Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Свет лист флуоресцентной микроскопии для изучения мышиных сердца

8.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/57769

⸱

15 сентября 2018 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, University of California Los Angeles, 2Department of Bioengineering, University of Texas at Arlington, 3School of Optical and Electronic Information, Huazhong University of Science and Technology, 4Department of Biomedical Engineering, OSHU

В этой статье

Краткое содержание

Это исследование использует технику микроскопии (LSFM) свет лист флуоресценции двусторонняя освещения в сочетании с оптическим выравниванием учиться мышиных сердца.

Аннотация

Свет лист флуоресцентной микроскопии широко использовался для приобретения быстрого изображения с высоким разрешением осевой от микрометра миллиметровой шкалой. Традиционные методы свет лист связаны с использованием единого освещения пучка ортогонально направлены на образец ткани. Изображения крупных выборок, которые производятся с использованием единого освещения пучка содержат полосы или артефактов и страдают от сокращения резолюции из-за рассеяния и поглощения света в ткани. Это исследование использует двусторонняя освещения пучка и упрощенная ЯСНОСТИ оптических очистка техника для мышиных сердца. Эти методы позволяют глубже изображений путем удаления липиды из сердца и производят большое поле изображений, больше, чем 10 x 10 x 10 мм3. В результате, эта стратегия позволяет нам определить размеры желудочков, отслеживать линии сердца и локализовать пространственное распределение сердца специфических белков и каналы иона от послеродовой для сердца взрослых мыши с достаточным контрастом и резолюции.

Введение

Микроскопии флуоресцирования свет листа была впервые разработана в 1903 году техника и сегодня используется как метод для изучения экспрессии генов, а также производить 3-D или 4-D моделей тканей образцы1,2,3. Этот метод визуализации использует тонкий лист света для освещения в одной плоскости образца так, что только что самолет захвачен детектора. Образца, затем могут быть перемещены в осевом направлении-захватить каждый слой, один раздел в то время и визуализации трехмерной модели после пост-обработки изображений4. Однако из-за поглощения и рассеяния фотонов, LSFM была ограничена образцов, которые являются либо несколько микрон или оптически прозрачные1.

Ограничения LSFM привели к обширные исследования организмов, которые имеют тканей, которые оптически прозрачным, как у рыбок данио. Исследования с участием сердца развития и дифференциации часто проводятся на данио рерио, поскольку есть сохранены генов между людьми и данио рерио5,6. Хотя эти исследования привели к достижениям в кардиологических исследованиях, связанных с кардиомиопатии6,7, по-прежнему существует необходимость в проведении аналогичного исследования высокого уровня организмов, таких как млекопитающие.

У млекопитающих сердечной ткани представляет собой проблему, из-за толщины и непрозрачность ткани, поглощение за счет гемоглобина в красных кровяных клеток и чередование, которое происходит из-за одностороннего освещения образца под традиционные методы LSFM1 , 8. чтобы компенсировать эти ограничения, мы предложили использовать двусторонняя освещения и упрощенная версия ЯСНОСТИ техника9 , в сочетании с показателем преломления соответствующие решения (колеса). Таким образом эта система позволяет для визуализации образца, это больше, чем 10 x 10 x 10 мм3 при поддержании хорошего качества резолюции в осевом и боковых плоскостей8.

Эта система была впервые калибруется с помощью флуоресцентных бусы, организовал в различных конфигурациях в стеклянных трубок. Затем система использовалась для изображения послеродовой и взрослых мышиных сердца. Во-первых послеродовой мыши сердце было imaged на 7 дней (P7) выявить полости желудочков, толщина стены желудочков, клапан структур и наличие trabeculation. Во-вторых было проведено исследование для определения ячеек, которые будут дифференцироваться в кардиомиоцитов, используя послеродовой мыши сердца на 1 день (P1) с КРР меченых кардиомиоцитов и желтый флуоресцентный белок (рекламы ЯФП). Наконец взрослых мышей на 7,5 месяцев были образы наблюдать присутствие почечной наружной медуллярного калия (ROMK) каналы после генной терапии8.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры, связанные с использованием животных были одобрены организационного обзора комитетов (IACUC) в университете Калифорнии, Лос-Анджелес, Калифорния.

1. Визуализация системы установки

Примечание: См. рис. 1 и рис.

  1. Извлечение непрерывная волна лазера (CW) с 3 длинах волн: 405 нм, 473 Нм и 532 нм. 2 место-зеркала (M1 и M2) 150 мм друг от друга и привести их в соответствие с их самолеты зеркало под углом 45° к лучу.
    Примечание: Этот шаг выполняется перенаправление лазера от двусторонняя освещения установки. Результате луч будет в том же направлении, как первоначальный луча.
  2. Передайте луча через диаметром 25-мм ирисовой диафрагмой/отверстие (PH), фильтр нейтральной плотности диаметром 50 мм (NDF) с оптической плотности диапазоном 0 - 4.0, расширитель луча (BE), щели (S) 30 мм с шириной ~ 0 - 6 мм и зеркало (м3) , все расположены 150 мм друг от друга. Поместите зеркало с ее плоскости зеркало под углом 45° к лучу.
  3. Передайте луча через 50: 50 splitter луча, помещены 150 мм от м3. Поместите зеркало (M6) 150 мм от splitter луча и выровнять таким образом, чтобы его плоскости зеркало под углом 45° к Луч, который излучается в прямом направлении. Используйте отражение луча для формирования одной стороне листа свет двойной освещение.
  4. Поместите зеркало (M4) 150 мм от splitter луча и выровняйте его так, что его плоскость зеркало под углом 45° к лучу, породившего под углом в 90° от splitter луча. Разместите второй зеркало (M5) 150 мм от M4 и выровнять таким образом, чтобы его плоскости зеркало под углом 45° для света, отраженного от M6. Использование света, испускаемого от M5 сформировать на второй стороне листа свет двойной освещение.
  5. Настройка системы двусторонняя освещения в симметричной моды (см. Рисунок 1). Поместите один Цилиндрические линзы (CL1) [диаметр (d) = 1; фокусное расстояние (f) = 50 мм] 150 мм соответствует луча, излучаемый M5 на одной стороне и другой идентичные Цилиндрические линзы (CL2) 150 мм соответствует луча, излучаемый M6 на другой стороне сету двойной освещение p. место 2 зеркала (M7 и M8) каждый соответствует Цилиндрические линзы на расстоянии 50 мм, чтобы отразить луч на 90 °.
  6. Формируют ахроматические Дуплет из пары линз. Поместите первый объектив, L1 (d = 1; f = 100 мм), 100 мм от М7 и второй объектив, L2 (d = 1; f = 60 мм), 160 мм от L1. Повторите это на другой стороне двойной освещение с одинаковыми линзами (L3, L4) размещены на одинаковом расстоянии от M8.
  7. Место зеркала, M9 и M10, 60 мм от линзы L2 и L4, соответственно и в соответствии с пучка. Место освещение целей, OL1 и OL2 (d = 2; f = 150 мм), 150 мм от M9 и M10 и в соответствии с пучка. Света, испускаемого от целей образует свет лист для изображений образцов.
  8. Используйте трехмерный принтер для печати держателя образца из акрилонитрил бутадиен стирола (ABS). Вставлять кусок стекла [преломления (RI) = 1.4745] на каждой стороне камеры, перпендикулярно освещения пучка, чтобы свести к минимуму преломления рассогласовывать. Равномерно разместите камеры между балки, излучаемый объективов.
  9. Установка стерео микроскоп с 1 X увеличение объективной и научно комплементарный металло-оксидный полупроводник (sCMOS) камеры перпендикулярно освещения плоскости (см. Рисунок 2).

2. изображений системы калибровки

  1. Получения флуоресцентных шарики полистироля, которые являются 0,53 мкм в диаметре.
  2. Подготовьте образец флуоресцентные шарик путем разбавления шарик решения в соответствующие решения преломления (колеса) с указывая агарозы 1% температура расплава к 1: 150, 000. Вырежьте кусок трубки боросиликатное стекло с внутренним диаметром 12 мм и наружным диаметром 18 мм, длиной 30 мм.
    Примечание: Трубки боросиликатное стекло используется для сопоставления преломления (1,47).
  3. Смешать образец разбавленный шарик с агарозы 1% и Пипетка шарик/агарозы решения в трубки боросиликатное. Разрешить агарозы для закрепления при комнатной температуре (23 ° C).
  4. ABS камеры (от шага 1.7) заполняют раствором 99,5% глицерина. Поместите трубки боросиликатное стекло, содержащий бусины внутри камеры. Место ABS камеры в системе визуализации, так что это в центре гауссова пучка, созданных системой двойной освещения.
  5. Придаем 3-D моторизованных трансляционная стадии трубки боросиликатное стекло для контроля движения и ориентации образца в зале ABS (см. дополнительный рисунок 1).
  6. Получение изображений с помощью камеры sCMOS со скоростью 30 кадров в секунду (fps). Используя контроллер двигателя, переместить выборки 1 мм в направлении боковой и получить изображения на каждого приращения 1 мм, с помощью камеры sCMOS. Продолжайте, пока образ всей выборки.
  7. Стек изображений с помощью программного обеспечения для визуализации (см. Таблицу материалы). Измерьте точки распространения функция (PSF) системы с использованием этих изображений из бисера. Используйте этот ПСФ деконволюция во время обработки изображений в последующих шагах.

3. Пробоподготовка

  1. Вскрыть сердца от дикого типа P1 мыши и двойной гетерозиготных sarcolipin-Cre knockin мышь с Rosa26-рекламы ЯФП гена (SlnCre / +; R26рекламы ЯФП репортер / +) на P7.
    Примечание: Euthanasia была выполнена с использованием Пентобарбитал и методике, описанной в Роббинс et al. 10. Вскрытие проводилось согласно методике, описанной в национальном сердца, легких и крови института (NHLBI)10,11.
  2. Выполните химической очистки мышиных сердец, как описано Кевин Сена и др. 12.
    Примечание: Следующие шаги должны производиться в Зонта, поскольку токсичных химикатов.
    1. Промойте сердца в 1 x фосфат амортизированное saline (PBS) 3 x 10 мин. После ополаскивания, сердца в растворе параформальдегида 4% и инкубировать эти образцы на 4 ° C на ночь.
    2. Поместите образцы в 4% акриламида раствор, содержащий 0,5% w/v 2, 2'-Azobis дигидрохлорида. Разрешить образцы для инкубации при температуре 4 ° C на ночь. После ночи инкубации удалить образцы и инкубировать их при 37 ° C на 2-3 ч.
    3. Промойте образцы с PBS и затем разместить их в раствор 8% w/v лаурилсульфат натрия и 1,25% w/v борной кислоты. Проинкубируйте образцы при 37 ° C, до тех пор, пока они ясны. Это может занять несколько часов в зависимости от толщины образца. После очистки, удалите образцы и поместите их в 1 x фосфат амортизированное saline на 1 день.
    4. Подготовить преломления соответствующие решения с 40 g неионогенных плотность среды и градиента (см. Таблицу материалы) в 30 мл 0,02 М фосфатного буфера (PB), азид натрия 0,1% Tween-20 и 0,01%. Принести решение рН 7,5 с гидроксида натрия.
  3. Место очищается образца в колеса с преломления 1,46-1,48 и 1% агарозы. Вставьте образец трубки боросиликатное стекло и позволяют агарозы для закрепления при комнатной температуре (23 ° C).
  4. Придают 3-D моторизованных трансляционная стадии трубки боросиликатное стекло для контроля движения и ориентации образца в 3-D печати ABS камеры (см. дополнительный рисунок 1).

4. взрослых сердце изображений

  1. Inject 8,7 x 1012 вирусы типа аденоассоциированный вирус вектора 9 (AAV9), содержащий специфичные для сердечной тропонина T промоутер (cTnT) и Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП) в объеме 100 мкл в Вену хвост мыши 2-месячного дикого типа (C57BL/6).
    Примечание: AAV9 был разработан согласно методике, описанной в Юань et al. 13. это вызывает GFP для привязки к почечной наружной медуллярного калия канал (ROMK) производства AAV9-cTnT-ROMK-GFP (см. Таблицу материалы).
  2. Вскрыть сердца взрослого мыши в возрасте согласно методике, описанной в NHLBI117.5 месяцев. Подготовка образцов, используя шаги 3.1-3.3.
  3. Подключите контроллер двигателя моторного привода. Прикрепите привод для трубки боросиликатное стекло для управления движением и ориентации образца в 3-D печатных ABS камеры.
  4. Положение образца, так что это в центре гауссова пучка, созданных системой двойной освещения. Получение изображений с помощью камеры sCMOS в размере 100 fps.
  5. Используя контроллер двигателя, переместить выборки 1 мм в осевом направлении и получить изображения на каждого приращения 1 мм с sCMOS камерой. Продолжайте, пока образ всей выборки.
    Примечание: Система контролируется специально разработанной инструмент контроль программного обеспечения.
  6. Стек изображений с помощью программного обеспечения для визуализации (см. Таблицу материалы). Разработка трехмерных изображений, используя эти стеки изображений и визуализации программного обеспечения14. Deconvolve ФСФ из шага 2.6 с полученное изображение стека. Значение интенсивности пикселей порог для наблюдения контуры сердца и добавить псевдо-цвет изображения, основываясь на этой серой шкале интенсивности.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Метод, описанный здесь используется двусторонняя освещения пучка, в сочетании с оптическим выравниванием образцов ткани сердца мыши для достижения глубокого изображений глубину и объем изображений с достаточной разрешающей (рис. 1). Для калибровки системы, флуоресцентный бусины были размещены внутри стеклянных трубок и системы обработки изображений. Бусины были затем образ визуализируется в плоскости x-y плоскости y-z, и в плоскости x-z, чтобы получить точку ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

LSFM система и метод, описанный здесь использует двусторонняя освещения пучка, в сочетании с оптическим выравниванием изображение сердца мыши на послеродовой и взрослых этапах ее развития. Традиционный одноместный освещения пучка страдает от фотон рассеяние и поглощение через ткань толще и более крупные образцы1,3. Двусторонняя балки обеспечивают более равномерное освещение образца, тем самым к минимуму эффект чередования и другие артефакты, которые часто видели ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Авторы хотели бы выразить признательность Тхао Нгуен и Atsushi Nakano из Калифорнийского университета для предоставления мышей образца изображения. Это исследование было поддержано грантов низ HL118650 (для Tzung K. Hsiai), HL083015 (для Tzung K. Hsiai), HD069305 (для N. C. Чи и Tzung к Hsiai.), HL111437 (для Tzung K. Hsiai и N. C. Чи), HL129727 (для Tzung K. Hsiai) и университета штата Техас системы звезды, финансирование (для Juhyun Ли).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
CW ЛазерныесвеченияLMM-GBV1-PF3-00300-05Возбуждение флуорофоров
Фильтр нейтральной плотностиThorlabsNDC-50C-4MКонтролирует количество поступающего света в систему
Ахроматический расширитель лучаThorlabsGBE05-AРасширяет луч света
Механическая щельThorlabsVA100CКонтролирует ширину луча
СветоделительThorlabsBS013Образует двухсветовой пучок
Стереомикроскоп с объективом 1XOlympusMVX10Используется для наблюдения образца
ORCA-Flash4.0 LT sCMOS камераHamamatsu PhotonicsC11440-42UИспользуется для получения изображений
Акрилонитрилбутадиенстирол (ABS)StratasysuPrintМатериал, используемый для 3D-печати держателя образца
Флуоресцентные полистирольные шарикиSpherotech IncPP-05-10Используется для калибровки системы визуализации
Трубка из боросиликатного стеклаCorningPyrex 7740Трубка для встраивания образца
ГлицеринFisher ScientificBP229-4Наполнитель для камеры образца
Фосфатно-солевой буферFisher ScientificBP39920Раствор для промывки мышиных сердец
ПараформальдегидЭлектронная микроскопия наукиRT-15700Первый инкубационный раствор
АкриламидWako ChemicalsAAL-107Смешан с 2,2'-Azobis dihydrochloride для второго инкубационного раствора для мышиных сердец
2,2'-Azobis dihydrochlorideWako ChemicalsVA-044Смешан с акриламидом для второго инкубационного раствора для мышиных сердец
Додецилсульфат натрия Sigma Aldrich71725Смешан с борной кислотой для третьего инкубационного раствора для мышиных сердец
Борная кислотаFischer ScientificA74-1Смешан с додецилсульфатом натрия для третьего инкубационного раствора для мышиных сердец
Sigma D2158Sigma AldrichD2158Смешан с PB, Tween-20 и азидом натрия в качестве раствора для согласования показателя преломления
Tween-20Sigma Aldrich11332465001Смешан с Sigma D2158, PB и азидом натрия в качестве раствора для согласования показателей преломления
Азиднатрия Sigma AldrichS2002Смешан с Sigma D2158, PB и Tween-20 в качестве раствора для сопоставления показателей преломления
Аденоассоциированный вирусный вектор 9 с кардиоспецифичным промотором тропонина Т, помеченный GFPVector BiolabsVB2045Экспрессирует GFP при связывании с
приводом серводвигателяThorlabsZ825BИспользуется для перемещения образца в осевом направлении в пределах светового листа
K-Cube Brushed DC Servo Motor ControllerThorlabsKDC101Подключается к приводу двигателя и управляет движением привода
AmiraFEI SoftwareN/AПрограммное обеспечение для визуализации для создания 2-D и 3-D изображений
технологии лазерного ROMK DC

Ссылки

  1. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  2. Lee, J., et al. 4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation. Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1679-1690 (2016).
  3. Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
  4. Huisken, J., Stainier, D. Y. Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology. Development. 136 (12), 1963-1975 (2009).
  5. Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovascular Research. 91 (2), 279-288 (2011).
  6. High, F. A., Epstein, J. A. The multifaceted role of Notch in cardiac development and disease. Nature Reviews Genetics. 9 (1), 49-61 (2008).
  7. Sachinidis, A. Cardiac specific differentiation of mouse embryonic stem cells. Cardiovascular Research. 58 (2), 278-291 (2003).
  8. Ding, Y., et al. Light-sheet fluorescence imaging to localize cardiac lineage and protein distribution. Scientific Reports. 7, 42209(2017).
  9. Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).
  10. Robbins, N., Thompson, A., Mann, A., Blomkalns, A. L. Isolation and excision of murine aorta; a versatile technique in the study of cardiovascular disease. Journal of Visualized Experiments. (93), e52172(2014).
  11. National Heart, L., Blood Institute, Standard Operating Procedures (SOP's) for Duchenne Animal Models. , (2015).
  12. Sung, K., et al. Simplified three-dimensional tissue clearing and incorporation of colorimetric phenotyping. Scientific Reports. 6, 30736(2016).
  13. Yuan, Z., Qiao, C., Hu, P., Li, J., Xiao, X. A versatile adeno-associated virus vector producer cell line method for scalable vector production of different serotypes. Human Gene Therapy. 22 (5), 613-624 (2011).
  14. FEI, Amira User's Guide. , Konrad-Zuse-Zentrum fur Informationstechnik. Berlin. 59-138 (2017).
  15. Gao, L., et al. Noninvasive imaging of 3D dynamics in thickly fluorescent specimens beyond the diffraction limit. Cell. 151 (6), 1370-1385 (2012).
  16. Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy. Nature Methods. 8 (9), 757-760 (2011).
  17. Ding, Y., et al. Integrating light-sheet imaging with virtual reality to recapitulate developmental cardiac mechanics. JCI Insight. 2 (22), (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

CLARITYsCMOS3D
Свет лист флуоресцентной микроскопии для изучения мышиных сердца
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.