Методическая статья

Определение маркеров вирулентность микобактерий abscessus для внутриклеточного репликации в фагоцитов

DOI:

10.3791/57766

⸱

27 сентября 2018 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
12I, UVSQ, INSERM UMR1173, Université Paris-Saclay, 2Institut Pasteur, Unité de Pathogénomique Mycobactérienne

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем два протокола для изучения фагоцитарной -Mycobacterium abscessus взаимодействий: скрининга мутантов библиотеки transposon для бактериальных внутриклеточный дефицит и определение бактериальной внутриклеточных транскриптом от РНК последовательности. Оба подхода обеспечивают проницательность в геномной преимущества и транскриптомики приспособления, повышения фитнес внутриклеточных бактерий.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Что отличает от других сапрофитные микобактерий Mycobacterium abscessus является способность противостоять фагоцитоза макрофагами, человека и способность размножаться внутри таких клеток. Эти черты вирулентности оказывают м. abscessus патогенных, особенно в уязвимых хостов с базовых структурных легочных заболеваний, таких, как муковисцидоз, бронхоэктатическая болезнь или туберкулезом. Остается неясным, как больных инфицируются м. abscessus . В отличие от многих микобактерий м. abscessus не найдены в среде, но могут находиться внутри амёб, экологические фагоцитов, которые представляют потенциальный резервуар для м. abscessus. Действительно м. abscessus устойчив к amoebal фагоцитоза и интра амебы жизни, как представляется, повышение вирулентности м. abscessus в экспериментальной модели инфекции. Однако мало что известно о . м. abscessus вирулентности само по себе. Чтобы расшифровать гены, присвоении преимущество внутриклеточных жизни м. abscessus , была разработана скрининга мутантов библиотеки м. abscessus transposon. Параллельно был разработан метод добычи РНК из внутриклеточные микобактерии после совместного культуры с амебы. Этот метод был проверен и позволило последовательность всего abscessus м. transcriptomes внутри клетки; предоставление, в первый раз, глобальное представление о . м. abscessus адаптации к внутриклеточной жизни. Оба подхода дают нам представление о . м. abscessus Факторы вирулентности, которые позволяют м. abscessus колонизировать airways в людей.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Род Mycobacterium включает видов, начиная от безвредные сапрофитных организмов до крупных патогенов человека. Хорошо известные патогенных видов, таких как туберкулез микобактерии, Mycobacterium marinum и микоз здравоохранения принадлежат к подгруппе медленно растущих микобактерий (СГМ). В отличие от подгруппы быстро-растущих микобактерий (АГР) характеризуется их способность образовывать видимые колонии в менее чем за 7 дней на носителе агар. RGM группа состоит из более чем 180 видов, главным образом не патогенные сапрофитные микобактерий. Исследования по АГР взаимодействия с их хозяевами были главным образом сосредоточены на микобактерии smegmatis и продемонстрировать, что эти микобактерий быстро устраняется бактерицидность макрофагов.

Микобактерии abscessus является одним из редких АГР, патогенных для человека и отвечает за широкий спектр инфекций, начиная от инфекции кожи и мягких тканей легких и распространение инфекции. М. abscessus считается, наряду с Mycobacterium avium, главный микобактериальной возбудителя в больных муковисцидозом1.

Различных исследований, выполненных на м. abscessus указывают, что этот микобактерии ведет себя как внутриклеточных патогенов, способные выживать бактерицидной реакция макрофагов и фибробластов в легких и кожи, которая обычно не наблюдается в RGM 2 , 3 , 4. м. abscessus анализ генома определил метаболические пути, обычно встречаются в экологических микроорганизмов при контакте с почвы, растений и водных средах, где бесплатно амёбы зачастую присутствует5. Они также продемонстрировали, что м. abscessus наделен нескольких генов вирулентности, не найден в сапрофитные и непатогенные АГР, вероятно приобретена горизонтальный перенос генов в нише, благоприятные для генетического обмена, который может собрать различные амебы резистентных бактерий.

Экспериментально один из первых поразительных результатов был наблюдения внутриклеточных рост м. abscessus в макрофагах, а что касается микобактерий туберкулеза6. М. abscessus также сопротивляется подкисление фагосомы, апоптоз и autophagy, трех основных механизмов клеточного устойчивость к инфекции2. Даже было показано, что м. abscessus удалось установить непосредственной связи между фагосомы и цитозоле, более питательные среды, которая может пользу бактериальных умножения2. Очень мало известно о геномной преимущества, которые м. abscessus обладает или приобрела возможность выживания в внутриклеточной среды. Амеба coculture является эффективным методом, который позволил изоляции многих новых амебы резистентных бактерий как Mycobacterium massiliense7,8. Способность размножаться в течение амёбы было отмечено, в модели аэрозолизации м. abscessus в мышах, которые могут наделять повышенной вирулентности до4 м. abscessus. Одна из гипотез является, что м. abscessus разработал генетических признаков, возникающих в рамках этой среды, чтобы выжить в фагоцитирующих клеток, которые отличаются от других непатогенных АГР. Эти приобретения может пользу возможность распространения и ее вирулентности в человека-хозяина.

В настоящем докладе описываются инструменты и методы для выделения геномной преимущества, м. abscessus , чтобы выжить в среде амёб, предоставленного. Для этой цели скрининга мутантов transposon м. abscessus впервые описана на штамм Acanthamoeba castellanii типа, которая позволяет идентифицировать мутант дефектных внутриклеточных роста. Также сообщается, второй скрининг в макрофагах, чтобы подтвердить, если этот дефект сохраняется в человека-хозяина. Во-вторых понять, какие механизмы использовались в . м. abscessus адаптироваться к жизни в фагоцитирующих клеток и увеличить свою вирулентность в узле животных, специально адаптированных для м. abscessus метод был разработан, после совместного культуры присутствии амёб, что позволило извлечения всего РНК из интра amoebal бактерий. Как следствие было разработано всеобъемлющее представление о . м. abscessus генов, которые требуются для внутриклеточного жизни.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Библиотека скрининг

  1. Строительство Tn мутант библиотеки
    1. Получите transposon библиотеки.
      Примечание: Для этого эксперимента, мутант библиотека transposon была получена от Эрл Рубин, Гарвардской школы общественного здравоохранения, Бостон, США. Библиотека была построена из гладкой клинических штамм (43S) о . м. abscessus комплекс (м. abscessus и massiliense) с phagemid, в . м. abscessus , позволяя случайные вставки одного Tn в TA динуклеотид (91,240 та последовательности в геноме м. abscessus ). Для получения более подробной информации см. ссылку «Рубин» и др. 9 и Laencina и др. 10.
  2. Титрование библиотеки и сохранению м. abscessusTn мутантов в плитах
    Примечание: Это занимает одну неделю.
    1. Оттепель в библиотеку на льду. Определите бактериальных концентратов, выполняя серийных разведений в 1 мл воды (10-1 в 10-15). Пластина капли каждого разведения на чашку Петри, содержащий 7H 11 агар средний с 250 мг/мл канамицин. Инкубируйте пластины при 37 ° C 3 – 4 дней.
      Примечание: Здесь, титрование 1011 бактерий/мл были восстановлены.
    2. После определения концентрации библиотеки, разбавленных в библиотеку, чтобы конечная концентрация 3000 бактерий/мл в 10 мл 25% глицерина воды. Алиготе библиотеки в 10 cryotubes с 1 мл библиотеки в каждой тюбике. Хранить аликвоты-80 ° c.
    3. Когда готов к использованию, размораживать один Алиготе разреженных библиотеки на льду и 100 мкл библиотеки для 10 квадратные плиты агара Мюллер Хинтон (MH) (размер 12 см) для восстановления 200 – 300 отдельных колоний после 3-4 дней инкубации при температуре 37 ° C.
    4. С стерильных зубочистки, передачи отдельных колоний (около 6000 колоний в 60 x 96-луночных пластины) 96-луночных плиты заполнены с 200 мкл 7 ч 9 средних с 0,2% глицерина, 1% раствор глюкозы, 250 мг/мл канамицин. Инкубируйте при 37 ° C за 5 дней без встряхивания.
    5. Передачи 100 мкл культуры (шаг 1.2.4) 96-луночных пластины, содержащей 100 мкл 7 ч 9 средних с 40% глицерина. Хранить упорядоченную библиотеки-80 ° C.
    6. Повторите шаги 1.2.3. до 1.2.5. с остальной частью библиотеки до 10 000 индивидуальных клонов восстанавливаются (около 100 x 96-луночных пластины и 30 MH пластин).
  3. Подготовка амёб
    1. Культура амебы Acanthamoeba castellanii (AC) в 75 см2 фляги культуры ткани при комнатной температуре (RT) в 30 мл PYG среды (Таблица 1) для усиления ячейки строки11.
      Примечание: Зрелые трофозоиты от крупных клей клеток с многочисленными пищеварительной вакуоли хорошо видны на микроскопе. Клетки, время удвоения оценкам, 25 ч. клетки были усилены каждые 3 дня распространения одну треть первоначального культуры в 75 см2 культуры ткани колбы.
    2. Удалите средство PYG с пипеткой 25 мл. Вымойте клетки с 10 мл буфера переменного тока (Таблица 2), который не содержит любой углерода или азота источников12. Повторите мыть два раза больше.
      Примечание: AC буфер, содержащий не источников углерода и азота избегает внеклеточного рост микобактерий. Это минимальная среда приводит к encystment амебы. Чтобы ограничить это, тепло инактивированная E. coli были добавлены как субстрат (шаг 1.4) амёбы и раз очень короткий культуры были выдвинуты (48 h для скрининга мутантов) и 4 h или 16 h культуры для RNAseq экспериментов. Альтернативно используйте это средство но обогащенного с PYG среднего (обычно 10%).
    3. Отсоедините амеба из нижней части колбы с одной энергичные сотрясения фляга культуры ткани.
    4. Подсчет ячеек с Горяева для регулировки концентрации клеток до 5 x 105 амеб/мл разбавленной в буфер переменного тока.
  4. Подготовка тепло инактивированная Escherichia coli бактерии кормить амебы после инфекции
    1. Расти клинических изолировать штамм E. coli от глицерина запас в 100 мл в бульоне Лурия (LB) ночь в 37 ° C.
    2. Урожай бактерий центрифугированием в 1835 х g 10 мин в 50 мл трубки. Выбросите супернатант. Ресуспензируйте лепешка с 10 мл 10% глицерина воды. Повторите дважды больше стиральная.
    3. Ресуспензируйте лепешка с 5 мл 10% глицерина воды. Аликвота 0,5 мл в 1,5 мл пробирок. Определите количество бактерий/мл, выполняя серийных разведений и добавляя разведений на плитах агара фунтов. Хранить аликвоты-80 ° c.
    4. За день до амебы инфекции, размораживать один Алиготе на льду и приступить к тепло убийство по инкубации трубки при 70 ° C 60 мин.
      Примечание: Проверьте инактивации, покрытие 100 мкл инактивированных бактерий на плиты агара фунтов на ночь при 37 ° C. Нет колонии должна быть видимой после одной ночи культуры.
    5. Разбавить жар убитые бактерий до концентрации 107 бактерий в 50 мкл буфера переменного тока и хранить разбавленные бактерий при температуре 4 ° C для не более чем за одну неделю.
  5. Совместное культуры амеб -м. abscessus Tn мутант: первый экран
    Примечание: Это занимает 3-4 месяца для скрининга 6000 мутантов.
    1. Распространение 5 х 104 амеб/хорошо до 96-луночных пластины в 100 мкл буфера переменного тока. Инкубируйте 1 час при температуре 32 ° C без встряхивания. Разрешить плавающей амеба trophozoïtes время присоединиться к скважинам.
      1. Во время инкубации, оттепель бактерий на льду за 1 час.
    2. 5 мкл талой бактерий культур с электронной многоканальные пипетки. Заразить для 1,5 ч. экран вокруг 6000 индивидуальные клоны из 96-луночных пластины Tn мутантов складе.
      Примечание: МВД неизвестна на этом этапе протокола; Однако все 96-луночных пластины, содержащие Tn мутантов выращивали таким же образом. Это первый экран стремится быстро идентифицировать внутриклеточный дефицит мутантов, без учета изменения в плотности посевным материалом.
    3. После 1,5 h инфекции Инвертируйте 96-луночных пластины на стерильную сеток, помещены в стерилизованные металлический лоток для удаления средство переменного тока под вытяжного шкафа. Залейте 200 мкл переменного тока среды. Повторите это мыть два раза больше.
    4. 200 мкл свежей среды дополняется 100 мкг/мл амикацин для ликвидации оставшихся внеклеточного микобактерий.
    5. Проинкубируйте втечение 2 ч перед 3 дополнительных мойки (как описано в шаге 1.5.3). После мытья, поддержания культур с 50 мкг/мл амикацин в 200 мкл буфера переменного тока.
    6. В конце инфекции и каждые 24 ч для предотвращения encystment амёб, добавьте 5 x 107 тепло инактивированная бактерии Escherichia coli (из шага 1.4).
    7. После 48 ч Сопредседатель культуры Лизируйте клетки путем добавления 10 мкл 10% SDS (натрия лаурилсульфат) для каждой скважины и Инкубируйте 30 мин при температуре 32 ° C. Продолжить с последовательным разрежения и добавить на плиты агара Columbia, содержащих 5% овец крови (COS пластины), чтобы оценить количество внутриклеточные микобактерии. Уплотнение пластины с парафина и Инкубируйте на 37 ° C.
    8. Когда колонии появляются на плитах агара после 3-4 дня, фотография пластины и определить мутантов, нарушение роста внутриклеточных, наблюдая за депозиты с наименьшее количество бактериальных колоний.
      Примечание: Не возражаете о форму, высота или плотность колонии (рис. 1А). 136/6000 мутанты были определены.
  6. Совместное культуры амеб -м. abscessusTn мутанта: второй экран мутантов, выявленных в ходе первого экрана
    Примечание: Это занимает 2 недели. Второй экран должны быть выполнены с 136 аттенуированные мутантов, полученные после первого экрана, чтобы количественно точно количество бактерий, прививки и количество внутриклеточной выживания бактерий 2 дня после инфекции.
    1. Выросла 1 колонии каждого испытываемого мутант в 50 мл трубки заполнены с 20 мл 7 ч 9 средних с 0,2% глицерина, 1% раствор глюкозы и 250 мг/мл канамицин. Позволяют бактериям для достижения экспоненциальной фазе (0,6 < ОД < 0,8).
    2. Вымойте культуры центрифугированием (1835 х g 10 мин) в среде переменного тока. Выбросите супернатант. Повторите это мыть два раза больше с 20 мл 7 ч 9 средних с 0,2% глицерина, 1% раствор глюкозы и 250 мг/мл канамицин.
    3. Ресуспензируйте бактерий в 5 мл буфера переменного тока.
    4. Определите колонии, образуя единицы (CFU) концентрация мутантов. В 24-ну тарелки добавьте 1 мл воды две первые строки. Добавьте 100 мкл бактериальной подвески в первой скважины. С микропипеткой Смешайте в три раза. Затем аспирационная 100 мкл и депозит на второй хорошо.
    5. С новым наконечником повторите шаг 1.6.4 из колодца, второй третий и т.д. до двенадцатой хорошо.
    6. Аспирационная 30 мкл разбавления 10-12 и добавить его в тарелку COS. Повторите для других разведениях.
    7. Оберните COS пластины с парафина и Инкубируйте 3 – 4 дня при температуре 37 ° C. Определите концентрацию путем подсчета колоний.
    8. Выполните совместно культуры анализов, как описано выше в трех экземплярах в 24-ну плита с 5 х 104 амебы за хорошо в 1 мл переменного тока совместно питательной среды. Прививать с разносторонностью инфекции (МВД) 10.
    9. После 48 ч Сопредседатель культуры как описано в шаге 1.5.7 приступить lysis клетки. Выполните серийных разведений в воде (10-1 до 10-6) и 30 мкл COS пластины. Инкубируйте пластины для 4 дней при 37 ° C, прежде чем продолжить с CFU подсчета.
      Примечание: После этого второй экран, были сохранены 60 136 мутантов.
    10. Храните мутантов, влияние для их выживания внутри клетки. Добавьте колонии cryotube, содержащих LB средних с глицерином (20% окончательного) или в cryotube, содержащие коммерческие решения и микрошарики в пользу долгосрочного сохранения и содействия будущей вакцинации и затем хранить при температуре-80 ° C.
    11. Оценить в vitro мутант роста путем измерения оптической плотности (OD) на 600 Нм каждые 2 дня.
      1. Расти 1 колонии каждого испытываемого мутант в 50 мл трубки заполнены с 20 мл 7 ч 9 средних с 0,2% глицерина, 1% раствор глюкозы и 250 мг/мл канамицин. Позволяют бактериям для достижения экспоненциальной фазе (0,6 < ОД < 0,8) перед регулировкой ОД до 0.01 начать кинетики.
      2. Исключите мутантов с в vitro рост дефекта при сравнении с WT штамм из набора внутриклеточный дефицит мутантов.
  7. Совместное культура макрофаги -м. abscessus Tn мутант дефектных для intra амебы жизни
    Примечание: Это занимает 1 месяц.
    1. Распространение 5 х 104 J774.2 мышиных макрофагов в хорошо 24-ну плиты в 1 мл, богатые среды, DMEM дополнена 10% сыворотки крови плода теленка (FCS). Инкубируйте пластины для 24 ч при 37 ° C и 5% CO2 разрешить макрофагов адгезии. Обеспечивают 3 реплицирует.
    2. Выполните инфекции. Прививать Tn мутантов, с мои 10, разбавленных в среде DMEM с 10% FCS в объеме 100 мкл.
    3. После 3 h инфекции необходимо выполните три мойки с 1 мл раствора DMEM (вакуумный насос может использоваться). Затем побалуйте 250 мкг/мл амикацин (в среде DMEM с 10% FCS) за 1 ч до ликвидации оставшихся внеклеточного микобактерий.
      1. После того, как 3 дополнительные автомойки с 1 мл раствора DMEM, поддерживать культур в 250 мкг/мл амикацин (в среде DMEM с 10% FCS) окончательный объемом 1 мл для предотвращения внеклеточного микобактериальной умножения.
    4. 72 ч после совместного культуры, удалите среды и лизируют макрофаги, добавив 1 мл холодной воды. Инкубируйте 30 мин при 4 ° C.
    5. Выполните CFU анализов на COS пластины для оценки числа внутриклеточных бактерий.
      1. В 24-ну тарелку добавьте 1 мл воды две первые строки. Добавьте 100 мкл Сопредседатель lysate клетки в первой скважины. С микропипеткой Смешайте в три раза. Аспирационная 100 мкл и депонировать их в второй хорошо.
      2. С новым наконечником повторите разрежения из колодца, второй третий и т.д. до двенадцатой хорошо. Затем аспирационная 30 мкл разбавления 10-12 и добавить его в тарелку COS.
      3. Повторите для других разведениях. Оберните COS пластины с парафина и ждать 3-4 дней для наблюдения и подсчета колоний.
  8. Идентификация и последовательности на сайте вставки Tn в . м. abscessus мутантов
    Примечание: Это занимает 1,5 месяцев за 60 мутантов.
    1. Genomic извлечения выявленных мутантов abscessus м.
      1. Расти мутантов в 50 мл трубки с 20 мл 7 ч 9 средних дополнена 0,2% глицерина, 1% раствор глюкозы и канамицин 250 мг/мл до экспоненциальной фазе (OD600= 0,8).
      2. Урожай 10 мл культур (2396 x g, 5 мин). Выбросите супернатант. Приостановить бактерий в 500 мкл раствора (25%-ая сахароза, 50 мм трис рН 8, лизоцима 10 мг/мл, 40 мм тиокарбамид). Передача решения в 2 мл пробирок с винтовой крышкой и инкубировать в течение 2 ч при 37 ° C.
      3. 500 мкл раствора II (25%-ая сахароза, 50 мм трис pH 8, 50 мм ЭДТА). После закупорить вверх и вниз 5 - 10 раз, добавить бисер циркония до объем 500 мкл в трубе.
      4. Приступить к лизис клеток с гомогенизатора (3 x 6000 об/мин, 45 s) с 1 мин инкубации на льду между каждым раундом.
      5. Добавить 5 мкл 20 mg/ml протеиназы K (финал 100 мкг/мл) и Проинкубируйте образцы на ночь при 55 ° C.
      6. Добавьте 1 mL холодной фенол/хлороформ/изоамилового спирта (25:24:1) под вытяжного шкафа. Смешайте образцы vortexing прежде чем приступить с центрифугированием в RT и 16500 x г за 30 мин.
      7. После центрифугирования восстановления водной фазе и добавить равный объем раствора холодной фенол/хлороформ/изоамилового спирта под капотом. Центрифугуйте образцы на 16500 x г за 30 мин до восстановления водной фазе снова.
      8. Добавьте 0.7 объем RT изопропанола в восстановленной водяной участок под вытяжного шкафа. Инвертировать медленно трубы позволяют ДНК осадков и инкубировать 5 мин на RT. Затем центрифуги для 10 мин на 16500 x g и RT.
      9. Удалить супернатант и помыть лепешка с 500 мкл под капотом на 70% спирте. Центрифуга трубы для 10 мин на 16500 x g на RT перед удалением этанола. Проинкубируйте втечение 10 мин разрешить оставшиеся испарения спирта.
      10. Наконец приостановите Пелле ДНК в 100 мкл DNase/РНКазы свободной воды. Определите доходность и чистоты ДНК, ДНК с спектрофотометром.
      11. Удаление 1 мкг с 10 U ЛАСЦ геномной ДНК и дайджест на одну ночь для югу клонирования Tn вставки сайт. Используйте протокол изготовителя.
        Примечание: Claя фермент является одним из наиболее высоко представлены энзимов ограничения в геном abscessus м. (2 173 места ограничения). Claя ограничения сайта также встречается в Tn последовательности вверх по течению, канамицин сопротивления кассеты Tn мутант. Таким образом subcloning я опосредованной Claпозволяет идентифицировать Tn вставки сайт.
    2. Югу клонирование плазмиды геномной ДНК, содержащие Tn
      Примечание: Прежде чем перейти с Tn-subcloning в 2686 bp плазмида pUC19 ампициллин стойкие, добавьте Claя ограничения узла в узле несколько клонирования плазмиды. Последовательность pUC19 плазмиды можно найти по этой ссылке https://www.addgene.org/50005/sequences/.
      1. Следуйте производителя в протокол к дайджест pUC19 плазмиду с EcoRI и ХиндIII, который выпускает фрагмент 51 bp и фрагмент 2635 bp. очистить двойной переваривается вектор с коммерческой очистки комплект ПЦР для ликвидации 51 bp выпустила фрагмент.
      2. Смешайте 1 мкл (концентрация 25 пмоль/мкл) двух взаимодополняющих олигонуклеотиды (5 'СЛКП Тата AGATCT Тата ATCGAT TATA3» и 5 'ААТ TAA TAA ВРЧ ATT ATA Ага TCT ТАТ A3») 28 bp каждый содержащий Claя ограничения сайта и на концах ХиндIII и EcoR Я места ограничения. Тепло на 100 ° C в течение 10 мин и затем прохладной для того, чтобы связать их.
      3. Дайджест парных праймеры, EcoRI и ХиндIII согласно протоколу от производителя.
      4. Перевязать 150 нг EcoRяХиндIII-только pUC19 плазмиду с различные концентрации парных грунтовки (50 пмоль/мкл, 25 пмоль/мкл, 2.5 пмоль/мкл) за 1 час на RT с 1 U T4 ДНК лигаза в окончательном объеме 20 мкл. Проверка клонирования на другой ферментативного пищеварения.
      5. Дайджест модифицированных плазмида с Claдля 2 ч при 37 ° C.
      6. Перевязать 50 нг Claя ограничен pUC19плазмиды и 50 нг геномной ДНК усваивается Claя за 1 час на RT с 1 U T4 ДНК лигаза в 10 мкл.
      7. Перейти к трансформации electrocompetent бактерии E. coli с 5-10 мкл перевязки (2500 V, 200 Ом, 25 МКФ). Выберите клонов на плиты агара LB, дополненная канамицин 50 мкг/мл и 50 мкг/мл ампициллин выбрать бактерий, принимая плазмид с частями Tn последовательностей.
      8. Расти устойчивыми клонов на ночь в жидкой среде LB с соответствующим антибиотиком выбора (50 мкг/мл канамицин и ампициллин 50 мкг/мл).
      9. Извлечь ДНК плазмиды. Проверить наличие вставки путем ферментативного ограничения и последовательность 3' концу Tn для идентификации нарушается гена с олигонуклеотида (5' TTGACGAGTTCTTCTGA 3') соответствует последних 17 пар оснований канамицин Tn Кассета сопротивления.
      10. Совместите последовательность против штамма GO 06 м. abscessus , выполняя взрыва нуклеотидов (Взрыв-N).

2. РНК добыча внутриклеточные микобактерии для Rnaseq анализа

Примечание: Это занимает 4 месяцев для экспериментов и 4 месяца для RNAseq анализа.

  1. Совместное культура амеб-м. abscessus в пакетах
    Примечание: В следующем эксперименте, Сопредседатель культуры осуществляется в 50 мл трубки с агитации в пользу бактерий к контактам ячейки.
    1. Расти м. abscessus в 7 Ч 9 средних с 0,2% глицерина, 1% глюкозы к середине экспоненциальной фазе при 120 об/мин.
    2. Промойте бактерий дважды с 10 мл буфера переменного тока.
    3. Оценки концентрации бактерий путем измерения ОД600nm (1 OD600= 4 x 108 микобактерий). Добавьте 8,5 x 108 микобактерий 8,5 х 106 амеб в 10 мл среды переменного тока.
    4. Инкубируйте 1 час при 30 ° C с нежным агитации (около 80 об/мин).
    5. Урожай клетки центрифугированием в 253 x g 12 мин удалить супернатант и приостановить клетки в 10 мл буфера переменного тока. Повторите это мыть два раза больше.
    6. Ресуспензируйте клетки в 10 мл буфера переменного тока, содержащие 50 мкг/мл амикацин ликвидировать внеклеточного бактерий и проинкубируйте 4 ч при 30 ° C с нежным агитации (80 мин). Дважды снова Вымойте клетки.
  2. Извлечение общего РНК от внутриклеточного abscessus м.
    Примечание: Выполните шаги 2.2.1–2.2.3 под зонт за счет использования токсичных реагентов.
    1. После окончательного мойки Ресуспензируйте зараженных амеб в 4 мл холодного раствора III (Таблица 3) с экспромтом 280 мкл β-меркаптоэтанол сорвать амебы. Это шаг тиоцианат (GTC) Гуанидиновые. Поддерживать подвеска на льду на 10 мин центрифуги ячейки lysate 30 мин при 2,396 x g и 4 ° C для пеллет выпустила внутриклеточных бактерий.
    2. Удалить супернатант и приостановить бактериальных Пелле в 1 мл холодного раствора III. Урожай бактерий на 2396 x г за 30 мин при 4 ° C. Ресуспензируйте гранулы в 1 мл буфера извлечения и передачи в 2-мл пробирку винт, содержащие циркония бусины (до 500 мкл градации трубки). Хранить трубы для по крайней мере 24 часа при температуре-80 ° C.
      Примечание: Хранение в лизис реагент позволяет инактивации полиадениновый и Сотовый распада.
    3. Когда готов к использованию, оттепель образцы на льду и лизируют их с гомогенизатор, выполнив два раунда при 6000 об/мин для 25 s, следуют один раунд при 6000 об/мин для 20 s с инкубации 1 мин на льду между каждым раундом.
    4. Для охлаждения образца, Инкубируйте их на льду за 10 мин. Затем добавьте 200 мкл хлороформ, разбавленных в изоамилового спирта. После vortexing образцы для 1 мин, центрифуги для 15 мин на 16 500 x g и 4 ° C.
    5. Добавить 0,8 мл холодного изопропанола в водной фазе и Проинкубируйте образцы для 2-3 ч при 20 ° C. Центрифугуйте образцы на 35 мин в 16,500 x g и 4 ° C. Выбросите супернатант.
    6. Помыть лепешка РНК, добавив 500 мкл холодный 70% этанола (не смешивать).
    7. Центрифугуйте образцы на 16500 x g 10 мин для удаления этанола. Аспирационная решение и сушат в центробежных концентратор.
    8. После высыхания Ресуспензируйте гранулы в 100 мкл DNase/РНКазы свободной воды.
      Примечание: Образцы должны рассматриваться дважды с DNases для удаления загрязнений ДНК согласно рекомендациям изготовителя.
    9. Оценить целостность РНК на геле агарозы и подтвердите путем измерения числа целостности РНК (Рин) и рибосомных соотношение с методом на основе чипа капиллярного электрофореза.
      Примечание: RIN учитывает весь электрофоретической трассировки. RIN программный алгоритм позволяет для классификации всего РНК, основанные на нумерации системы от 1 до 10, где 1 является наиболее деградированных профиль и 10 является наиболее нетронутыми. Продолжить с подготовкой библиотеки cDNA, промывки должно быть над рибосомных соотношение [28S/18] как можно и 8 идеальное значение 2, в зависимости от организма и его особенности.
    10. Хранение образцов РНК-80 ° c до подготовки кДНК библиотеки для виртуализации.
  3. Подготовка кДНК библиотеки
    1. Чтобы продолжить с подготовкой библиотеки, используйте коммерчески доступных cDNA синтеза комплект (Таблица материалы) с использованием протокола производителя.
    2. Проверьте в библиотеку для концентрации и качества на чипе ДНК.
      Примечание: Более точного и аккуратного количественная оценка может выполняться с чувствительной на основе люминесцентных количественный анализы.
  4. Секвенирование библиотеки
    1. Нормализовать образцы 2 Нм и приступить к мультиплексирования по данным ячейки организации потока.
    2. Денатурируйте образцы в концентрации 1 Нм, используя 0,1 Н NaOH для 5 мин на RT.
    3. Развести образцы в 10 вечера. Загрузите каждый образец на ячейку потока в 10 вечера.
    4. Продолжите последовательность с помощью высокопроизводительного секвенирования системы, которая позволяет крупномасштабных геномики. Здесь работать был запуск SRM (SR: одного чтения, PE: Парные конец читает, M: мультиплексированных образцы) 51 циклов с 7 индекс базы читать.
    5. Оцените качество виртуализации с внешней FastQC программы13.
    6. После обрезки адаптер последовательностей, продолжите чтения ряды против ссылку генома. Совместите против геном эукариотической клетки для оценки загрязнения образца и, при необходимости, действовать с отделкой-бактериальные читает.
  5. Статистический анализ
    1. Используйте несколько программ доступны онлайн для определения наборов дифференциально выраженной генов: R программное обеспечение, Bioconductor пакеты, включая DESeq2 и PF2tools пакет (версии 1.2.12) разработан на платформе «транскриптом et Epigénome» (Пастер Институт, Париж).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

М. abscessus имеет способность противостоять и избежать бактерицидной ответы макрофагов и экологических простейшие как амебы. М. abscessus выражает Факторы вирулентности при выращивании контакте амёб, что делает его более вирулентными на мышах4. Первая цель этих методов было определить гены присутствуют в . м. abscessus , позволяя его выживания и умножения внутри амёбы.

Для этог...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Поведение м. abscessus гораздо более похож на поведение патогенных SGM таких микобактерий туберкулеза , чем любой другой микобактерий, принадлежащие РГМ2. Ключевым элементом в патогенности SGM является их способность выжить или даже размножаться внутри антиген представляющих клеток, такие как макрофаги и дендритные клетки.

М. abscessus приобрела определенные геномной преимущества, как показано в общей последовательности ее геном

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы признаем значительно Pr. Эрл Рубин (Гарвардской медицинской школы, Бостон, США) за драгоценный подарок мутант библиотека и д-р Бен Маршалл (факультет медицины, Университет Саутгемптона, Великобритания) для исправления рукописи. Мы признаем значительно французской ассоциации пациента муковисцидоз «Вэнкр la Mucoviscidose» и «L'Association Грегори Лемаршалем» для их финансовой поддержки (RF20150501377). Мы также благодарим Национальное агентство для научных исследований (программа DIMIVYR (АНР-13-BSV3-0007-01) НРУ) и округов Иль (Domaine d'Intérêt мажорных Maladies Infectieuses et Emergentes) для финансирования докторантура стипендий V.L-м. Л. л является докторской диссертации от «высшего образования Ministère де et де ла исследований».

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Наименование материала/оборудования
24-луночные планшетыThermofisher11874235
96-луночные планшетыThermofisher10687551
Beadbeater BertinPrecellys 24
БиоанализаторAgilent
Genepulser XcellBiorad
Nanodrop спектрофотометр 2000Thermofisher
QuBit флуориметрThermofisherQ33226
шарики циркония/кремнеземаизделия Biospec11079101ZБусины
Название реагента/клеток
Acanthamoeba  castellanii  ATCC30010штамм
Амикацин Mylan150927-Aпорошок
B-меркаптоэтанол Sigma-AldrichM6250раствор
CaCl2Sigma-AldrichC1016>93% гранулированный безводный
хлороформ Fluka25666раствор
ClaIферментNew England BiolabsR0197S
Columbia agar Biomerieux4304190 мм
D-глюкозаSigma-AldrichG8270 порошок
DMEM Thermofisher11500596среде
без ДНКазы и РНКазы воды Invitrogen10977-035раствор
E.  coli electrocompetent Thermofisher18265017бактерии
ЭДТАSigma-AldrichE4884порошок
Escherichia coli  Клинический изолируютперсональные стоковыебактерии
Fe(NH4)2(SO4)-6H20 EMS15505-40сульфатный раствор 4% водный Фетальный
сывороткаGibco10270сыворотка
ГлицеринSigma-AldrichG5516раствор
тиоцианата гуанидии  EuromedexEU0046-Dпорошок
Изопропанол Sigma-AldrichI9516раствор
J774.2 макрофаговSigma-AldrichJ774.2Штамм
канамицин Sigma-Aldrich60615порошок
KH2PO4Sigma-AldrichP0662Одноосновный, безводный
LB жидкая среда Invitrogen12795-027порошок
ЛизоцимРош10837059001порошок
MgSO4LabosiM275pur
Microbank TM (криопробирки с бусинами)Pro-Lab DiagnosticPL.170/M
Middlebrook 7H11 среднийSigma-AldrichM0428порошок
Middlebrook 7H9 среднийThermofisher11753473порошок
Mü ller-Hinton агарBiorad3563901порошок
N-лаурил-саркозинMerckS37700 416порошок
Na2HPO4-7H2OSigma-AldrichS939098-102%
Phenol/chloroforme Sigma-Aldrich77617раствор
протеиназы KThermofisherEO0491порошок
протеозы пептонBD211684ферментативный расщепление тканей животных
pUC19 плазмидаNew England Biolabs54357плазмида
SDS  20%Biorad1610418раствор
цитрат натрияCalbiochem567446порошок
ThioureaSigma-Aldrich88810порошок
TrisSigma-Aldrich154563порошок
Trizol Thermofisher12044977раствор
Tween 80Sigma-AldrichP1754 решение
Экстракт дрожжей BD212750
Kit
AMBION DNase kit Thermofisher10792877набор
DNA Agilent ChipAgilent5067-1504набор
GeneJET Plasmid Miniprep kit ThermofisherK0503набор
PureLink PCR Purification НаборInvitrogenK310001набор
Quant-It" набор для анализовThermofisherQ33140/Q32884набор
T4 ДНК-лигаза Набор InvitrogenY90001
TruSeq Stranded RNA LT prep kitIllumina15032611kit
теленок

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Qvist, T., et al. Comparing the harmful effects of nontuberculous mycobacteria and Gram negative bacteria on lung function in patients with cystic fibrosis. Journal of Cystic Fibrosis. 15 (3), 380-385 (2016).
  2. Roux, A. -L., et al. The distinct fate of smooth and rough Mycobacterium abscessus variants inside macrophages. Open Biology. 6 (11), 160185(2016).
  3. Castañeda-Sánchez, J., et al. Defensin Production by Human Limbo-Corneal Fibroblasts Infected with Mycobacteria. Pathogens. 2 (4), 13-32 (2013).
  4. Bakala N'Goma, J. C., et al. Mycobacterium abscessus phospholipase C expression is induced during coculture within amoebae and enhances M. abscessus virulence in mice. Infection and Immunity. 83 (2), 780-791 (2015).
  5. Ripoll, F., et al. Non mycobacterial virulence genes in the genome of the emerging pathogen Mycobacterium abscessus. Public Library of Science One. 4 (6), 5660(2009).
  6. Tailleux, L., et al. Constrained intracellular survival of Mycobacterium tuberculosis in human dendritic cells. Journal of Immunology. 170 (4), 1939-1948 (2003).
  7. Jacquier, N., Aeby, S., Lienard, J., Greub, G. Discovery of new intracellular pathogens by amoebal coculture and amoebal enrichment approaches. Journal of Visualized Experiments. (80), e51055(2013).
  8. Adékambi, T., et al. Amoebal coculture of "Mycobacterium massiliense" sp. nov. from the sputum of a patient with hemoptoic pneumonia. Journal of Clinical Microbiology. 42 (12), (2004).
  9. Rubin, E. J., et al. In vivo transposition of mariner-based elements in enteric bacteria and mycobacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (4), 1645-1650 (1999).
  10. Laencina, L., et al. Identification of genes required for Mycobacterium abscessus growth in vivo with a prominent role of the ESX-4 locus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (5), 1002-1011 (2018).
  11. Rowbotham, T. J. Isolation of Legionella pneumophila from clinical specimens via amoebae, and the interaction of those and other isolates with amoebae. Journal of Clinical Pathology. 36 (9), 978-986 (1983).
  12. Moffat, J. F., Tompkins, L. S. A quantitative model of intracellular growth of Legionella pneumophila in Acanthamoeba castellanii. Infection and Immunity. 60 (1), 296-301 (1992).
  13. FastQC program. , Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2018).
  14. Ripoll, F., et al. Non mycobacterial virulence genes in the genome of the emerging pathogen Mycobacterium abscessus. Public Library of Science One. 4 (6), 5660(2009).
  15. Choo, S. W., et al. Genomic reconnaissance of clinical isolates of emerging human pathogen Mycobacterium abscessus reveals high evolutionary potential. Science Reports. 4, (2015).
  16. Greub, G., Raoult, D. Microorganisms Resistant to Free-Living Amoebae. Clinical Microbiology Reviews. 17 (2), 413-433 (2004).
  17. Kicka, S., et al. Establishment and Validation of Whole-Cell Based Fluorescence Assays to Identify Anti-Mycobacterial Compounds Using the Acanthamoeba castellanii - Mycobacterium marinum Host-Pathogen System. Public Library of Science One. 9 (1), 87834(2014).
  18. Thomas, V., Loret, J. -F., Jousset, M., Greub, G. Biodiversity of amoebae and amoebae-resisting bacteria in a drinking water treatment plant. Environmental Microbiology. 10 (10), 2728-2745 (2008).
  19. Lamrabet, O., Medie, F. M., Drancourt, M. Acanthamoeba polyphaga-enhanced growth of mycobacterium smegmatis. Public Library of Science One. 7 (1), (2012).
  20. Cosson, P., Soldati, T. Eat, kill or die: when amoeba meets bacteria. Current Opinion in Microbiology. 11 (3), 271-276 (2008).
  21. Lelong, E., et al. Role of magnesium and a phagosomal P-type ATPase in intracellular bacterial killing. Cellular microbiology. 13, November 2010 246-258 (2011).
  22. Ouertatani-Sakouhi, H., et al. Inhibitors of Mycobacterium marinum virulence identified in a Dictyostelium discoideum host model. Public Library of Science One. 12 (7), 0181121(2017).
  23. Trofimov, V., et al. Antimycobacterial drug discovery using Mycobacteria-infected amoebae identifies anti-infectives and new molecular targets. Science Reports. 8 (1), 3939(2018).
  24. Cardenal-Muñoz, E., Barisch, C., Lefrançois, L. H., López-Jiménez, A. T., Soldati, T. When Dicty Met Myco, a (Not So) Romantic Story about One Amoeba and Its Intracellular Pathogen. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 529(2017).
  25. Delafont, V., et al. First evidence of amoebae-mycobacteria association in drinking water network. Environmental Science & Technology. 48 (20), (2014).
  26. Cirillo, J. D., Falkow, S., Tompkins, L. S., Bermudez, L. E. Interaction of Mycobacterium avium with environmental amoebae enhances virulence. Infection and Immunity. 65 (9), (1997).
  27. Stamm, L. M., et al. Mycobacterium marinum escapes from phagosomes and is propelled by actin-based motility. Journal of Experimental Medicine. 198 (9), 1361-1368 (2003).
  28. Groschel, M. I., Sayes, F., Simeone, R., Majlessi, L., Brosch, R. ESX secretion systems: mycobacterial evolution to counter host immunity. Nature Reviews Microbiology. 14 (11), 677-691 (2016).
  29. Pym, A. S., et al. Recombinant BCG exporting ESAT-6 confers enhanced protection against tuberculosis. Nature Medicine. 9 (5), 533-539 (2003).
  30. Hsu, T., et al. The primary mechanism of attenuation of bacillus Calmette-Guerin is a loss of secreted lytic function required for invasion of lung interstitial tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (21), 12420-12425 (2003).
  31. Smith, J., et al. Evidence for pore formation in host cell membranes by ESX-1-secreted ESAT-6 and its role in Mycobacterium marinum escape from the vacuole. Infection and Immunity. 76 (12), 5478-5487 (2008).
  32. Schnappinger, D., et al. Transcriptional Adaptation of Mycobacterium tuberculosis. within Macrophages. Journal of Experimental Medicine. 198 (5), 693-704 (2003).
  33. Fontan, P., Aris, V., Ghanny, S., Soteropoulos, P., Smith, I. Global Transcriptional Profile of Mycobacterium tuberculosis during THP-1 Human Macrophage Infection. Infection and Immunity. 76 (2), 717-725 (2008).
  34. Miranda-CasoLuengo, A. A., Staunton, P. M., Dinan, A. M., Lohan, A. J., Loftus, B. J. Functional characterization of the Mycobacterium abscessus genome coupled with condition specific transcriptomics reveals conserved molecular strategies for host adaptation and persistence. BMC Genomics. 17 (1), 553(2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи