Методическая статья

Подход, основанный на капельки Microfluidic и микросферы ПЦР-амплификации для одноцепочечной ДНК ампликонов

DOI:

10.3791/57703

⸱

14 ноября 2018 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1College of Natural Sciences, Chungbuk National University, 2Department of Biomedical Engineering, Inje University, 3Institute of Digital Anti-Aging Healthcare, Inje University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа предоставляет метод для изготовления на основе капелька microfluidic платформ и применение полиакриламида микросферы для микросфер ПЦР-амплификации. Микросфера PCR метод делает возможным получить одноцепочечной ДНК ампликонов без разделения двуцепочечной ДНК.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

На основе капелька микрофлюидика возможность надежного производства однородных микросфер в канале microfluidic, предоставляя контролируемый размер и морфология полученные микросфер. Микросфера Сополимеризованная с acrydite ДНК-зонд был успешно сфабрикованы. Различные методы, такие как асимметричное PCR, при exonuclease пищеварение и изоляции на стрептавидина покрытием магнитные бусы может использоваться для синтеза ДНК одноцепочечной (ssDNA). Однако эти методы не могут эффективно использовать большие объемы высокоочищенных ssDNA. Здесь мы описываем микросферы ПЦР протокола, детализируя как ssDNA можно эффективно усиливается и отделены от dsDNA просто дозирование из трубки реакции PCR. Амплификация ssDNA может применяться как потенциальные реагенты для microarray ДНК и ДНК-SELEX (систематической эволюции лигандов на экспоненциальное обогащения) процессов.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Одноцепочечной ДНК (ssDNA) широко рассматривается как элемент молекулярного распознавания (MRE) из-за его внутренние свойства для ДНК-ДНК гибридизации1,2. Разработка ssDNA синтетических систем может привести к биологических приложений, таких как ДНК microarrays3, oligotherapeutics, диагностика и комплексной молекулярной зондирования на основе взаимодополняющих взаимодействия4,5.

На сегодняшний день, Микрометр шкала полимерные частицы были успешно продемонстрированы используя microfluidic приборы. Неск....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Изготовление PDMS Microfluidic платформа

  1. Подготовка 20 мл жидких PDMS форполимера путем смешивания базового полимера и катализатором в том соотношении 10:1. Залейте 10 мл жидкости PDMS на подготовленной прессформы Су-8 на кремниевой пластины для верхней части microfluidic сети. Для нижней равнинной части Налейте такой же объем жидких PDMS на кремниевой пластины без структуры формы.
    Примечание: Сеть microfluidic разработан в программе CAD и затем преобразуется в фотошаблонов для того, чтобы изготовить мастер, с помощью процесса типичный фотолитографии (см. Дополнительные цифры). Этот мастер состоит из негативного фоторезиста Су-8 плесен....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Готовых полимерных на основе капелька microfluidic платформа состоит из двух слоев PDMS (рис. 1a). Три вида microfluidic канала сети используются для генерации микросферы: 1) потока упором геометрии, как показано на рис. 1b, 2) серпантином канал для смешивания решения I и решения II и 3) полимеризации канал для микросфер затвердевания. Высота всех каналов было 60 мкм. Длина канала для смешивания и полимеризации были 74.35 мм и 94.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Загрязнители dsDNA являются серьезной проблемой в ssDNA амплификации. Он по-прежнему трудно свести к минимуму dsDNA амплификации в обычных Асимметричное PCR амплификация15. Кроме того хотя технические усовершенствования для генерации ssDNA позволили нам увеличить эффективность образца пропускной способности, ssDNA изоляция по-прежнему проблематичным из-за ее высокой стоимости и неполной очистки урожайности.

Асимметричное PCR является одним из самых сложных методов, испо.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют никаких конфликтов интересов раскрыть.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование поддерживается проекта под названием «Совместная программа исследований для сельскохозяйственной науки и технологического развития (проект № PJ0011642) «финансируется администрацией сельского развития, Республика Корея. Это исследование было также частично при поддержке гранта (СР 2017R1A2B4012253) основной программы исследований науки через Национальный фонд исследований (NRF) финансируется министерством науки, ИКТ и будущего планирования, Республика Корея. Это исследование было также поддержано Грант (N0000717) программы образования для творческих и промышленные конвергенции, финансируемого министерством торговли, промышленности и энергетики, Респуб....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
жидкий полидиметилсилоксан, PDMSDow Corning Inc.Sylgard 184Компоненты чипа
40% Акриламид:бис раствор (19:1)Bio-rad1610140Компоненты сополимеризуемого олиго-микросферного
персульфата аммония, APSSigma AldrichA3678Отвердитель акриламида:bis раствор
N,N,N′,N′-тетраметилэтилендиамин, TEMEDSigma AldrichT9281Катализатор персульфата аммония
Минеральное маслоSigma AldrichM5904Таблица 1. Решение III. Компонент микросферных реагентов
Cy3 меченых комплементарных олигонуклеотидных зондовBioneerсинтезированТаблица 3. Информация о последовательности 
ssDNA акрилитный меченый зондBioneerсинтезированТаблица 1. Раствор I. Компонент микросферных реагентов
TrisBiosesang  T1016Компоненты TE буфера, pH буферного раствора
EDTASigma AldrichEDSКомпоненты TE буфера, удаление ионов (Ca2+)
Extaq TakaraRR001AssDNA амплификация
Конфокальный микроскоп Carl ZeissLSM 510Идентификация обнажения олигонуклеотидов поверхности микросферы
Световой микроскопNikon Instruments Inc.eclipse 80iКоличество микросфер
T100 ТермоамплификаторBio-rad1861096ssDNA амплификация
Ручной протравитель короныЭлектротехникаBD-20AC Лабораторный протравитель короныГидрофильная обработка поверхности
Горячая пластинаКак однаHI-1000для отверждения жидкости PDMS
Шприцевой насосkd Scientific78-1100Равномерный расход раствора I и раствора II
КомпрессорKohandsKC-250AКонтроль расхода раствора III
Bright-Line Гемацитометр SigmaAldrichZ359629Подсчет числа микросфер
нагревательная пластина

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Smith, A. J. The use of exonuclease III for preparing single stranded DNA for use as a template in the chain terminator sequencing method. Nucleic Acids Research. 6 (3), 831-848 (1979).
  2. Sekhon, S. S., et al. Aptabody-aptatop....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

SELEX

Похожие статьи