Методическая статья

Визуализация микробиоты в кишки клеща в целом гора в Situ гибридизация

DOI:

10.3791/57758

⸱

1 июня 2018 г.

 ,  ,  , 
1Department of Microbial Pathogenesis, Yale University School of Medicine, 2Program in Vertebrate Developmental Biology, Departments of Pediatrics and Genetics, Yale University School of Medicine, 3Department of Internal Medicine, Yale University School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем протокол пространственно и височно оценить наличие жизнеспособных микрофлору в тик кишки с использованием подхода изменение состава Гора в гибридизации situ.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Инфекционных заболеваний, передаваемых членистоногих векторами по-прежнему представляют собой значительную угрозу для здоровья людей во всем мире. Патогенных микроорганизмов, вызывающих эти заболевания, не существует в изоляции, когда они колонизировали вектор; скорее они скорее всего заниматься взаимодействия с резидентом микроорганизмов в просвете кишки. Микробиота вектор была продемонстрирована возможность играть важную роль в передаче возбудителя для нескольких трансмиссивных заболеваний. Ли-резидентов бактерий в кишечнике Черноногий клещ, вектор ряд патогенов человека, включая Borrelia burgdorferi, влияние клеща передачи возбудителей не определяется. Мы требуем методы для характеризующие состав бактерий, связанные с тик кишки для содействия более глубокому пониманию потенциальных межвидовой взаимодействий в кишечнике клеща. Использование целом гора в situ гибридизация визуализировать стенограммы РНК, связанные с бактериальных вида позволяет для сбора качественных данных относительно численности и распределения микробиоты в неповрежденной ткани. Этот метод может использоваться для изучения изменений в обстановке микрофлору кишечника в течение клеща кормления и может также применяться для анализа экспрессии генов клеща. Окрашивание всей клеща кишок доходность информация о валовых пространственного распределения целевых РНК в ткани без необходимости для трехмерной реконструкции и менее пострадавших от загрязнения окружающей среды, который часто смешивает на основе виртуализации методы часто используются для изучения сложных микробных сообществ. В целом этот метод является ценным инструментом, который может использоваться для лучше понимать вектор возбудитель микробиоты взаимодействий и их роль в передачи болезни.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Человека и животных патогенов, передано членистоногих векторов находятся во всем мире и приходится около 20% инфекционных заболеваний во всем мире1, но эффективный и не доступны безопасные вакцины против большинства этих патогенов. Наше понимание важной роли синантропных, симбиотических и патогенных микроорганизмов, известные как микрофлора2, модуляции и формирования здоровья почти всех размером3 расширяется. Теперь уже очевидно, что членистоногих векторами патогенов также гавани кишка микробиоты и эти связанные векторные микробиоты было показано влияние различных возбудителей трансмиссивных4,5. Членистоногих микрофлора состоит из эубактерии, археи, вирусов и эукариотических микробы как простейшие, нематод и грибов6. Однако, преобладающее исследований основное внимание уделялось эубактерии вследствие, в частности, наличия маркерных генов и справочные базы данных для выявления конкретных бактериальных членов.

С акцентом на Черноногий, тик вектор нескольких патогенов человека, включая Borrelia burgdorferi7, возбудителя болезни Лайма, оптимизации техники микробного визуализации была направлена на улучшение нашего понимания клеща кишка микробиоты в контексте взаимодействия вектор патогена. Несколько вопросов остаются ответа в поле микрофлора клеща. Кишечник является сайт первого расширенная встреча между клеща и входящие возбудителя в контексте горизонтально передаваемых патогенов; Таким образом понимание роли векторных кишка микробиоты в модуляции вектор возбудитель взаимодействия будет выявить значимые идеи. Клещи имеют уникальный режим переваривания крови еды, где обработка крови еды компонентов занимает место внутриклеточно8. В просвет кишки казалось бы служит судно содержать крови еды как тик каналы, и питательных веществ пищеварение и усваивание наступить на протяжении нескольких дней кормления и продолжить после пресыщения. Патогенов, приобретена галочку во время кормления войти в просвет кишки вместе с bloodmeal и таким образом просвет становится основной сайт взаимодействия среди клещей, возбудителя и резидентов микробиоты. Как пищеварение проходит через сытость и иксодовых клещей линьки, кишечнике претерпевает структурные и функциональные изменения9. Состав и пространственной организации gut бактерии также может меняться в концерте с меняющейся обстановке кишки. Таким образом, важно понять архитектуру резидентов бактерий в кишечнике клеща в полной мере понять взаимодействие клеща, возбудителя и микрофлору кишечника.

Молекулярные методы для описания связанного узла микробиоты регулярно используют высок объём параллельной последовательности стратегий10 усилить и последовательность бактериальной 16S рибосомной ДНК (рДНК). Эти стратегии виртуализации обойти необходимость получения стерильных культурах конкретных видов бактерий и предоставить подробное описание всех бактериальных членов, представленных в образце. Тем не менее такие стратегии являются осложняется неспособность различать экологических загрязнений от Бона ФИДЕ жителей. Кроме того при оценке образцов, таких как клещей, которые являются небольшими по размеру и следовательно содержат низкий микрофлору специфических ДНК урожайности, вероятность усиления экологических загрязнителей является увеличение11 и приводит к неоднозначной интерпретации микрофлора композиция. Таким образом, функциональные характеристики в сочетании с визуализацией конкретных жизнеспособных бактерий будет важно определить и различить микрофлора клеща височно и пространственно. К этой цели мы воспользовались целом гора РНК в situ гибридизация. Этот метод обычно используется для оценки картин выражения гена в органах и эмбрионы12,13,14 и позволяет полуколичественный анализ выражения над всей выборки интерес. Это отличается от традиционных в situ гибридизация методов, которые используют разделов ткани и часто требуют обширный анализ секционного материала с вычислительной Ассамблеей предсказать выражение в целом органов15. В то время как целое гора обычно относится к весь организмов12, здесь всего гора относится к весь кишки или органов. Преимущества использования РНК целом гора в situ гибридизация подход для оценки архитектуры клеща кишка микробиоты многократно. Тик кишки состоит из 7 пар дивертикулы, каждая пара разного размера16. Функциональные различия, если таковые имеются, среди этих дивертикулы, не поняли в контексте биологии тик, тик микробиоту или тик возбудитель взаимодействий. Манипуляции кишечника, которые разрыву кишки дивертикулы будет вытеснять микрофлору в просвете кишки или слабо связанные с кишки и привести к неправильному толкованию пространственной локализации микробиоты. Флуоресцировани обозначенного РНК в situ гибридизация ранее использовались для изучения клеща кишки стенограммы17 , фиксации и открыв индивидуальный кишку дивертикулы обеспечить зонд гибридизации и локализовать B. burgdorferi стенограммы путем разрезания парафин врезанных всего18, клещей. Оба эти подходы требуют манипуляций деления тканей до гибридизации, которые могут повлиять на архитектуру микрофлору кишечника.

В настоящем докладе мы подробно описать протокол для изучения жизнеспособных клеща кишка микробиоты с помощью целом гора в situ гибридизация (WMISH). Использование всего гора РНК в situ гибридизация позволяет глобального понимания присутствия и обилие конкретных кишки бактерий в различных регионах кишечник и может стимулировать новые идеи в биологии кишки клеща в контексте возбудителя колонизации и передачи. Кроме того использование РНК зондов, направленных против определенных бактериальных РНК позволяет обнаружение жизнеспособных бактерий в кишечнике клеща.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка ДНК шаблонов

  1. Скачать 16S рРНК последовательности конкретных для каждого бактериальных родов от NCBI базы данных и дизайн полимеразной цепной реакции (ПЦР) совместимые вперед и обратить вспять грунты, которые усиливают родов конкретных регионах (~ 200-250-пары длинный), как описано выше 19. также относятся к открытым исходным кодом базы данных Силва20,21 и probeBase22 онлайн ресурсам для зондов олигонуклеотида рРНК ориентированных и грунтовки, как РНК зонды для некоторых бактериальных родов может быть коммерчески доступны.
    Примечание: Важно выбрать гена регионы, которые являются специфические для отдельных родов и убедитесь, что разработанные праймеры не усилить связанные бактериальных родов. Это очень важно для получения родов/ген специфического зонд гибридизации.
  2. Кормить клещей, 24, 48 или 72 h на мышах, вскрыть клеща кишки и подготовить РНК и cDNA от клеща кишки как описано ранее23. Используйте шаблон для PCR усиливает ампликонов родов конкретным, с помощью Термоциклер cDNA. Запустить Алиготе ПЦР продукта/ампликон на 1,5% агарозном геле и подтвердите, что amplicon соответствует ожидаемый размер визуализации под ультрафиолетовой (УФ) света, с использованием геля изображений системы.
  3. Клон бактериальных 16S рибосомной РНК ампликонами интерес в коммерчески доступных вектор TA (Таблица материалов), содержащие РНК-полимеразы промоутеров для бактериофага полимеразы (SP6, T7 или T3). Последовательность клонов для подтверждения личности amplicon и направленность клон применительно к каждому из промоутеров. Исходя из этого, определите, что промоутер выбора для создания чувства или Антисмысловые РНК зонды (рис. 1).
  4. Линеаризации 1 мг плазмида с соответствующей энзима ограничения в объеме реакции до 30 µLfor 2 ч при температуре, рекомендованные производителем. Выберите энзимов ограничения, основанные на промоутер, который будет использоваться для генерации чувство или антисмысловых зонд (рис. 1). Проверка Линеаризация путем визуализации 2 мкл дайджест реакции на геле агарозы 1%.
  5. Очистит оставшиеся 28 мкл переваривается ДНК, использование коммерчески доступных комплект очистки столбца продукта ПЦР и количественно ДНК концентрации в спектрофотометре.
    Примечание: Некоторые смысле зондов может вызвать фон окраски намного выше, чем соответствующие антисмысловых зонд и может необходимо изучить другие варианты. Альтернативные негативный контроль включают плазмид, кодирование последовательностей не представлены в образце или другой зонд, который дает характерный узор гибридизации.

2. Строительство Digoxygenin-UTP РНК зонды

  1. Подготовьте смесь нуклеотидов, объединяя 7,5 µL 100 мм UTP, 25 мкл 10 мм digoxygenin-UTP и 10 мкл 100 мм АТФ, GTP и CTP в пластиковых пробирок 1.5 мл.
  2. Выполнять в vitro транскрипция использование коммерчески доступных T7 или Sp6 РНК полимеразы наборы, используя 1 мкл, комплекса нуклеотидов (шаг 2.1) и 0,25 - 1 мкг шаблона ДНК. Довести объем до 20 мкл с водой. Флик трубки объединить и пульс спина. Инкубируйте при 37 ° C для 2,5-3 ч.
    Примечание: Строительство зонд был успешным с переваривается плазмида концентрации как низко как 7 нг/мкл, но типичные концентрации на этот шаг диапазон от 15-25 нг/мкл. Транскрипции реакции также может быть ночь инкубировали при 37 ° C, но это не значительно увеличить доходность РНК.
  3. 1 мкл DNase (2000 единиц/мкл) и инкубировать при 37 ° C за 10 мин. Не превышать 10 мин, или фермента может начать унижающего достоинство РНК.
  4. Добавьте 30 мкл ледяной хлорида лития 7,5-8 M и 30 мкл охлажденной воды, свободной от нуклеиназы, чтобы осадить РНК. Флик трубки смешивать. Разрешить осадков РНК перейти на ночь при-20 ° C.
  5. Собирать РНК центрифугированием в 17,000 g x 20 мин при 4 ° C. Помыть лепешка однажды с 1 мл свежеприготовленные 75% этанола в диэтиловым pyrocarbonate (DEPC) воду, а затем повторить центрифугирования.
  6. Удалите и удалить супернатант, перевернуть трубку на чистой бумажной салфеткой и дать высохнуть за 10 мин Ресуспензируйте Пелле в нуклеиназы свободной воды. Если гранулы легко видно, Ресуспензируйте в 25 мкл. Если гранулы очень мало или не видна, Ресуспензируйте в 15-20 мкл. получить оценку концентрации РНК, спектрофотометр.
    Примечание: Типичный РНК концентраций в диапазоне от 200-500 нг/мкл.

3. Визуализация РНК зонды электрофорезом геля RNA формальдегида для оценки чистоты РНК

Предупреждение: Формальдегид представляет опасности вдыхания; Таким образом создавать решения, необходимые для анализа геля RNA в зонта. Бромид ethidium — подозреваемых канцерогенов; обращаться с осторожностью.

  1. Как описано ранее24 и бросили гель в лари поле бесплатно полиадениновый Подготовьте гель агарозы 1% формальдегида. После прохладной, заполните поле гель с 1 x работает буфер (1 x MOPS при pH 7.0, 5% формальдегида).
  2. Подготовьте буфер образца (бромид ethidium 400 мг/мл 5 мкл, 20 мкл 10 x MOPS, 35 мкл формальдегида и 100 мкл формамид). Объединить 2 мкл РНК зонда (шаг 2.6) с 8 мкл пример буфера. Инкубируйте на 70 ° C на 10 мин.
  3. Подготовка загрузки буфера РНК путем объединения 5 мл 50% глицерина, 1 мл 10% формальдегида, 40 мг бромфеноловый синий, ксилол cyanol 40 мг и 20 мкл 0,5 М ЭДТА (рН 7,5). После использования Храните этот буфер при-20 ° C.
  4. Добавить 3 мкл буфера загрузки образцов РНК от 3.2 шаг и перемешать. Держите пробоотборные трубки на льду.
  5. Загрузите весь пример тома из шаг 3.4 в гель. Загрузите Алиготе одноцепочечной РНК лестнице вместе с тем, чтобы проверить размер РНК. Побегите гель на 100 V или ниже до тех пор, пока синий краситель переносит примерно 75% пути вниз геля. Визуализируйте РНК под УФ светом с помощью геля тепловизионные системы.
    Примечание: Хорошее качество РНК зонд должен отображаться как дискретный группа с мобильностью, соответствующий ожидаемый размер датчика (рис. 2, переулок 1). Если зонд появляется в виде диффузного залитых и замазанных текстов группы (Рисунок 2переулок 2), это не должно использоваться.

4. Отметьте кишки коллекции и фиксация

  1. Соберите Черноногий нимф, которые кормили на мышах для времени точек интереса.
    Примечание: Для целей этой техники, клещи ФРС для 48 или 72 ч работы лучше всего.
  2. Вскрыть кишечник от клеща в MEMFA (Таблица 1) на слайде стекла под микроскопом рассечение, избегая повреждения органа как можно больше. Установите галочку на чистой микроскопа в 20-30 мкл MEMFA. Используя пару стерильных Высокоуглеродистая сталь лезвия бритвы #11 срез головы региона в щита клеща, оставляя тело клеща. Аккуратно нажмите тела толкать дивертикул кишечника и слюнных желез из тела кутикулы. Отдельные слюнных желез и кишечнике и черпать мужество на лезвии бритвы.
  3. Соберите кишки в 1,5 мл, содержащих 500 мкл MEMFA. Инкубировать трубки при комнатной температуре с плавное покачивание за 1 ч или на ночь при 4 ° C.
    Примечание: Клеща слюнных желез может также быть расчленены и аналогично фиксированной и витражи.
  4. Мыть нежно 3 раза с 1 мл ледяной 100% этанола обезвоживает ткани. Пусть кишки естественно опускаться на дно трубки между каждой мыть, как центрифугирования может повредить ткани. Для длительного хранения сохранить образцы в 100% этанола в-20 ° C.

5. Строительство сетка образца корзины и 24-ну корзина держатель

  1. Вырежьте дно прочь 2 мл и 5 мл оснастки Топ пробирок с помощью подогреваемый одним краем лезвия на скальпель.
    Предупреждение: Лезвие может потребоваться быть разогреть несколько раз, прежде чем вырезать завершена.
  2. Вырежьте квадраты сетки нейлона 110 мкм немного больше, чем открытие нового трубки. Бонд сетку в нижней части трубки их вместе слегка нажав на горячей плите на средне слабом огне до тех пор, пока сделал хорошее уплотнение. Пусть прохладно, убедитесь, что есть без пробелов между сеткой и трубки и обрезать излишки сетки вокруг краев.
  3. Вырезать отверстия в крышке плита 24-Ну что губы образца корзины в 5.2 шаг будет сидеть в отверстие и не проваливаться, уступая set-up, где дно корзины образца будет сидеть всю дорогу в скважинах, когда они находятся в отверстия в крышке.
  4. Используйте этот держатель установлены корзины для передачи корзины от одной плиты к другой с относительной легкостью для полностью в situ гибридизация протокола. Используйте две пластины 24-хорошо, так что хотя один инкубация происходит, другие плиты готова для следующего вымыть.

6. в Situ гибридизация: день 1 (сроки: 4-5 ч)

  1. Передача решился надписью Образец корзины, разделенных экспериментальные условия и предназначен РНК зонд.
    Примечание: Пятно по крайней мере 5 кишки на условие для учета природные различия между реплицирует.
  2. Увлажняет образцы осторожно, чтобы избежать воздушных пузырей в ткани, постепенно увеличивая соотношение фосфат амортизированное saline с 0.1% неионные ПАВ (PTw; Таблица 1) для этанола в стирок.
    Примечание: Завершите все моет в держателе 24-ну корзины при комнатной температуре с нежным агитации, если не указано иное. Аликвота 500-600 мкл Вымойте решения в каждой скважине держателя такого полностью погружены кишки в каждой корзине. Подготовьте все решения DEPC-лечение водой для предотвращения деградации РНК.
    1. Стирать образцы для 5 мин в 500 мкл 100% этанола.
    2. Подготовка по меньшей мере 500 мкл за образец корзину 75%, 50% и 25% этанола в ПТРС. увлажняет образцы промывкой для 5 минут в каждом этанола раствор, переход от самая высокая концентрация этанола на минимальную.
    3. Стирать образцы 4 раза за 5 мин в ПТРС.
  3. Разрушения образцов с протеиназы K (10 мкг/мл) в PTw за 5 мин.
  4. Подготовка ткани для гибридизации с зондами РНК.
    1. Стирайте образцы дважды, как описано в 6.2 в 24-ну корзина держатель с нежным агитации за 5 мин в 500 мкл буфера триэтаноламин (0,1 М, pH 7.0-8.0) при температуре окружающего воздуха (Таблица 1) сохранить образцы в среде Амин бесплатно.
    2. Лечить образцы дважды с 500 мкл 0,25% ангидрида уксусной кислоты в буфере триэтаноламин (0,1 М, pH 7.0-8.0) за 5 минут, затем промыть образцы дважды в PTw за 5 мин.
      Примечание: Ангидрид уксусной кислоты acetylates бесплатно амины для нейтрализуют положительный заряд, который имеет решающее значение для предотвращения электростатических взаимодействий неспецифической и обеспечения конкретной привязки зонда к мРНК.
    3. Исправить кишки для 20 мин с 500 мкл параформальдегида 4% в PTw, затем помыть 5 раз в PTw за 5 мин.
    4. Prehybridize по инкубации пробы в 500 мкл гибридизации буфера дополнителяных 24-ну корзина держатель в 24 хорошо пластину (Таблица 1) для 1,5-2,5 ч, при 60 ° C с нежным агитации в тряску водяной бане. Сохраните гибридизации буфер, используемый для prehybridization шага для повторного использования в Протоколе 2 день (шаг 7.1).
    5. Подготовьте зонд гибридизации решения путем разбавления зонды RNA в гибридизации буфера до конечной концентрации 1 мкг/мл.  Проинкубируйте образцы с решениями зонд гибридизации в держателе 24-ну корзины при 60 ° C с нежным агитации на ночь в тряску водяной бане (таблица 2). Накладка, перевозящих корзины держатель плотно с алюминиевой фольги для предотвращения испарения раствора гибридизации.

7. в Situ гибридизация: день 2 (сроки: 4.5-5.5 ч)

  1. Удалить образцы из растворов гибридизация зонда и поместите их в буфере защищены гибридизации от предыдущего дня. Инкубируйте на 60 ° C с нежным агитации за 3 мин.
    Примечание: Зонд гибридизации решения могут храниться при температуре-20 ° C для повторного использования в 3 раза.
  2. Подготовка 2 x буфер солевой раствор натрия цитрата (SSC) путем разбавления 20 x SSC в воде DEPC-лечение (Таблица 1). Стирать образцы дважды за 3 мин с 2 x SSC, затем 3 раза втечение 20 мин с 2 x SSC при 60 ° C для удаления всех следов зонд и гибридизации буфера.
  3. Лечения с РНКазы (20 мкг/мл) и РНКазы T1 (10 мкг/мл) 2 x SSC на 30 минут при 37 ° C для удаления одного мель зонд РНК, представляющие бесплатно не гибридизированных РНК.
  4. Мыть раз с 2 x SSC 10 мин при комнатной температуре. Подготовить 0,2 x SSC путем разбавления 2 x SSC в DEPC-лечение водой, затем промыть дважды 0,2 x SSC за 30 мин при 60 ° C для удаления избыточного полиадениновый.
  5. Мыть два раза с 500 мкл буфера малеиновой кислоты (МАБ; Таблица 1) за 10 минут.
  6. Проинкубируйте образцы с блокировкой решение (2% блокировки реагента в МАБ) для 1,5-2 ч.
    Примечание: Блокирование реагент может быть трудно растворить; Нежный Отопление СПИДа распада.
  7. Заменить блокировки решение с анти digoxigenin щелочной фосфатазы конъюгированных 500 мкл антител на 1:3,000 разрежения в блокировании решения и инкубации при комнатной температуре около 4 ч или при температуре 4 ° C на ночь.

8. гибридизации in Situ : день 3 (сроки: 6 h для ночевки)

  1. Стирайте образцы по крайней мере 5 раз за 30 минут с 500 мкл МАБ для удаления избыточных антитела.
    Примечание: Эти моет являются гибкими и может быть продлен до 1-2 ч, или 3-4 моет может быть заменен на одну ночь мыть при 4 ° C с минимальным влиянием на эффективность.
  2. Мыть дважды за 5 мин с щелочной фосфатазы буфера, рН 9,5 (AP буфер; Таблица 1).
  3. Начинают цвет реакции, заменив последний мыть с 500 мкл Хромогенный субстрат для щелочной фосфатазы (Таблица материалов). Крышка образца с алюминиевой фольгой и пусть окрашивание действовать при комнатной температуре 3 - 5 часов или на ночь при 4 ° C. Периодически контролировать реакцию окрашивания, просмотрев ткани под микроскопом рассечения, чтобы избежать overstaining.
    Примечание: Когда окрашивание, фиолетовый оттенок обнаруживаемых глаз в antisense исследовали образцы под микроскопом, но ткани не должно быть позволено стать очень темно. Пятнать проходит очень медленно при 4 ° C и может занять до 20-24 ч.
  4. Остановить цветной реакции промывкой для 5 минут в 500 мкл МАБ, а затем исправить ткани на ночь в Буэна в растворе.
    Предупреждение: Обрабатывать Буэна решение в вытяжного шкафа; это коррозионных канцероген.

9. в Situ гибридизация: день 4 (сроки: 3-3,5 ч)

  1. Подготовить по крайней мере 7 мл на образец корзина 1 x SSC путем разбавления 20 x SSC в DEPC-лечение водой. Удаление Буэна решения путем промывания образцы 4 – 6 раз с 70% этанола в 1 x SSC до тех пор, пока ткань больше не желтый.
  2. Подготовка 500 мкл за образец корзину 75%, 50% и 25% растворы этанола в 1 x SSC. Стирать образцы для 5 минут в каждом решении, переход от высокой концентрации этанола в низкие увлажняет ткань. Мыть дважды за 5 мин каждый в 1 x SSC.
  3. Проинкубируйте образцы в раствор отбеливателя (Таблица 1) 90 мин на лайтбоксе в зонта.
    Примечание: Этот шаг позволяет любой пигментации в образцы или окраской от Bouins решения должны быть удалены и усиливает сигнал зонда для четкой визуализации.
  4. Стирать образцы дважды с 500 мкл 1 x SSC 5 мин.
  5. Передислоцировать кишок с минимальным ущербом, инвертирование образца корзина в колодец нового 24-ну плиты и смыть через дно сетки с помощью пипетки передачи на 70% спирте. Хранить при температуре от-20 ° C, при необходимости.
  6. Чтобы получить обзор окрашивания моделей несколько образцов, как показано на рисунке 3, поддерживать кишки в 70% этанола в 24 хорошо плиты и вид с любой ярко поле Микроскоп. Для изучения отдельных кишки под микроскопом ярко поле, как показано на рис. 4, рис. 5, и Рисунок 6, смонтировать кишки в 100% глицерина под coverslips. Пластиковой лопаточкой нежно манипулировать ткани с минимальным ущербом.
    Примечание: Высокая вязкость глицерина помогает защитить от повреждения тканей путем сжатия и позволяет тщательно позиционирования дивертикулы, таким образом, что ткани может рассматриваться оптимально при более высоких увеличениях.
  7. Захват изображения микроскопа с помощью микроскопа конкретный образ захвата программного обеспечения (Таблица материалов) и экспортировать изображения в формате Tiff для общего редактирования изображений программное обеспечение. Для количественного определения относительной окрашивание различия между экспериментальное лечение, скачайте программное обеспечение анализа общий образ (Таблица материалов). Открыть изображение в программное обеспечение для анализа и использовать инструкции в программное обеспечение для измерения интенсивности пикселей окрашивание и вычислить окрашивание участков гистограммы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Измерение и оценка качества зонды RNA критических до начала окрашивания. В vitro транскрипция эффективность весьма зависит от количества и качества ДНК шаблона. Мы регулярно визуализирована РНК зонды на формальдегид гель для проверки чистоты и количество зонд, порожденных реакциях транскрипции. Датчики должны появиться как яркие, дискретные диапазоны (рис. 2). Спектрофотометрические измерения концентрации РНК были весьма ориентировочный зонд качества...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это первое использование техники целом гора в situ гибридизация (WMISH) для изучения микробиоты членистоногих вектора патогенов. Наш протокол был адаптирован от одного используется для изучения развития дрозофилы и лягушка эмбрионов25,26. Целом гора РНК в situ гибридизация регулярно используется для локализации транскрипты гена пространственно и височно27 и визуализация, стенографических отчетов может быть сделан...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют никаких конфликтов интересов раскрыть.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы искренне благодарим д-р Мустафа Коха, Йельский университет, для обеспечения использования его ресурсов лаборатории. Мы благодарны г-н Ву Минг-Цзе за отличную техническую помощь. EF является следователь HHMI. Эта работа была поддержана в подарок от Джона Monsky и Дженнифер Вейс Monsky болезнь Лайма исследований фонда.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Сефар НИТЕКС Нейлоновая сетка, 110 микронAmazon03-110/47
pGEM-T Easy Vector SystemPromegaA1360
Дигоксигенин-11-UTPRoche1209256910
dNTPNew England Biolabs N0447S
ДНКаза I(без РНКазы)New England BiolabsM0303S
HiScribe SP6 Набор для синтеза РНКNew England BiolabsE2070S
HiScribe T7 High Yield РНК Набор для синтеза РНКNew England BiolabsE2040S
Вода, без РНКазы, обработанный DEPCамериканский биоаналитическийAB02128-00500
ЭДТА, 0,5 мес., pH 8,0Американский биоаналитическийAB00502-01000
Формальдегид, 37%JT Baker2106-01
ФормамидАмериканский биоаналитическийAB00600-00500
EGTASigma AldrichE-4378
DPBS, 10XGibco14300-075
Tween-20Sigma AldrichP1379-25ML
Протеиназа КСигма Олдрич3115879001
Триэтаноламин HClСигма ОлдричT1502-100G
Уксусный ангидридSigma Aldrich320102-100ML
ПараформальдегидThermoScientific/Pierce28906
SSC, 20XAmerican BioanalyticalAB13156-01000
РНК из дрожжейторулаSigma AldrichR3629-5G Гепарин
, натриевая сольSigma AldrichH3393-10KU
Denhardt's Solution, 50XSigma AldrichD2532-5ML
CHAPS гидратSigma AldrichC3023-1G
РНКаза АСигма Олдрич10109142001
РНКаза T1ThermoScientific EN0541
Малеиновая кислотаSigma AldrichM0375-100G
Блокирующий реагентSigma Aldrich11096176001
анти-дигоксигенин-AP, Fab фрагментыSigma Aldrich11093274910
левамизола гидрохлоридSigma Aldrich31742-250MG
Хромогенный субстрат для щелочной фосфатазыSigma Aldrich
Раствор БуинаSigma AldrichHT10132-1L
Перекись водородаMallinkrodt Baker, Inc2186-01
Одноцепочечная РНК-лестницаAmbion -MilleniumAM7151
 #11 Лезвия из высокоуглеродистой стали C и A Scientific Premiere#11-9411
ТермоциклерBioRad, Калифорния1851148
СпектрофотометрThermoScientific NanoDrop 2000C
Орбитальный шейкерVWRDS-500E Цифровой орбитальный шейкер
Встряхивающая водяная баняBELLCO Glass, IncHot Shaker-7746-12110
Гель  система документирования геляBioRadGel Doc XR+ Система документирования
геля Светлопольный микроскоп NikonNikonSM2745T
Светлопольный микроскоп ZeissAXIO Scope.A1
Диссекционный микроскоп ZeissSTEMI 2000-C
  ЛайтбоксVWR102097-658
Набор для очистки ПЦР Qiagen28104
Программное обеспечение для захвата изображенийZeissZen lite
Программное обеспечение для редактирования изображений Adobe Adobe Photoshop CS4 версия 11.0
Программное обеспечение для анализа изображенийНациональные институты здравоохраненияImageJ-NIH /imagej.nih.gov/ij/
Автоматизация, совместимая с инструментамиIntavis Bioanalytical Instruments, Тюбинген, Германия). Intavis, Biolane HT1.16v
11442074001

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Leitner, W. W., Wali, T., Kincaid, R., Costero-Saint Denis, A. Arthropod Vectors and Disease Transmission: Translational Aspects. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (11), e0004107(2015).
  2. Hooper, L. V., Gordon, J. I. Commensal host-bacterial relationships in the gut. Science. 292 (5519), 1115-1118 (2001).
  3. Ley, R. E., Lozupone, C. A., Hamady, M., Knight, R., Gordon, J. I. Worlds within worlds: evolution of the vertebrate gut microbiota. Nature Review Microbiology. 6 (10), 776-788 (2008).
  4. Narasimhan, S., Fikrig, E. Tick microbiome: the force within. Trends in Parasitology. 31 (7), 315-323 (2015).
  5. Weiss, B., Aksoy, S. Microbiome influences on insect host vector competence. Trends in Parasitoly. 27 (11), 514-522 (2011).
  6. Degli Esposti, M., Martinez Romero, E. The functional microbiome of arthropods. PLoS One. 12 (5), e0176573(2017).
  7. Radolf, J. D., Caimano, M. J., Stevenson, B., Hu, L. T. Of ticks, mice and men: understanding the dual-host lifestyle of Lyme disease spirochaetes. Nature Reviews Microbiology. 10 (2), 87-99 (2012).
  8. Sojka, D., et al. New insights into the machinery of blood digestion by ticks. Trends in Parasitology. 29 (6), 276-285 (2013).
  9. Grigor'eva, L. A. Morphofunctional changes in the midgut of Ixodid ticks during the life cycle. Entomological Review. 90, 405-409 (2010).
  10. Goodrich, J. K., et al. Conducting a microbiome study. Cell. 158 (2), 250-262 (2014).
  11. Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biology. 12, 87(2014).
  12. Hemmati-Brivanlou, A., et al. Localization of specific mRNAs in Xenopus embryos by whole-mount in situ hybridization. Development. 110 (2), 325-330 (1990).
  13. Frank, D., Harland, R. M. Transient expression of XMyoD in non-somitic mesoderm of Xenopus gastrulae. Development. 113 (4), 1387-1393 (1991).
  14. Harland, R. M. In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos. Methods in Cell Biology. 36, 685-695 (1991).
  15. Kernohan, K. D., Berube, N. G. Three dimensional dual labelled DNA fluorescent in situ hybridization analysis in fixed tissue sections. MethodsX. 1, 30-35 (2014).
  16. Sonenshine, D. E. Biology of ticks. , Oxford University Press. (1991).
  17. Narasimhan, S., et al. Gut microbiota of the tick vector Ixodes scapularis modulate colonization of the lyme disease spirochete. Cell Host Microbe. 15 (1), 58-71 (2014).
  18. Hammer, B., Moter, A., Kahl, O., Alberti, G., Gobel, U. B. Visualization of Borrelia burgdorferi sensu lato by fluorescence in situ hybridization (FISH) on whole-body sections of Ixodes ricinus ticks and gerbil skin biopsies. Microbiology. 147 (Pt 6), 1425-1436 (2001).
  19. Harmsen, H. J., Raangs, G. C., He, T., Degener, J. E., Welling, G. W. Extensive set of 16S rRNA-based probes for detection of bacteria in human feces. Applied Environmental Microbiology. 68 (6), 2982-2990 (2002).
  20. Quast, C., et al. The SILVA ribosomal RNA gene database project: improved data processing and web-based tools. Nucleic Acids Research. 41 (Database issue), D590-D596 (2013).
  21. Yilmaz, P., et al. The SILVA and "All-species Living Tree Project (LTP)" taxonomic frameworks. Nucleic Acids Research. 42, D643-D648 (2014).
  22. Greuter, D., Loy, A., Horn, M., Rattei, T. probeBase--an online resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes and primers: new features 2016. Nucleic Acids Research. 44, D586-D589 (2016).
  23. Narasimhan, S., et al. Modulation of the tick gut milieu by a secreted tick protein favors Borrelia burgdorferi colonization. Nature Communication. 8 (1), 184(2017).
  24. Bryant, S., Manning, D. L. Formaldehyde gel electrophoresis of total RNA. Methods Molecular Bioliogy. 86, 69-72 (1998).
  25. Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).
  26. Robson, A., Owens, N. D., Baserga, S. J., Khokha, M. K., Griffin, J. N. Expression of ribosomopathy genes during Xenopus tropicalis embryogenesis. BMC Development Biology. 16 (1), 38(2016).
  27. Khokha, M. K., et al. Techniques and probes for the study of Xenopus tropicalis development. Developmental Dynamics. 225 (4), 499-510 (2002).
  28. Jowett, T., Lettice, L. Whole-mount in situ hybridizations on zebrafish embryos using a mixture of digoxigenin- and fluorescein-labelled probes. Trends in Genetics. 10 (3), 73-74 (1994).
  29. Behnam, F., Vilcinskas, A., Wagner, M., Stoecker, K. A straightforward DOPE (double labeling of oligonucleotide probes)-FISH (fluorescence in situ hybridization) method for simultaneous multicolor detection of six microbial populations. Applied Environmental Microbiology. 78 (15), 5138-5142 (2012).
  30. Pai, V. P., et al. HCN4 ion channel function is required for early events that regulate anatomical left-right patterning in a nodal and lefty asymmetric gene expression-independent manner. Biology Open. 6 (10), 1445-1457 (2017).
  31. Legendre, F., et al. Whole mount RNA fluorescent in situ hybridization of Drosophila embryos. JoVE. (71), e50057(2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

MEMFASSC

Похожие статьи