Imaging Ca2 + ответы во время инфекции Shigella эпителиальных клеток

Yasmine Smail; Chunhui Sun; Laurent Combettes; Guy Tran Van Nhieu

doi:10.3791/57728

Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Imaging Ca^{2 +} ответы во время инфекции Shigella эпителиальных клеток

5.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/57728

⸱

24 мая 2018 г.

Yasmine Smail¹^,²^,³^,⁴ , Chunhui Sun¹^,²^,³^,⁴ , Laurent Combettes⁵ , Guy Tran Van Nhieu¹^,²^,³^,⁴

¹Equipe Communication Intercellulaire et Infections Microbiennes, Centre de Recherche Interdisciplinaire en Biologie (CIRB), Collège de France, ²Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (Inserm), U1050, ³Centre Nationale de la Recherche Scientifique (CNRS), UMR7241, ⁴MEMOLIFE Laboratory of Excellence and Paris Sciences et Lettres, ⁵Inserm, UMRS1174, Université Paris Sud

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем протоколы визуализировать ответы кальция (Ca^{2 +}), вызвало НеЬа клетки, инфицированные Shigella. Путем оптимизации параметров бактериальной инфекции и изображений с Ca^{2 +} флуоресцентных зондов, характеризуются нетипичных глобальных и местных Ca^{2 +} сигналы вызванных бактериями в большом диапазоне кинетики инфекции.

Аннотация

CA^{2 +} является вездесущий Ион участвует во всех известных клеточных процессах. В то время как глобальные Ca^{2 +} ответы могут повлиять на судьбу клеток, местные вариации концентраций бесплатно Ca^{2 +} цитозольной, связан с освободить от внутренних магазинов или приток через каналы плазматической мембраны, нормализует процессы корковых клеток. Патогенов, придерживаться или вторгнуться принимающей ячейки триггер реорганизации Цитоскелет актина, лежащие в основе хост плазматической мембраны, которая скорее всего влияет как на глобальном, так и на местном Ca^{2 +} сигнализации. Потому, что эти события могут происходить на низких частотах в псевдо-стохастических образом над расширенной кинетики, анализ Ca^{2 +} сигналов, вызванных микроорганизмами, поднимает основные технические проблемы, которые необходимо решить.

Здесь мы приводим протоколы для обнаружения сигналов глобальных и местных Ca^{2 +} после инфекции Shigella эпителиальных клеток. В этих протоколах артефакты, связанные с длительного воздействия и фотоповреждения, связанные с возбуждением Ca^{2 +} флуоресцентных зондов возникновения, строго контролируя параметры приобретения за определенный период времени во время Бактерии Shigella вторжения. Процедуры осуществляются тщательно анализировать амплитуду и частоту сигналов глобальной цитозольной Ca^{2 +} во время расширенной инфекции кинетики, используя химические зонд Fluo-4.

Введение

CA^{2 +} регулирует все известные клеточных процессов, включая цитоскелета реорганизации, воспалительных реакций и пути смерти клетки, связанных с хост возбудитель взаимодействия¹^,²^,³. В физиологических условиях базальный цитозольной Ca^{2 +} концентрации являются низкими, в сотни Нм диапазона, но может подвергаться переходных увеличивается после стимуляции агонистов. Эти варианты часто показывают колебательной поведение через действие насосов и каналов на мембраны плазмы и эндоплазматического ретикулума. Эти колебания характеризуется период, продолжительность и амплитуды Ca^{2 +} увеличивается и расшифровывается клетками, которые, в свою очередь, вызывают конкретные ответы в то, что известно как Ca^{2 +} код⁴^,⁵. Устойчивый рост в цитозольной Ca^{2 +} концентрации в патологических условиях может привести к смерти клетки, связанные с permeabilization митохондриальных мембран и выпуска pro-apoptotic или некротических факторов⁶^, ⁷.

Шигеллы, возбудитель бактериальной дизентерии, поражает эпителиальные клетки путем впрыскивать эффекторов в клетки хозяина, с использованием типа III секреторной системы (T3SS)⁸^,⁹. Шигеллы вторжения клеток хозяина ассоциируется с местными и глобальными Ca^{2 +} сигналы с T3SS. Что касается порами формирования токсинов, translocon T3SS, который вставляет узел клеточных мембран и требуется для инъекций эффекторов T3SS скорее всего отвечает за активацию PLC и инозитол (1, 4, 5) trisphosphate (InsP3)-зависимых Ca^{2 +} релиз. Сочетание локализованных стимуляции PLC и накопление полимеризованной актина на участках в результате вторжения шигеллы в нетипово долгосрочного InsP3-зависимых Ca^{2 +} выпуск¹⁰. Тип III эффекторных IpgD, фосфатидилхолин 4,5 Бисфосфат (PIP2) -4-фосфатазы, ограничивает количество местных PIP2, таким образом контролируя количество доступных субстрат для PLC для создания InsP3, которая способствует сосредоточение местных Ca^{2 +} ответы бактерий вторжения сайтов¹¹^,¹². Эти местные Ca^{2 +} ответы могут способствовать актина полимеризации Shigella вторжения сайты¹⁰. Глобальные Ca^{2 +} ответы, которые также вызвало, шигеллы, однако, являются необязательным для процесса бактерий вторжения, но инициировать открытие connexin hemichannels на плазматической мембраны и выпуска АТФ в внеклеточного отсека. Выпущенные СПС, действуя в духе паракринными, в свою очередь, стимулирует Ca^{2 +} колебательных реакций в клетках рядом с инфицированной клетки. IpgD также отвечает за формирование глобальных Ca^{2 +} ответы в неустойчивой изолированных ответов с медленной динамики. В конце концов после длительной бактериальной инфекции, IpgD приводит к ингибированию InsP3-опосредованной Ca^{2 +} сигналов. Через свое вмешательство с Ca^{2 +} сигнализации, IpgD задержки Ca^{2 +}-зависимой calpain активации, ведущих к разборке адгезии координационных структур и преждевременная отслойка инфицированных клеток¹³.

В то время как Ca^{2 +} сигналы участвуют в критические аспекты патогенеза, использования микроорганизма поднимает ряд технических проблем, которые не встречаются в классической агонист исследований. Протоколы, описанные здесь использовать часто используемые флуоресцентные Ca^{2 +} химический индикатор Fluo-4, который мы спроектирован, чтобы характеризовать местных Ca^{2 +} сигналов во время инфекции Shigella . Обсуждаются шаги критических для обнаружения этих сигналов, а также процедуры для их количественного анализа, который необходим для характеризуют роли бактериальной эффекторов в Ca^{2 +} сигнализации.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка

Подготовка бактерий
1. Пластина бактерии —шигелла одичал тип деформации выражая AfaE адгезина (M90T-AfaE) — на trypticase сои (TCS) агар пластины содержащий 0,01% Конго красный (CR) и инкубировать их в течение 18 часов при 37 ° C.
  Примечание: Для увеличения их воспроизводимость, шигеллы пластины, полученный на шаге 1.1.1 хранятся при температуре 4 ° C и должны использоваться в течение одной недели, потому что все колонии на носителе CR покраснеть в конечном итоге с течением времени.
2. Прививать TCS бульон до культуры, выбирая 3 красные колонии от тарелки подряд.
  Примечание: Прививки с 3 колоний выполняется ограничить вероятность выбора одного клона, чьи вирулентности плазмида претерпела генетическая рекомбинация.
3. Растут жидкого бактериальных культур в тряску инкубатор для 16 ч при 37 ° C и 200 об/мин. Добавление ампициллин в конечной концентрации 75 мг/мл. Концентрации антибиотиков не должен превышать 3 x минимальный тормозной концентрации, как избыток антибиотика может привести к потере большого вирулентности плазмиды.
  Примечание: Поддержание плазмида вирулентности Shigella должна проверяться путем покрытия бактериальных культур на CR пластины с соответствующей концентрации антибиотиков. Наличие белых колоний указывает на потерю плазмиды.
4. Прививать культуру TCS с бактериальной культурой предварительно в разведении 1: 100. Проинкубируйте ее при 37 ° C в тряску инкубатор для 2 ч при 200 об/мин. Убедитесь, что оптическая плотность 600 Нм (OD_600nm) составляет 0,2 - 0,4.
5. Центрифуга для бактериальной культуры на 2 мин на 13 000 x g при 21 ° C и Ресуспензируйте гранулы в эквивалентный объем EM среды (120 мм NaCl, 7 мм KCl, 1,8 мм CaCl₂, 0,8 мм MgCl₂, глюкозы 5 мм и 25 мм HEPES pH = 7,3).
6. Разбавить бактериальных подвеска в буфере EM в заключительном ОД_600nm 0.1 и использовать его немедленно или храните его при температуре 21 ° C и использовать его в течение следующих 60 мин.
Подготовка клетки
1. Культура клетки HeLa в среде DMEM с 1 г/Л глюкозы с 10% плода телячьей сыворотки (FCS) и вырастить их при 37 ° C с 10% CO₂. Растут TC-7 вырос в среде DMEM с 4,5 г/Л глюкозы, содержащие 10% FCS и несущественные аминокислот в инкубаторе 37 ° C, содержащие 10% CO₂.
2. Для ячейки обслуживание, разбить ячейки регулярно, чтобы избежать ингибирование роста контакт связан с вырожденная государств; Это критически важно для высокой Ca^{2 +} зонд загрузки/трансфекции эффективности.
3. Пластина НеЬа клетки на стерильные 25-мм диаметр круговой coverslips в 6-ну пластины на плотности 3 x 10⁵ клеток/хорошо за день до этого эксперимента для клеток HeLa.
4. TC-7 клеток trypsinize и подсчитать ячейки. Семя их в 4 x 10⁵ клеток/Ну и инкубировать их 5-7 дней при 37 ° C в 10% CO₂-инкубатор перед эксперименты для поляризации.
  1. Обновление клеток культуры среднего каждый день до дня проведения эксперимента.
    Примечание: Стекло дно диаметром 35-мм одноразовые камеры также могут использоваться как альтернатива coverslips содержащих скважин. Если они используются, контроль температуры с помощью Подогреваемый столик или цель не является достаточным, и палата инкубации термостат установлен на микроскопа не требуется.
В день эксперимента, удалите среды и вымыть клетки 3 x с 1 мл Эм среднего на 21 ° C.
Тензометрические силоизмерители с 3 мм¹⁴ Fluo-4-ам в буфере EM за 30 мин при 21 ° C.
Примечание: в то время как Загрузка югу вырожденная НеЬа клетки не вызывает серьезных проблем, Загрузка поляризованные TC-7 клеток часто гетерогенных и недостаточно эффективным. Для этих клеток, мы нашли, что эффективность загрузки усиливается добавлением диспергатор — плюрониевого кислота — в конечной концентрации 0,1% и АБС битор bromosulfophtalein анион транспортер в конечной концентрации 20 мкм до FLUO-4-AM-содержащих EM. Использование ratiometric химические датчики или генетически закодированный ладу зондами, которые требуют двойной приобретение не совместим с скорость приобретения необходимых для изображений местных Ca^{2 +}ответы.
Стирать образцы 3 x с EM буфер и далее инкубировать их в 1 мл Эм буфера при 21 ° C для гидролиза остаток утра. Использование Fluo-4 загружен клетки, немедленно или в течение следующих 90 мин (поддерживается при температуре 21 ° C).

2. инфекции и изображения приобретение местных Ca^{2 +} ответы

Место coverslip, содержащие Fluo-4 загружен клетки в тепловизионной камеры или стекло дно камеры. Стирать образцы в тепловизионной камере или одноразовые стекло дно камеры 3 x с EM буфер для удаления соединений, потенциально связанные с лизис клеток. Добавьте 1 mL EM буфера.
Камеры на сцене Перевернутый флуоресцентным микроскопом отопляемых на 33 ° C.
Примечание: Эта температура выбирается в качестве компромисса между оптимальной температуры, совместимы с процессом вторжения Shigella и замедление Ca^{2 +} ответы для визуализации местных реакций. Мы используем 63 X погружения нефти цель (NA = 1,25) с фазы контраст кольца.
Выберите поле микроскопии и Настройка параметров получения, включая время экспозиции и биннинга если необходимо оптимизировать Fluo-4 флуоресцентного сигнала.
Примечание: Основные проблемы местных Ca^{2 +} изображений низкой амплитуде и небольшой продолжительности ответов, требующих приобретение по крайней мере каждые 30 г-жа несколько коммерчески доступные задней подсветкой EM-CCD или C-MOS камеры представляют необходимые чувствительность для выявления местных Ca^{2 +} ответы с помощью Fluo-4. Чувствительность обнаружения также является важным вопросом для ограничения фотоповреждения или артефактов, таких как спонтанное ответы, связанные с флуоресцентные возбуждения флуоресценции-4 на высоких частотах. Здесь, на основе LED освещение 470 Нм, с 480 ± 40 Нм полосовой фильтр возбуждения, 505-нм Дихроичный фильтр и 527 ± 30 Нм полосовые выбросов на 5% от его максимальной интенсивности, в сочетании с 1,0 фильтр нейтральной плотности, были использованы для минимизации этих проблем под струей приобретения ограниченной длительности. Регулярно проводился анализ местных Ca^{2 +} сигналов партиями 120 s потоков. В этих условиях низкой освещенности Флюорофор Фотообесцвечивание не наблюдалось в течение 2 мин поток приобретений. Последовательных приобретений на том же образце могут выполняться, условии, что используются различные поля. Как правило поток первого приобретения осуществляется на поле элемента управления в отсутствие стимуляции бактерий для обеспечения отсутствия спонтанного ответов. Если наблюдаются спонтанной реакции, пробы промываются с EM буфера до тех пор, пока нет ответов наблюдаются.
Чтобы добавить бактерий в образце, удалите 500 мкл буфера EM из камеры и 500 мкл бактериальных подвески на шаге 1.1.6 готовы получить окончательный ОД_600nm 0,05, с соответствующей осторожностью, чтобы избежать перемещения поля выбранного микроскопии; объемы обеспечить надлежащее смешивание бактерий и равномерное распределение бактерий на образцы клетки.
Выполните приобретения на бактериальных сложения. Кроме того выполните приобретения 10 мин после бактериальной Добавление, которое соответствует времени, необходимого для бактерий отложений на клетки в условиях использования. В конце потока приобретения приобрести фазово контрастной изображение выбранного поля для визуализации бактерий, клеток и оборками мембраны, связанные с сайтами бактерий вторжения.
Повторите процедуру приобретения как шаг 2.5, интервалы, которые поддаются продолжительность приобретений изображения, файлы сбережений и выбор нового поля, чтобы покрыть весь процесс.
Примечание: Для шигеллы, мы нашли что приобретение потоков каждые 5 минут за 20 мин, после 10 мин бактериальных седиментации, позволило охватить большинство событий вторжения.
В конце процедуры приобретения добавьте конечная концентрация 2 мкм Ca^{2 +} ionophore ionomycin образцов для определения максимальной амплитуды Ca^{2 +} сигналов. Получение изображений каждые 3-5 s до стабилизации сигнала, обычно менее чем за 10 мин.
Следовать за путем добавления Ca^{2 +} хелатором EGTA в конечной концентрации 10 мм для определения сигнала флуоресценции в отсутствие Ca^{2 +}. Получение изображений каждые 3-5 s до стабилизации сигнала, обычно менее чем за 10 мин.
Примечание: Из-за относительно медленной динамики глобального Ca^{2 +} вариации, выполните эти приобретения каждые 3-5 s (не в потоковом режиме), позволяя для Ca^{2 +} изображений на том же микроскопическом поле во время последовательных процедур.

3. анализ

Экспресс цитозольной Ca^{2 +} вариации со временем как процент ΔF/Ф₀, где ΔF представляет собой вариации интенсивности средний флуоресценции региона интерес (ROI) и F₀ базовых флуоресценции в же ROI, к которому без соответствующего региона поля лишенный клетки вычитается.
1. Удалить уровень базальной флуоресценции для каждой ячейки в различных областях, соответствующей исходных уровней; Эти уровни могут недвусмысленно определены из-за низкой частоты и сравнительно короткая продолжительность местной Ca^{2 +} ответы в приобретении данного потока.
  Примечание: Количественно яркие черты ответы на вопросы, относящиеся и патогенных модель учился. Классически различные параметры учитываются для анализа Ca^{2 +} сигналов, включая частоту клеток, показаны локальные или глобальные Ca^{2 +} ответы, а также продолжительность, амплитуду и частоту этих ответов. В случае Shigella и местные реакции еще одним важным аспектом анализа является пространственной ассоциацией ответов с бактерий вторжения сайтов.
Для количественного определения процент клеток реагировать, показаны глобальные или локальные ответы, нарисуйте ROIs в клетках, в ряды соответствует вариации интенсивности флуоресценции-4.
1. Установить строгие параметры для выявления местных Ca^{2 +} ответы, например амплитудой трехкратное выше фона вариации исходных клеток интенсивность средняя флуоресценции или продолжительностью по крайней мере 200 мс, чтобы избежать скоринга ложный положительный.
  Примечание: Как правило, даже небольшие местные Ca^{2 +} ответы можно отличить от любого фонового шума в их профиле. ROIs должно быть достаточно большим, чтобы интегрировать сигналы достаточно флуоресценции для выявления местных вариаций. В зависимости от интенсивности флуоресценции-4 обнаружения эти ROIs могут соответствовать круги диаметром от 2-5 мм.
2. Измерьте изменения средней интенсивности флуоресценции Fluo-4 в 2 регионах в различные области той же ячейке, чтобы определить, являются ли ответы локальные или глобальные.
  Примечание: Анализ большого числа клеток облегчается использование изображений программное обеспечение, позволяющие он-лайн экран вариации интенсивности средний флуоресценции со временем для отдельных регионов. Коммерчески доступных изображений программное обеспечение имеет такую возможность, но это может также производиться с использованием Icy freeware, используя плагин ROI интенсивности эволюции .
3. Определите процент клеток, показаны местных реакций.
  Примечание: Этот процент вычисляется исходя из общего числа клеток, анализа в микроскопии поле, которое должно быть в достаточном количестве для поддержки статистически значение с использованием непараметрических тестов.
4. Определите продолжительность местных реакций.
  Примечание: Местные Ca^{2 +} ответы можно далее выделить по диапазонам продолжительность (то есть, менее чем 500 мс, между 5 и 10 s, или выше 10 s) и их связь с шигеллезом вторжения сайтов.
Количественно амплитуда ответов. Во-первых калибровки максимальная Ca^{2 +} и ячейки фоновых уровней определяется как шаг 2.1.7. Поскольку нагрузка Fluo-4 могут отличаться для каждой ячейки, выполните эти решения для отдельных ячеек в области.
1. Экспресс амплитуда ответов как относительный процент максимальной реакции.
2. Проверка статистических с помощью теста нормальной жизни, следуют параметрические испытания для анализа потенциальных различий между выборками в амплитуде ответов.
3. Определите ассоциацию этих ответов относительно бактерий вторжения сайты, их соответствующих локализации для оборки индуцированного бактериальной мембраны, визуализируется в соответствующей фазе контрастность изображения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Шигеллы вторжения ассоциируется с нетипичным долгосрочные местные Ca^{2 +}ответы:

После протокол, упомянутых выше Fluo-4-загружен НеЬа клетки были оспорены с WT Shigella и поток приобретений были исполнены анализировать сигналы Ca^{2 +}. Представитель эксперимента показан на рис. 1, с покадровой фотографии серии интенсивности флуоресценции зонда Fluo-4, в среднем в р...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Эта рукопись описывает протокол, который мы спроектирован, чтобы следовать местные Ca^{2 +} сигналов в течение относительно короткого кинетика Shigella вторжения, а также глобальные Ca^{2 +} ответы во время расширенной кинетика Shigella. Ниже ключ можно найти проблемы, которые необходимо решить для оптимизации обнаружения Ca^{2 +} сигналов при сведении к минимуму вмешательства с биологических процессов.

Химические против генетически закодированны...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего объявить.

Благодарности

Мы благодарим Дженни-ли Thomassin за ее помощь в редактировании рукопись. Работа была поддержана ANR предоставляет MITOPATHO и PATHIMMUN, гранты от Labex Memolife и Shigaforce IDEX ПДП. Chunhui солнце является получателем доктора грант от Совета стипендию Китая. Лоран Combettes и парень Чан Ван Nhieu являются получателями WBI-Франс обмена Tournesol программы N ° 31268YG (Fonds de la Recherche Scientifique, Министерство Français des дел Валлонии-Брюсселя International et европейских сообществ, Ministère де высшего образования et de la исследований dans le cadre des Partenariats Юбера Курьена).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Флуо-4 АМ	Инвитроген	F14201
Метаморф версия 7.7	Универсальная визуализация
CoolСветодиодная система подсветки pE-2	Roper Scientific
микротарелка 35 мм, высокая;	IBIDI	81156
Trypticase Soy (TCS) бульон	Thermofisher		B11768
TCS агар	Thermofisher		B11043
Congo red	Sigma-Aldrich		75768
M90T-AfaE	Sun et al. 2017	Shigella flexneri серотип V. экспрессирующий адгезин
ipgD-AfaE	Sun et al. 2017	изогенный мутантный штамм ipgD, экспрессирующий адгезин

AfaE AfaE

Ссылки

Ashida, H., Ogawa, M., Kim, M., Mimuro, H., Sasakawa, C. Bacteria and host interactions in the gut epithelial barrier. Nature Chemical Biology. 8 (1), 36-45 (2012).
Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signaling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 1 (1), 11-21 (2000).
Strehler, E. E. Plasma membrane calcium ATPases: from generic Ca(2+) sump pumps to versatile systems for fine-tuning cellular Ca(2). Biochemical and Biophysical Research Communications. 460 (1), 26-33 (2015).
Muallem, S. Decoding Ca2+ signals: a question of timing. Journal of Cell Biology. 170 (2), 173-175 (2005).
Uhlen, P., Fritz, N. Biochemistry of calcium oscillations. Biochemical and Biophysical Research Communications. 396 (1), 28-32 (2010).
Carneiro, L. A., et al. Shigella induces mitochondrial dysfunction and cell death in nonmyleoid cells. Cell Host & Microbe. 5 (2), 123-136 (2009).
Horng, T. Calcium signaling and mitochondrial destabilization in the triggering of the NLRP3 inflammasome. Trends in Immunology. 35 (6), 253-261 (2014).
Galan, J. E., Lara-Tejero, M., Marlovits, T. C., Wagner, S. Bacterial type III secretion systems: specialized nanomachines for protein delivery into target cells. Annual Review of Microbiology. 68, 415-438 (2014).
Ashida, H., Mimuro, H., Sasakawa, C. Shigella manipulates host immune responses by delivering effector proteins with specific roles. Frontiers in Immunology. 6, 219(2015).
Tran Van Nhieu, G., et al. Actin-based confinement of calcium responses during Shigella invasion. Nature Communications. 4, 1567(2013).
Niebuhr, K., et al. Conversion of PtdIns(4,5)P(2) into PtdIns(5)P by the S. flexneri effector IpgD reorganizes host cell morphology. The EMBO Journal. 21 (19), 5069-5078 (2002).
Konradt, C., et al. The Shigella flexneri type three secretion system effector IpgD inhibits T cell migration by manipulating host phosphoinositide metabolism. Cell Host & Microbe. 9 (4), 263-272 (2011).
Friedrich, P. The intriguing Ca2+ requirement of calpain activation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 323 (4), 1131-1133 (2004).
Thomas, D., et al. A comparison of fluorescent Ca2+ indicator properties and their use in measuring elementary and global Ca2+ signals. Cell Calcium. 28 (4), 213-223 (2000).
Sun, C. H., et al. The Shigella type III effector IpgD recodes Ca2+ signals during invasion of epithelial cells. The EMBO Journal. 36 (17), 2567-2580 (2017).
Allaoui, A., Menard, R., Sansonetti, P. J., Parsot, C. Characterization of the Shigella flexneri IpgD and IpgF genes, which are located in the proximal part of the mxi locus. Infection and Immunity. 61 (5), 1707-1714 (1993).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Кальциевый имиджинг Fluo-4 AM флуоресцентная микроскопия цитозольный кальций глобальные кальциевые сигналы локальные кальциевые сигналы обработка иономицином хелатирование EGTA

Imaging Ca2 + ответы во время инфекции Shigella эпителиальных клеток

Imaging Ca2 + ответы во время инфекции Shigella эпителиальных клеток

В этой статье

Краткое содержание

Аннотация

Введение

Протокол

Результаты

Обсуждение

Раскрытие информации

Благодарности

Материалы

Ссылки

Перепечатки и разрешения

Теги

Imaging Ca^{2 +} ответы во время инфекции Shigella эпителиальных клеток