Методическая статья

Подход, основанный на капельки Microfluidic и микросферы ПЦР-амплификации для одноцепочечной ДНК ампликонов

DOI:

10.3791/57703

⸱

14 ноября 2018 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1College of Natural Sciences, Chungbuk National University, 2Department of Biomedical Engineering, Inje University, 3Institute of Digital Anti-Aging Healthcare, Inje University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа предоставляет метод для изготовления на основе капелька microfluidic платформ и применение полиакриламида микросферы для микросфер ПЦР-амплификации. Микросфера PCR метод делает возможным получить одноцепочечной ДНК ампликонов без разделения двуцепочечной ДНК.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

На основе капелька микрофлюидика возможность надежного производства однородных микросфер в канале microfluidic, предоставляя контролируемый размер и морфология полученные микросфер. Микросфера Сополимеризованная с acrydite ДНК-зонд был успешно сфабрикованы. Различные методы, такие как асимметричное PCR, при exonuclease пищеварение и изоляции на стрептавидина покрытием магнитные бусы может использоваться для синтеза ДНК одноцепочечной (ssDNA). Однако эти методы не могут эффективно использовать большие объемы высокоочищенных ssDNA. Здесь мы описываем микросферы ПЦР протокола, детализируя как ssDNA можно эффективно усиливается и отделены от dsDNA просто дозирование из трубки реакции PCR. Амплификация ssDNA может применяться как потенциальные реагенты для microarray ДНК и ДНК-SELEX (систематической эволюции лигандов на экспоненциальное обогащения) процессов.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Одноцепочечной ДНК (ssDNA) широко рассматривается как элемент молекулярного распознавания (MRE) из-за его внутренние свойства для ДНК-ДНК гибридизации1,2. Разработка ssDNA синтетических систем может привести к биологических приложений, таких как ДНК microarrays3, oligotherapeutics, диагностика и комплексной молекулярной зондирования на основе взаимодополняющих взаимодействия4,5.

На сегодняшний день, Микрометр шкала полимерные частицы были успешно продемонстрированы используя microfluidic приборы. Несколько методов microfluidic доказали быть мощным для производства весьма однородной микросфер на непрерывный поток в микроканальные среды6,7.

В исследовании Lee et al. 8, на основе капелька microfluidic платформа для microfluidic синтеза copolymerizable oligo микросферы и ssDNA амплификации было сообщено. Microfluidic платформа состоит из двух слоев PDMS (полидиметилсилоксан): Верхняя часть с microfluidic канала сети для генерации микросфер и дно плоской части. Они состоят из трех видов PDMS аэрогидродинамических каналов: 1) поток канал для поколения капелька, 2) серпантином канал для смешивания двух решений и 3) последовательных полимеризации канал для микросфер затвердевания. После того, как в один канал аэрогидродинамических PDMS вводятся две Несмешивающиеся потоков, потоков может быть принужден через узкие отверстия структуру. Потока поведения, таких как канал геометрии, скорость потока и вязкость влияет на размер и морфология микросфер. Таким образом основной поток жидкости можно подразделить микромасштабной monospheres9,10.

Здесь подробные микросферы ПЦР протокола предоставляется для амплификации ssDNA. Во-первых описан процесс проектирования устройств на базе капелька microfluidic. Затем объясняется способ, в котором полиакриламида микросферы можно функционализированных с случайных ДНК шаблон на взаимодополняющей основе. Наконец показана микросферы ПЦР протокола для усиления ssDNA.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Изготовление PDMS Microfluidic платформа

  1. Подготовка 20 мл жидких PDMS форполимера путем смешивания базового полимера и катализатором в том соотношении 10:1. Залейте 10 мл жидкости PDMS на подготовленной прессформы Су-8 на кремниевой пластины для верхней части microfluidic сети. Для нижней равнинной части Налейте такой же объем жидких PDMS на кремниевой пластины без структуры формы.
    Примечание: Сеть microfluidic разработан в программе CAD и затем преобразуется в фотошаблонов для того, чтобы изготовить мастер, с помощью процесса типичный фотолитографии (см. Дополнительные цифры). Этот мастер состоит из негативного фоторезиста Су-8 плесень на кремниевых пластин11.
  2. Место два кремниевых пластин с покрытием с жидким PDMS форполимера на горячей пластине и лечения при 75 ° C за 30 мин.
    1. Вручную слезает вылечить PDMS слой от плесени Су-8. Совместите диаметром 1,5 мм круглые отверстия перфорации инструмент для нефтяной порт в реплицированной microfluidic сети для интерфейсов каналов потока микрон шкала с образцами жидкости макрос. Выбивать через отверстие вручную.
    2. Повторите это штамповка процесс три раза для формирования двух решений и выход порта.
  3. Выполните гидрофильные обработка поверхности на верхней и нижней PDMS слои с помощью ручных Корона Протравливатель12 на несколько секунд на сэмпл.
    1. Стек две плазмы лечение PDMS слои и тепла на 90 ° C за 30 минут с помощью плита для процесса склеивания PDMS-PDMS. Снабжения водой под давлением, с использованием шприцевый насос в три входе портов для Структурное склеивание и утечки тестирование готовых устройства.

2. производство полиакриламида Oligo микросферы

  1. Подготовьте шарик смесь, подробно изложены в таблице 1.
  2. Вихрь и кратко центрифуги acrydite Стандартный ssDNA помечены зонд (Ap, 100 мкм) и acrylamide:bis (19:1) раствор.
  3. Приготовляют раствор я путем смешивания 25 мкл 40% акриламида бис решение, 10 мкл ssDNA (acrydite зонд), 10 мкл буфера 5 x TBE (1,1 М трис; 25 мм ЭДТА, Борат 900 мм) и 5 мкл воды. Готовят раствор II с 50 мкл Персульфат аммония 20%.
  4. Подготовить два шприцы индивидуально заполнены раствором решение II и я и смонтировать их на насос, чтобы внедрить решение потоки в microfluidic платформа. Подготовить минерального масла, смешанного с 0,4% TEMED для поверхности затвердевание микросфер.
    Примечание: TEMED известен как стабилизатор свободных радикалов. Свободные радикалы могут ускорить скорость образования полимера с Персульфат аммония (APS) для того, чтобы стимулировать полимеризации акриламида.
  5. Заполните стеклянной бутылке с 4 мл минерального масла для создания постоянного потока.
  6. Вставьте две трубы для двух портов в Крышка стеклянная бутылка как microfluidic водохранилище: пневматические порт для применения сжатого воздуха в стеклянной бутылке от воздушный компрессор и жидкости порта для подачи под давлением масла микро канала сети из стеклянной бутылке. Соедините трубы между стеклянной бутылки и нефтяной порт в microfluidic устройства.
    1. Подключите трубы к портам два решения в microfluidic устройство для того чтобы поставить два решения от шприца насосов. Вставка трубы выход порта для передачи сгенерированный микросфер в стакан.
  7. Установите скорость потока насоса шприца до 0,4 - 0,7 мл/ч. Отрегулируйте давление сжатого воздуха компрессора с помощью регулятора (82-116 кПа). Задайте скорость вращения (500 об/мин) Магнитная мешалка бар в стеклянный стакан на горячей плите. Управлять шприцевый насос и подачи сжатого воздуха, порожденных внешнего компрессора в стеклянной бутылке с помощью элемента управления вкл/выкл электромагнитный клапан13.
  8. Наблюдать за формирование микросфер в поток упором геометрии и затвердевания сгенерированный микросфер в стеклянный стакан с цифровой микроскоп.
    Примечание: Размер и производство скорость Микросфера зависит от расхода растворов и давление потока минерального масла (таблица 2).

3. выполнение полиакриламида Oligo микросферы графов

  1. Горяева количественной оценки взять небольшое количество (около 100 мкл) водный раствор полиакриламида oligo микросферы и место на Горяева стекла и аккуратно заполнить Микросфера подвеска хорошо Счетной палаты.
    Примечание: Для получения более подробной информации, смотрите http://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer.
  2. Использование микроскопа и ручной подсчет счетчик для подсчета микросфер в одном наборе 16 квадратов. Затем переместите Горяева к следующему набору камеры и вести подсчет до тех пор, пока все четыре свода 16 углы отсчитываются.
  3. Определить средний микросфер и рассчитать количество микросфер в оригинальные подвески из бисера.
  4. Передавать 100 мкл микросфер пробки microcentrifuge 1,5 мл. Удалите супернатант через мягкое центрифугирование (400 x g) и закупорить.

4. выполнение гибридизации ДНК на поверхности полиакриламида Oligomicrosphere

Примечание: Идентичные ДНК зонд с 5'-NH2-группа вместо 5'-acrytide модификации добавляется в решение, я и испытаны для Ap содержащих микросферы параллельно. ДНК гибридизации результаты показаны на рисунке 2. Cy3-меченых взаимодополняющих олигонуклеотида зонды (Кап) решение должно находиться в темной комнате.

  1. Ресуспензируйте Cy3-колпачок с использованием 100 мкл буфера 1xTE (TE буфера: 10 мм трис и 1μM ЭДТА, рН 8,0) для достижения конечной концентрации 100 мкм. Например Ресуспензируйте 1 пмоль Кап в 100 мл TE буфера и передачи microcentrifuge трубки покрыта алюминиевой фольгой.
    Примечание: Для стренги последовательностей, см. таблицу 3.
  2. Добавьте 100 мкм Cy3-Кап в стерильных 1,5 мл microcentrifuge трубка, содержащая Ap Сополимеризованная микросфер.
  3. Нажмите трубке несколько раз перемешать и инкубировать в темноте за 1 ч при комнатной температуре.
  4. Отменить супернатант и удалить остаточные буфера через закупорить.
  5. Промойте три раза с 500 мкл буфера TE.
  6. Ресуспензируйте микросферы, осторожно нажав пробки microcentrifuge. Затем повторите шаг 4.4.
  7. Место микросфер на стеклянное скольжение (75 x 50 мм) и накрыть алюминиевой фольгой до изображений.

5. Асимметричное PCR для усиления ssDNA

  1. Подготовьте асимметричной смеси реагентов ПЦР для усиления ssDNA для анализа. Оттепель реагентов в таблице 4 на льду. Не держите энзима полимеразы Taq (50 U/мкл) на льду, но скорее хранить его при-20 ° C до тех пор, пока требуется.
  2. Аккуратно водоворот все реагенты и затем кратко центрифуга трубы на 10000 x g 10 s.
  3. Объединить все реагенты, как описано в Таблица 4.
  4. Поместите образцы в Термоциклер и начать Асимметричное PCR при следующих условиях: 25 циклов (95 ° C за 30 s, 52 ° C за 30 s и 72 ° C для 30 s), 85 ° C за 5 мин, удерживайте при 4 ° C.

6. микросферы-ПЦР для усиления ssDNA

Примечание: Этот раздел описывает протокол для усиления ssDNA в пробке реакции PCR. Микросфера-ПЦР-реакции были исполнены в 50 мкл реакции тома. В таблице 5перечислены подробные последовательностей, используемых для того чтобы усилить ssDNA. В этом случае Ap на поверхности микросферы можно отжига для случайных ДНК шаблоны на взаимодополняющей основе. Это очень важный шаг для производства дополнительных нитей ДНК (антисмысловых стренге дна, рис. 3). Продлен ДНК используется в качестве шаблона для микросфер ПЦР-амплификации.

  1. Подготовка смеси реагентов микросферы PCR. Оттепель реагентов в таблице 6 на льду; Однако не держите энзима полимеразы Taq на льду. Храните его при 20 ° C до тех пор, пока требуется.
  2. Аккуратно водоворот все реагенты и затем кратко центрифуга трубы на 10000 x g 10 s.
  3. Получите примерно ~ 25 микросферы через микроскопические подсчета.
    Примечание: Количество микросфер в одном реакция трубки рассчитываются с использованием световой микроскоп с увеличением 40 X. Около ~ 25 микросферы применяются для микросфер ПЦР-амплификации. Более подробная информация содержится в шаге 3.
  4. Объединить все реагенты, как описано в Таблица 6.
  5. Поместите образцы в Термоциклер и начать Асимметричное PCR при следующих условиях: 25 циклов (95 ° C за 30 s, 52 ° C за 30 s и 72 ° C для 30 s), 85 ° C за 5 мин, удерживайте при 4 ° C.
  6. Следующие амплификации, добавить 8 мкл 6 x загрузки буфера и загрузить 15 мкл каждого образца в 2% агарозном геле. Затем выполните электрофорез на 100 V 35 минут в 1 x TAE (Tris ацетат ЭДТА, 40 мм ацетата Tris, 1 мм ЭДТА, рН 8,2) буфера.

7. confocal микроскопии приобретение

Примечание: Под конфокального микроскопа отражаются результаты микросферы ДНК гибридизации зонда. Анализ изображений осуществляется с помощью ImageJ.

  1. Исправьте гибридизированные микросфер на этап микроскопа в держатель.
  2. Выберите лазер (гелий/неоновый лазер, 543 Нм линия) и включите его в лазерной управления.
  3. Выберите объектива микроскопа управления.
  4. Выберите требуемый фильтр для Cy3 и канала в конфигурации управления.
  5. Запустите эксперимент и наблюдать за образец. Параметры для confocal микроскопа резюмируются в таблице 7.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Готовых полимерных на основе капелька microfluidic платформа состоит из двух слоев PDMS (рис. 1a). Три вида microfluidic канала сети используются для генерации микросферы: 1) потока упором геометрии, как показано на рис. 1b, 2) серпантином канал для смешивания решения I и решения II и 3) полимеризации канал для микросфер затвердевания. Высота всех каналов было 60 мкм. Длина канала для смешивания и полимеризации были 74.35 мм и 94...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Загрязнители dsDNA являются серьезной проблемой в ssDNA амплификации. Он по-прежнему трудно свести к минимуму dsDNA амплификации в обычных Асимметричное PCR амплификация15. Кроме того хотя технические усовершенствования для генерации ssDNA позволили нам увеличить эффективность образца пропускной способности, ssDNA изоляция по-прежнему проблематичным из-за ее высокой стоимости и неполной очистки урожайности.

Асимметричное PCR является одним из самых сложных методов, испо...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют никаких конфликтов интересов раскрыть.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование поддерживается проекта под названием «Совместная программа исследований для сельскохозяйственной науки и технологического развития (проект № PJ0011642) «финансируется администрацией сельского развития, Республика Корея. Это исследование было также частично при поддержке гранта (СР 2017R1A2B4012253) основной программы исследований науки через Национальный фонд исследований (NRF) финансируется министерством науки, ИКТ и будущего планирования, Республика Корея. Это исследование было также поддержано Грант (N0000717) программы образования для творческих и промышленные конвергенции, финансируемого министерством торговли, промышленности и энергетики, Республика Корея.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
жидкий полидиметилсилоксан, PDMSDow Corning Inc.Sylgard 184Компоненты чипа
40% Акриламид:бис раствор (19:1)Bio-rad1610140Компоненты сополимеризуемого олиго-микросферного
персульфата аммония, APSSigma AldrichA3678Отвердитель акриламида:bis раствор
N,N,N′,N′-тетраметилэтилендиамин, TEMEDSigma AldrichT9281Катализатор персульфата аммония
Минеральное маслоSigma AldrichM5904Таблица 1. Решение III. Компонент микросферных реагентов
Cy3 меченых комплементарных олигонуклеотидных зондовBioneerсинтезированТаблица 3. Информация о последовательности 
ssDNA акрилитный меченый зондBioneerсинтезированТаблица 1. Раствор I. Компонент микросферных реагентов
TrisBiosesang  T1016Компоненты TE буфера, pH буферного раствора
EDTASigma AldrichEDSКомпоненты TE буфера, удаление ионов (Ca2+)
Extaq TakaraRR001AssDNA амплификация
Конфокальный микроскоп Carl ZeissLSM 510Идентификация обнажения олигонуклеотидов поверхности микросферы
Световой микроскопNikon Instruments Inc.eclipse 80iКоличество микросфер
T100 ТермоамплификаторBio-rad1861096ssDNA амплификация
Ручной протравитель короныЭлектротехникаBD-20AC Лабораторный протравитель короныГидрофильная обработка поверхности
Горячая пластинаКак однаHI-1000для отверждения жидкости PDMS
Шприцевой насосkd Scientific78-1100Равномерный расход раствора I и раствора II
КомпрессорKohandsKC-250AКонтроль расхода раствора III
Bright-Line Гемацитометр SigmaAldrichZ359629Подсчет числа микросфер
нагревательная пластина

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Smith, A. J. The use of exonuclease III for preparing single stranded DNA for use as a template in the chain terminator sequencing method. Nucleic Acids Research. 6 (3), 831-848 (1979).
  2. Sekhon, S. S., et al. Aptabody-aptatope interactions in aptablotting assays. Nanoscale. 9 (22), 7464-7475 (2017).
  3. Ng, J. K., Ajikumar, P. K., Stephanopoulos, G., Too, H. P. Profiling RNA polymerase-promoter interaction by using ssDNA-dsDNA probe on a surface addressable microarray. Chembiochem. 8 (14), 1667-1670 (2007).
  4. Sekhon, S. S., et al. Defining the copper binding aptamotif and aptamer integrated recovery platform (AIRP). Nanoscale. 9 (8), 2883-2894 (2017).
  5. Mikhailov, V. S., Bogenhagen, D. F. Effects of Xenopus laevis mitochondrial single-stranded DNA-binding protein on primer-template binding and 3'-->5' exonuclease activity of DNA polymerase gamma. Journal of Biological Chemistry. 271 (31), 18939-18946 (1996).
  6. Yu, X., Cheng, G., Zhou, M. D., Zheng, S. Y. On-demand one-step synthesis of monodisperse functional polymeric microspheres with droplet microfluidics. Langmuir. 31 (13), 3982-3992 (2015).
  7. Akamatsu, K., Kanasugi, S., Nakao, S., Weitz, D. A. Membrane-Integrated Glass Capillary Device for Preparing Small-Sized Water-in-Oil-in-Water Emulsion Droplets. Langmuir. 31 (25), 7166-7172 (2015).
  8. Lee, S. H., et al. On-Flow Synthesis of Co-Polymerizable Oligo-Microspheres and Application in ssDNA Amplification. PLoS One. 11 (7), e0159777(2016).
  9. Anna, S. L., Bontoux, N. B., Stone, H. A. Formation of dispersions using "flow focusing" in microchannels. Applied Physics Letters. 82 (3), 364-366 (2003).
  10. Gupta, A., Matharoo, H. S., Makkar, D., Kumar, R. Droplet formation via squeezing mechanism in a microfluidic flow-focusing device. Computers & Fluids. 100, 218-226 (2014).
  11. McDonald, J. C., Whitesides, G. M. Poly(dimethylsiloxane) as a material for fabricating microfluidic devices. Accounts of Chemical Research. 35 (7), 491-499 (2002).
  12. Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system. Lab on a Chip. 6 (12), 1548-1549 (2006).
  13. Olsen, T. R., et al. Integrated Microfluidic Selex Using Free Solution Electrokinetics. Journal of the Electrochemical Society. 164 (5), B3122-B3129 (2017).
  14. Dorris, D. R., et al. Oligodeoxyribonucleotide probe accessibility on a three-dimensional DNA microarray surface and the effect of hybridization time on the accuracy of expression ratios. BMC Biotechnology. 3, 6(2003).
  15. Heiat, M., Ranjbar, R., Latifi, A. M., Rasaee, M. J., Farnoosh, G. Essential strategies to optimize asymmetric PCR conditions as a reliable method to generate large amount of ssDNA aptamers. Biotechnology and Applied Biochemistry. 64 (4), 541-548 (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

SELEX

Похожие статьи