культуры клеток (Таблица 1) для поддержания рН между 7 и 7.2. Если рН капель, носитель может быть обменялись когда confluency находится менее чем на 50%. Однако если confluency > 50%, культура клетки должны быть разделены.

4. Ассамблея многосредовой ячеечная модель, имитирующие интерфейс хост микробов кишечника

Примечание: Полное сотрудничество культуры в двойной камеры скважины (диаметр 24 мм, поры размер 0,4 мкм; см. Таблицу материалы).

  1. Добавьте 1,5 мл полного клетки культуры средств массовой информации в апикальной отсека и 2 мл в базальной. Предварительно Инкубируйте на 20 – 30 минут, чтобы получить равномерное распределение суспензию клеток при посеве.
  2. Trypsinize культура клетки Caco-2 и HT29-MTX, как описано в разделе 3. Trypsinization должна быть точно процедура для достижения однородной распределения обоих клеточных линий, в одну ячейку подвеска, без сгустков.
  3. Количество жизнеспособных клеток, как описано в 3.1.8.
  4. Отрегулируйте плотность клеток до 6,5 x 104 клетки/см2 в соотношении 90/10 клеток Caco-2/HT29-MTX.
  5. Гомогенизации суспензии клеток и добавьте соответствующий объем клеток Caco-2 и HT29-MTX предварительно заполненные стерильный контейнер с дополнениями клетки культуры средств массовой информации. Удаление предварительно инкубирован СМИ из в апикальной части камеры путем аспирации.
  6. Аккуратно перемешать суспензию клеток, дозирование и передачи 1,5 мл апикальной отсека камеры вставок. Высева процедура требует постоянной гомогенизации суспензии клеток, как клетки, как правило, отложениях. В зависимости от опыта пользователя и скорость работы после подачи 1 – 3 скважины должны быть смешаны суспензию клеток.
  7. Перемещение плит осторожно взад и вперед и затем право слева направо (5 – 10 раз) получить даже распространение клеток в колодец. Трансфер в инкубаторе и повторите движение плит.
  8. Поддерживать сотрудничество культуры клеток Caco-2/HT29-MTX на 15 дней, освежающий апикальной и базальной отсеков каждые 2 дня с дополнениями DMEM. После этого времени средства массовой информации культуры клеток можно изменить на дополнениями DMEM без антибиотика/противогрибковое решения.
  9. Поддерживать систему до 20-21 дней после посева, обновляя носитель каждые 2 дня.
  10. Мера целостности эпителиальных барьер перед началом анализа, используя систему электрического сопротивления (см. таблицу материалы), следуя инструкциям производителя.
    1. Убедитесь, что оборудование ТЕЕР полностью заряжен (> 24 h) перед началом измерения.
    2. Отсоедините ТЕЕР оборудование от источника питания и крышка с мешком пластиковых автоклава. Сделайте отверстие в мешок, чтобы ввести электрода и подключите к порту ввода на метр. Спрей с 70% этанола/воды (v/v) до введения ТЕЕР оборудование в кабинет потока.
    3. Для дезинфекции электрода, погружают электрод советы в 70% (v/v) этанола/воды раствор для 15 мин разрешить воздух сухой за 15 с. промойте электрод в подогретым клетки культуры средств массовой информации.
    4. Возьмите клетки из инкубатора и позволяют клеткам прийти к комнатной температуры внутри шкафа потока.
    5. Убедитесь, что прибор отключен от зарядного устройства. Установите переключатель режимов в ом и поверните выключатель питания на.
    6. Измерьте сопротивление клетки, погружая электрод с короче кончиком в insert и больше кончик из колодца. Держите электрод под углом в 90° вставить пластину.

5. бактериальные выживания в Vitro условий желудочно-кишечного транзита

Примечание: Подготовьте имитируемых пищеварение жидкости после протокола Minekus и др. (2014) 17, с изменениями, описанные ниже. Подготовьте все разведения с ультрачистая вода. Фильтр стерилизовать всех решений через фильтр 0,22 мкм и выполнить процедуру пищеварение в стерильных условиях.

  1. Устные пищеварения:
    1. Место 3 мл бактериальной сообщества в 50 мл стерильной пробирке, смешать с 3 мл имитируемых слюной жидкости (ФСО), содержащую (в ммоль L-1): KCl, 15.1; KH2PO4, 3.7; NaHCO3, 6.8; MgCl2(H2O)6, 0.5, (NH4) CO3, 0,06; HCl, 1.1; CaCl2(H2O)2, 0,75. Добавьте 75 ед/мл α-амилазы из слюны человека тип IX-A и 2 г/Л муцина из свиного желудка типа II в ФСО.
    2. Инкубируйте смесь для 2 мин, при 37 ° C и 100 об/мин. Соберите образец 2 мл для экстракции ДНК и потока цитометрии количественной оценки (S1).
  2. Желудочного пищеварения:
    1. Добавить 4 мл имитируемых желудка жидкости (SGF), содержащую (в ммоль L-1): KCl, 6,9; KH2PO4, 0,9; NaHCO3, 25; NaCl, 47,2; MgCl2(H2O)6, 0.1, (NH4) CO3, 0,5; HCl, 15,6; CaCl2(H2O)2, 0,075. Кроме того SGF содержит 2 г/Л муцина от свиного желудка типа II.
    2. Измерение pH и приспособиться к рН 3 с 1 M HCl, если это необходимо. Инкубируйте при 37 ° C и 100 об/мин. Соберите образец 2 мл (S2).
  3. Пищеварение в тонком кишечнике:
    1. Добавить 4 мл имитируемых кишечной жидкости (SIF), содержащую (в ммоль L-1): KCl, 6.8; KH2PO4, 0,8; NaHCO3, 85; NaCl, 38,4; MgCl2(H2O)6, 0.33; HCl, 8.4; CaCl2(H2O)2, 0,3; на трубу пищеварение.
    2. Приспособиться к рН 7 с 1 M NaOH, если это необходимо. Инкубируйте при 37 ° C и 100 об/мин. Соберите образец 2 мл (S3).

6. бактериальной колонизации способности в Vitro условий желудочно-кишечного транзита

  1. Центрифуга 2 мл тонкой кишки пищеварения, за 10 мин при 2650 x g.
  2. Удалить супернатант и смешать бактериальных гранулы с 5 мл дополнениями DMEM без антибиотиков и противогрибковое.
  3. Выведение и количественно нетронутыми/поврежденных клеток с помощью проточный цитометр (см. Таблицу материалы), как описано в Эрнандес-Санабриа и др. (2017) 11.
  4. Отрегулируйте плотность клеток до 105 жизнеспособных клеток/мл разбавлением в дополнение DMEM без антибиотиков и противогрибковое.
  5. Удалите средство апикальной transwell системы и добавить 1,5 мл бактериальной подвески. Совместное культуры системы за 2 ч в условиях культуры общей ячейки (37 ° C, влажность 95%, 5% CO2).
    Примечание: Этот срок может быть продлен до 48 часов, в зависимости от экспериментального протокола. Совместное культуры может быть сохранен в другой инкубатор чем используется для обслуживания обычной клетки, чтобы избежать загрязнения.
  6. Измерьте ТЕЕР значения после инкубации, для оценки целостности эпителиальных барьер, как описано в 4.11.
  7. После завершения время инкубации, удалите апикальной СМИ и собирать 0,5 мл для дальнейшего анализа (S4). Подвыборки средства массовой информации могут использоваться для оценки жизнеспособности клеток пробирного Лактатдегидрогеназа (LDH) (см. Таблицу материалы), следуя инструкциям производителя.
  8. Добавьте 0,5 мл 10 мм N-ацетилцистеина в HBSS (NAC-буфер) чтобы солюбилизировать последнего слизи, производимые HT29 MTX и восстановить придерживался бактерий. Инкубировать пластин при 37 ° C за 1 ч, под агитации (135/мин, смотрите Таблицу материалы).
  9. Восстановить NAC-HBSS в пробки microcentrifuge (S5) и мыть дважды клетки с 1 мл DPBS.
  10. Добавить 0,5 мл 0,5% Тритон X-100 (w/v) поверх монослои, срывать клетки, дозирование, восстановить жидкости и вихревые за 1 мин скорость важна избежать повреждения бактериальной клетки с моющим средством.
  11. Центрифуга клетки для 5 мин при 2650 x gи отдельные супернатант (S6) и Пелле (S7).

7. выборочный анализ

Примечание: Анализ собранных образцов (S1-S7) для оценки жизнеспособности бактериальных и адгезии, потенциал для кишечных клетки, после имитации желудочно-кишечного пищеварения.

  1. Бактериальные жизнеспособности: передать образцы S1-S5 дважды через 0.45 мкм и количественно бактериальные клетки, с помощью окрашивания жить/мертвых клеток и проточная цитометрия, как указано в шаге 2.811.
  2. Адгезия потенциал: подготовить серийных разведений (-1 -8) для S1-S6 и полоса 10 мкл крови агар и изменение BHI пластины. Инкубируйте при 37 ° C в анаэробных условиях для 24-48 ч. плита такой же объем неразбавленном S7.
    1. Таксономическая идентификация придерживался бактерий:
      1. Выбрать отдельные колонии с петлей культуры и Ресуспензируйте каждый по 10 мкл воды, свободной от нуклеиназы. Собирать 4 мкл этой подвески и использовать его как шаблон для PCR амплификация гена 16S рРНК, используя праймеры и условий, описанных в 2.7.1.
      2. Выполнение последовательности после протокола в 2.7.3 и проверки последовательности, используя процедуры, включенные в 2.7.4.
  3. Делать дальше вниз по течению анализ общей экстракции ДНК, количественной оценке и/или 16S рРНК Ампликон ПЦР секвенирования, извлечение RNA и транскриптомики профилирования по желанию.
    Примечание: Поток цитометрии количественная оценка была проведена сразу же после выборки. Как элемент управления для permeabilized мембраны клеток использовался образец подвергается 70 ° C на 3 мин. Фоновый шум оценивалась путем измерения с проточной цитометрии пищеварение жидкости или образцы, полученные из клеток культуры модели без бактерий. Каждый образец измерялась в трех экземплярах.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Этот протокол приводит к генерации модели, пригодной для выяснения выживания и жизнеспособности бактерий полости рта, в условиях имитации желудочно-кишечного транзита. Количество нетронутым клеток от отдельных штаммов составляет приблизительно 108 клеток мл-1 предварительное создание синтетических сообщества, хотя многовидовыми микрокосм, содержащихся выше 90% жизнеспособных клеток во время создания сообщества ( Рисунок 1A

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Устные микрофлора является ключевым элементом в здоровье человека, как недавно сообщили несколько авторов20,21. Предыдущие результаты показывают, что проглатывание слюны, содержащих большие нагрузки бактерий может повлиять на микробные экосистемы тонкой кишки, который является одним из основных мест для грунтования иммунную. Сочетание статического верхняя желудочно-кишечного пищеварения модель с хост-интерфейс, представленный клеток кишечного эпителия и секреции ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать

Благодарности

Авторы с благодарностью признаем финансовую поддержку от Фонда исследований Фландрии Marta Calatayud Арройо (докторантура стипендий FWO-12N2815N). Эмма Эрнандес-Санабриа – Докторантура научный поддерживаемых Фландрии инноваций и предпринимательства (Agentschap voor Innovatie двери Wetenschap en Technologie, ВВТ).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
STRAINS
Aggregatibacter actinomycetemcomitans American Type Culture CollectionATCC 43718
Fusobacterium nucleatum American Type Culture CollectionATCC 10953
Porphyromonas gingivalis American Type Culture КоллекцияATCC 33277
Prevotella intermedia American Type Culture CollectionATCC 25611
Streptococcus mutans American Type Culture CollectionATCC 25175
Streptococcus sobrinus American Type Culture CollectionATCC 33478
Actinomyces viscosus American Type Culture CollectionATCC 15987
Streptococcus salivarius  TOVE-R
Streptococcus mitis American Type Culture CollectionATCC 49456
Streptococcus sanguinis BCCM/LMG Bacteria CollectionLMG 14657
Veillonella parvula Leibniz Institute DSMZ-Немецкая коллекция микроорганизмов и клеточных культурDSM 2007
Streptococcus gordonii American Type Culture CollectionATCC 49818
CELL LINES
Caco-2 cellsЕвропейская коллекция аутентифицированных клеточных культур86010202
HT29-MTXЕвропейская коллекция аутентифицированных клеточных культур12040401
<СИЛЬНО>РЕАГЕНТЫ И РАСХОДНЫЕ МАТЕРИАЛЫ
Мозговая инфузия сердца (BHI) бульонОксоидCM1135
Кровяной агар 2ОксоидCM0055Кровяной агар средний
МенадионСигмаM9429
ХеминСигмаH9039
5% стерильная дефибринированная лошадиная кровьE& O LaboratoriesLtd,P030
InnuPREP PCRpure KitAnalytik Jena845-KS-5010250Набор для очистки ПЦР
BigDye Applied Biosystems4337454Краситель для секвенирования
ABI Prism BigDye Terminator v3.1 набор для секвенированияцикла Applied Biosystems4337456
SYBR  Green IInvitrogenS7585
Propidium IodideInvitrogenP1304MP
T25 колбы для культуры без покрытия, обработанные клеточными культурами, вентилируемые, стерильныеVWR734-2311
Trypsin-EDTA растворSigma-AldrichT3924-100ML
Trypan Blue раствор
0,4%, жидкий, стерильно отфильтрованный		Sigma-AldrichT8154 
PBSGibco14190250
среды для клеточных культур DMEM, с технологиями GlutaMAX и PyruvateLife31966-047
Corning Transwell полиэфирные мембранные клеточные культуры вставляетSigma-AldrichCLS3450-24EA
Муцин из свиного желудка типа II   Sigma-AldrichM2378
Инактивированная фетальная сыворотка крупного рогатого скотаGreiner Bio One758093
антибиотик-антимикотик (100X)Gibco15240062
Triton X 100 для молекулярной биологииSigma-AldrichT8787 
DPBS без кальция, магнияGibco14190-250
Pierce LDH Cytotoxicity Anathing KitThermo Fisher Scientific88953
Corning HTS Transwell-24 лунка, размер пор 0,4 &; mCorning Costar Corp3450
нуклеазыServa Electrophoresis28539010
EQUIPMENT
Neubauer улучшенная счетная камераCarl RothT729.1
BD Accuri C6 Проточный цитометрBD Biosciences653118
гомогенизаторPowerLyzer 24MoBio13155
T100 ТермоамплификаторBioRad186-1096
Система смываCustommade-InnOva
4080 ШейкерNew Brunswick Scientific8261-30-1007Шейкер для 2.10
Memmert CO2 инкубаторMemmert GmbH & Co.ICO150med
Millicell ERS (Система электрического сопротивления)EMD Millipore, Merck KGaAMERS00002
Millipore Milli-Q академическая, сверхчистая водная системаMillipore, Merck KGaA-Shaker
(ROCKER 3D basic)IKA4000000Шейкер для 6.10
Электрофорез воды без инкубатора

Ссылки

  1. Sender, R., Fuchs, S., Milo, R. Revised estimates for the number of human and bacteria cells in the body. PLoS Biology. 14, e1002533(2016).
  2. Kelly, D., King, T., Aminov, R. Importance of microbial colonization of the gut in early life to the development of immunity. Mutation Research-Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. , 58-69 (2007).
  3. Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. Defining the normal bacterial flora of the oral cavity. Journal of Clinical Microbiology. 43, 5721-5732 (2005).
  4. Marsh, P. D., Head, D. A., Devine, D. A. Dental plaque as a biofilm and a microbial community-Implications for treatment. Journal of Oral Biosciences. 57, 185-191 (2015).
  5. Socransky, S. S., Haffajee, A. D., Cugini, M. A., Smith, C., Kent, R. L. Microbial complexes in subgingival plaque. Journal of Clinical Periodontology. 25, 134-144 (1998).
  6. Haffajee, A. D., et al. Subgingival microbiota in healthy, well-maintained elder and periodontitis subjects. Journal of Clinical Periodontology. 25, 346-353 (1998).
  7. Venema, K. Microbial metabolites produced by the colonic microbiota as drivers for immunomodulation in the host. The FASEB Journal. 27, (2013).
  8. Marzorati, M., et al. The HMI (TM) module: A new tool to study the Host-Microbiota Interaction in the human gastrointestinal tract in vitro. BMC Microbiology. 14, 133(2014).
  9. Tanzer, J. M., Kurasz, A. B., Clive, J. Competitive displacement of mutans streptococci and inhibition of tooth-decay by Streptococcus-Salivarius Tove-R. Infection and Immunity. 48, 44-50 (1985).
  10. Slomka, V., et al. Nutritional stimulation of commensal oral bacteria suppresses pathogens: the prebiotic concept. Journal of Clinical Periodontology. 44, 344-352 (2017).
  11. Hernandez-Sanabria, E., et al. In vitro increased respiratory activity of selected oral bacteria may explain competitive and collaborative interactions in the oral microbiome. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 235(2017).
  12. Alvarez, G., Gonzalez, M., Isabal, S., Blanc, V., Leon, R. Method to quantify live and dead cells in multi-species oral biofilm by real-time PCR with propidium monoazide. AMB Express. 3, (2013).
  13. Ehsani, E., et al. Initial evenness determines diversity and cell density dynamics in synthetic microbial ecosystems. Scientific Reports. 8, 340(2018).
  14. Hernandez-Sanabria, E., et al. Correlation of particular bacterial PCR-denaturing gradient gel electrophoresis patterns with bovine ruminal fermentation parameters and feed efficiency traits. Applied and Environmental Microbiology. 76, 6338-6350 (2010).
  15. Masters, J. R., Stacey, G. N. Changing medium and passaging cell lines. Nature Protocols. 2, 2276-2284 (2007).
  16. Calatayud, M., Velez, D., Devesa, V. Metabolism of inorganic arsenic in intestinal epithelial cell lines. Chemical Research in Toxicology. 25, 2402-2411 (2012).
  17. Minekus, M., et al. A standardised static in vitro digestion method suitable for food - an international consensus. Food & Function. 5, 1113-1124 (2014).
  18. Berney, M., Hammes, F., Bosshard, F., Weilenmann, H. U., Egli, T. Assessment and interpretation of bacterial viability by using the LIVE/DEAD BacLight kit in combination with flow cytometry. Applied and Environmental Microbiology. 73, 3283-3290 (2007).
  19. Props, R., Monsieurs, P., Mysara, M., Clement, L., Boon, N. Measuring the biodiversity of microbial communities by flow cytometry. Methods in Ecology and Evolution. 7, 1376-1385 (2016).
  20. Yamashita, Y., Takeshita, T. The oral microbiome and human health. Journal of Oral Science. 59, 201-206 (2017).
  21. Wade, W. G. The oral microbiome in health and disease. Pharmacological Research. 69, 137-143 (2013).
  22. Yu, M., et al. A resource for cell line authentication, annotation and quality control. Nature. 520, 307(2015).
  23. Pelaseyed, T., et al. The mucus and mucins of the goblet cells and enterocytes provide the first defense line of the gastrointestinal tract and interact with the immune system. Immunological Reviews. 260, 8-20 (2014).
  24. Bengoa, A. A., et al. Simulated gastrointestinal conditions increase adhesion ability of Lactobacillus paracasei strains isolated from kefir to Caco-2 cells and mucin. Food Research International. 103, 462-467 (2018).
  25. Kleiveland, C. R., et al. The Impact of Food Bioactives on Health: in vitro and ex vivo models. Verhoeckx, K., et al. , Springer International Publishing. 197-205 (2015).
  26. Laparra, J. M., Sanz, Y. Comparison of in vitro models to study bacterial adhesion to the intestinal epithelium. Letters in Applied Microbiology. 49, 695-701 (2009).
  27. Gagnon, M., Berner, A. Z., Chervet, N., Chassard, C., Lacroix, C. Comparison of the Caco-2, HT-29 and the mucus-secreting HT29-MTX intestinal cell models to investigate Salmonella adhesion and invasion. Journal of Microbiological Methods. 94, 274-279 (2013).
  28. Großkopf, T., Soyer, O. S. Synthetic microbial communities. Current Opinion in Microbiology. 18, 72-77 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

in vitroCaco 2 HT29 MTX
Оценка жизнеспособности синтетических бактерий консорциума на интерфейсе в Vitro хост микробов кишечника
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.