Методическая статья

Оптогенетика идентификация типа нейронов с Optrode стекла в бодрствовать мышей

DOI:

10.3791/57781

⸱

28 июня 2018 г.

 ,  ,  , 
1Department of Physiology, Kanazawa Medical University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа представляет метод для выполнения optogenetic единичного надежно запись от бодрствования мыши, с помощью optrode на заказ стекла.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это является серьезной проблемой в нейробиологии как различные типы нейронов, работают в нейронных цепей. Последние достижения в Оптогенетика позволили идентификации типа нейронов в в естественных условиях электрофизиологических экспериментов в широком мозга. В Оптогенетика эксперименты важно доставить свет на сайт записи. Однако часто трудно доставить свет стимуляция глубоких мозга регионов от поверхности мозга. Особенно это трудно для стимуляции света для достижения глубоких мозга регионов, когда Оптическая прозрачность поверхности мозга является низким, как это часто бывает с записями из спать животных. Здесь мы описываем метод для записи Спайк ответы на свет от бодрствования мыши, с помощью optrode на заказ стекла. В этом методе свет доставляется через стеклянный электрод записи, так что это позволяет надежно стимулировать записанные нейрона с свет в глубоких мозга. Этот заказ optrode система состоит из доступных и недорогих материалов и легко собрать.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Центральная нервная система состоит из различных типов нейронов, которые имеют различные функции. Как работают эти различные типы нейронов в нейронной цепи является одной из основных проблем в неврологии. Однако во многих регионах мозга, это было невозможно отличить нейронов в vivo записи видов электрической деятельности, потому что нет никаких четкое различие в электрических Спайк сигнала, с некоторыми исключениями. Последние достижения в Оптогенетика сделали прорыв1,2. Использование трансгенных животных, в которые светочувствительных опсин (например, channelrhodopsin-2) выражается в конкретных типов нейронов, стало возможным различать типы нейронов эффективно в vivo записи3, 45,,6. В этих животных возбужденных нейронов с светочувствительные опсин, давая свет раздражители во время электрического записи, но другие нейроны не являются. Принудительным опсин нейронов, таким образом, легко отличаются от других типов нейрон их ответы на свет.

В Оптогенетика эксперименты важно доставить свет на сайт записи. Как неинвазивный метод свет часто направлен от поверхности мозга. Однако потому что сила света сокращает как он проходит через ткани мозга, трудно стимулировать глубокую мозга регионов от поверхности мозга. Особенно это трудно для стимуляции света для достижения глубоких мозга регионов, когда Оптическая прозрачность поверхности мозга является низким, как это часто бывает с записями из спать животных. Электрофизиологические эксперименты часто выполнены на наркотизированных животных, потому что движение тела вызывает шум в записи. Как хорошо документирована, однако, анестезии как известно изменить нейронных ответов7,8,9,10. Таким образом необходимо использовать спать животных с целью изучения нейронных ответов без искусственных эффектов анестезии. В отличие от экспериментов с наркотизированных животных электрофизиологические записи выполняются после восстановления от хирургии в экспериментах с животными проснулся. В период между хирургии и записи экссудата ткани часто накапливается на поверхности мозга и делает низкой оптической прозрачности поверхности мозга.

Здесь мы описываем метод для записи единичного записи из проснулся мыши, с помощью optrode стекла на заказ. В этом методе свет доставляется через стеклянный электрод записи, так что это позволяет надежно стимулировать записанные нейрон светом в глубоких мозга. Этот заказ optrode система состоит из доступных и недорогих материалов и легко собрать.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все процедуры выполняются согласно руководящим принципам физиологического общества Японии и с одобрения животное уход Комитета Канадзава медицинского университета.

1. Строительство Optrode подстаканник

Примечание: Для построения optrode подстаканник, используется коммерческих Электрододержатель (рис. 1A).

  1. Аккуратно выньте из стальной трубки для контроля давления от ствола держателя.
  2. Бурение, Расширьте отверстие на стороне сиденья ПИН в ствол держатель. Сделайте отверстие 3 мм в диаметре и 12 мм в глубину.
  3. Положить трубу из нержавеющей стали (диаметром 3 мм, толщина 0,5 мм и 8 мм в длину; Рисунок 1A 2) в отверстие.
  4. Вставка керамическая Сплит спаривания рукав для ⌀2.5 мм наконечником (1рис. 1A) в отверстие.
  5. Прикрепите ствола держателя электрода к L-образные пазы с эпоксидный клей.
  6. Сделайте отверстия (диаметром 3 мм) в пазы и прикрепить его к манипулятора с винтами.

2. Руководитель пост установки

  1. Подготовьте заказ головы пост из плат spacer. Сделать прокладку столбчатых плат в форме шестигранника с фрезера и разрезать его на 2 головы должности с пилой (Рисунок 1B). Сведение в нижней части головы пост с фрезера.
  2. Подготовьте трансгенных животных, в котором светочувствительные опсин выражается в конкретный нейрон типа для изучения. В этой работе используется трансгенные мыши (VGAT-ChR2 мышей), в котором ингибирующих нейронов Экспресс channelrhodopsin-2 (ChR2)11 .
  3. Анестезировать животное с смесь 0,3 мг/кг medetomidine, 4,0 мг/кг мидазолама и 5,0 мг/кг Буторфанол внутрибрюшинного администрацией. Чтобы подтвердить, что животное полностью под наркозом, проверьте его реакцию на хвост щипать.
  4. Поместите указатель мыши в стереотаксической рамы на грелку. Чистый, Стереотаксическая рама и отопления площадку с 70% спирта заранее. Место зубы в отверстие в баре укус и слегка затяните зажим нос. Исправьте обе стороны головы, с использованием уха баров. Когда руководитель фиксируется правильно ухо баров, затяните зажим нос. Применить глазной мази в глаза.
  5. Брить кожу головы с маленькие ножницы и очистите кожу головы ватным тампоном хлоргексидина глюконата. До операции стерилизуйте все должности хирургических инструментов и голова с автоклав (121 ° C, 15 мин).
  6. Вырезать головы вдоль средней линии с ножницами и задвиньте его в сторону. Сделайте разрез от задней части головы на глаза (примерно 20 мм). Удаление надкостницы с ватным тампоном, смоченным в 70% спирта и сухой черепа.
  7. Придаем головной пост манипулятора. Позиция головы пост плашмя на черепа вокруг bregma, с помощью манипулятора.
  8. Смесь мономера (4 капли), катализатор (1 капля) и полимерные (1 небольшая ложка) стоматологического цемента на небольшое блюдо, которое предварительно охлаждается в холодильнике. Положите стоматологического цемента (ниже 1 g) на лобной и теменной кости черепа, чтобы исправить главный пост с черепом.
  9. После стоматологического цемента становится трудно, удалите мышь от стереотаксической рамы. Положите мазь с антибиотиком на открытые участки кожи. Придать medetomidine антагонист (0,3 мг/кг) и антибиотиков (окситетрациклину; 20 мг/кг). Монитор мыши на тепло и место площадку в клетке до тех пор, пока она просыпается и вернуть его в клетку жилищного строительства.
  10. Дом животное в клетке индивидуального жилья с некоторыми обогащения устройством. Измените животного бумаги, постельных принадлежностей ежедневно чистоте клетке и предотвратить инфекцию. Тщательно контролировать ли животное показывает никаких признаков дискомфорта. Применить лидокаина в рану, при подозрении на любой боли. Администрирование Мелоксикам или carprofen один раз каждые 24 часа в течение 48 часов после того, как глава операции установки и краниотомии. Местные лидокаина могут быть предоставлены в дополнение, если НПВП не является адекватным.

3. acclimation

  1. Два дня (как минимум) после восстановления от наркоза, акклиматизироваться животных в состояние головы Исправлена запись камеры. Выполните адаптационного сессий по крайней мере 5 дней.
  2. Во время сессий acclimation место животного в зале записи с головы пост, крепится к струбциной на заказ. В ходе сессии, с тем чтобы ограничить движение крышка тела с заказной смолы половины трубку (рис. 1 c), с использованием 3D-принтер.
    Примечание: На 1 день, адаптационного сессия должна быть 5 минут длиной. Он затем увеличивается ежедневно до 10, 20, 40 и 60 мин для дней, 2, 3, 4 и 5, соответственно.
  3. В конце каждой сессии дать животного питания награду. Если животное борется непрерывно в течение адаптационного, Остановите сеанс.

4. краниотомии

Примечание: После адаптационного краниотомии производится над областью мозга для записи. Краниотомия выполняется в стереотаксической рамы под наркозом, как с головой после установки. После операции процедура такая же, как голову после установки.

  1. Перед краниотомии очистите черепа с ватным тампоном с хлоргексидина глюконата и 70% спирта.
  2. Тщательно очистите черепа через сайт записи зубной дрелью. Когда кость становится достаточно тонким, вырежьте его кончик скальпель и удалите его.
  3. Положите стоматологического цемента вокруг подвергаются региона с целью укрепления черепа.
  4. Обложка области подвергаются мозга с силиконовым клеем после стоматологического цемента становится трудно. Процедура после хирургии, как описано в шаге 2.8.

5. Электрофизиологические запись

  1. Разрешить животное, чтобы восстановить для по крайней мере 1 день после краниотомии перед выполнением электрофизиологических записи. Поместите животное в зале записи таким же образом, что это было сделано в ходе сессий acclimation, когда запись начинается.
  2. Сделать стеклянной пипетки из боросиликатного стекла капилляров (OD = 1.5 мм, ID = 0,9 мм, длина-90,0 мм) вытащил на электрод съемник. Их диаметр кончика составляет 2-3 мкм, и их сопротивление, 4-6 MΩ, когда они заполнены с 10 мм PBS. Длина электрода составляет 40 – 50 мм. В некоторых записях neurobiotin 2% добавляется 10 мм PBS.
  3. Придаем пипеткой наполненный стакан держатель на заказ optrode.
  4. Положите серебряной проволоки с покрытием Ag-Cl (0,2 мм в диаметре) в стеклянной пипетки. Подключите провод Серебряный ПИН через тонким покрытием электрические провода. Подключите ПИН-код к headstage усилитель записи.
  5. Подключите волоконно оптических патч-корд (ядро = 960 мкм, облицовки = 1000 мкм, NA = 0,63) с цирконием обойма (OD = 2,5 мм) в Сплит, спаривания рукав на держателе optrode. Нажмите патч-корд в рукав до кончика обойма контакты задней части стеклянной пипетки. Патч-корд поставляет свет (длина волны = 465 Нм) от LED. Светодиодный свет управляется водителем Светодиодные канальные.
  6. Удалите Клей силиконовый над краниотомии. Положите разогретые солевых (38 ° C) на поверхности мозга периодически, чтобы предотвратить поверхности мозга от пересыхания во время сеанса записи. При необходимости удалите оболочки острыми пинцетом.
  7. Вставьте Стеклянный электрод в ткани мозга с манипулятором. Контролировать сопротивление электродов при вставке. Когда сопротивление меньше, чем ожидалось, потому что наконечник электрода может быть поврежден, замените электрода. На глубине интерес Поиск и изолировать шипы одного подразделения путем регулировки глубины в шагах 2-5 мкм.
  8. После того, как единый блок изолированные, доставить светодиодный свет и наблюдать реакции на свет стимулы.
  9. Запишите нервной деятельности после идентификации типов клеток. Выполнение записи для 2-3 ч. Если запись производится на последовательных дней (максимум 2 дня), покрывают краниотомии с силиконовым клеем. Когда запись закончена, и жертву животное, получить должность головы и поместить его в ацетоне мыть и повторно использовать его.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Рисунок 2мы рассмотрели последствия размер чаевых и длины стеклянной пипетки на силы света на кончике пипетки (рисунок 2A-B). Силы света был измерен Измеритель оптической мощности, помещены 1 мм от кончика. Полная длина был установлен 50 ± 2 мм, когда размер чаевых варьируется, в то время как размер чаевых было присвоено 2,5 мкм, когда полная длина разнообразны. Хвостовик стеклянной пипетки был установлен до 8 мм...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Оптогенетика стала мощным инструментом в неврологии. Он был использован для определения конкретного нейрона видов в естественных условиях , а также манипулирования деятельности конкретных нейронов путей. Разъяснение нервной деятельности различных типов нейронов способствует пониманию механизма нейронных цепей. Здесь мы продемонстрировали метод доставить свет на сайт записи через стеклянный электрод в IC проснулся VGAT-ChR2 мышей.

Существует несколько важных шагов в методе описал. Во-п...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы были поддержаны японского общества по поощрению науки KAKENHI Грант JP16K11200 и 17H 02223 и Грант на исследования от медицинского университета Канадзава S2016-8 и C2017-3. Мы благодарим куда Yuhichi за его поддержку в принятии фотографии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Держатель электродовМолекулярный прибор1-HL-Uдержатель пипетки для микроэлектродного усилителя
Керамическая разъемная ответная втулкаThorlabsADAF1f2,5 мм наконечник
Прокладка печатной платыTeishin DenkiSPA-320f8,0 мм, длина 20,0 мм
Стереотаксическая рамка для мышейNarishigeSR-6M-HTСтереотаксические инструменты для мышей
МанипуляторNarishigeNAРучной манипулятор
SuperbondSun MedicalM: 204610557Стоматологический адгезивная смола цемент
Form2FormlabsNA3D принтер
Kwik-SilWPIKWIK-SILНизкотоксичный силиконовый клей
Капилляры боросиликатного стеклаNarishigeGD-1,5OD 1,5 мм, внутренний диаметр 0,9 мм, длина 90,0 мм
Волоконно-оптический патч-кордДорические линзыMFP_960/1000/2200-0.63_1m_FCM-ZF2.5Моноволоконный патчкорд, OD, 2,5 мм, сердечник = 960 мм, оболочка = 1000 мм, NA = 0,63
Подключенные светодиодные дорическиелинзыLEDC-1B_FCЦентральная длина волны = 465 нм, выходная мощность = 45 мВт (Core 960 mm 0,63 NA )
Драйвер светодиодаДорические линзыLEDRV_1CH_10001 канал Драйвер светодиодов, максимальная мощность = 1000 мА
Съемник электродовNarishigePB-7Двухступенчатый стеклянный пуллер для микропипеток
Боросиликатный стеклянный капиллярNarishigeGD-1.5Капилляр из болосиликатного стекла, OD, 1,5 мм, ID, 0,9 мм, длина 90,0 мм
GENTACINMSD CO., Ltd185711173Антибиотическая мазь
Terramycin®-LAZoetisG 333Окситетрациклин
Tg(Slc32a1- COP4*H134R/EYFP)8Gfng/JJackson Labs#14548VGAT-ChR2 мыши
Multiclamp 700BМолекулярные устройства2500-0157Микроэлектродный усилитель

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rajasethupathy, P., Ferenczi, E., Deisseroth, K. Targeting neural circuits. Cell. 165 (3), 524-534 (2016).
  2. Gore, F., Schwartz, E. C., Salzman, C. D. Manipulating neural activity in physiologically classified neurons: triumphs and challenges. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 370 (1677), 20140216(2015).
  3. Ono, M., Bishop, D. C., Oliver, D. L. Identified GABAergic and glutamatergic neurons in the mouse inferior colliculus share similar response properties. Journal of Neuroscience. 37 (37), 8952-8964 (2017).
  4. Ono, M., Bishop, D. C., Oliver, D. L. Long-lasting sound-evoked afterdischarge in the auditory midbrain. Scientific Reports. 6, 20757(2016).
  5. Munoz, W., Tremblay, R., Rudy, B. Channelrhodopsin-assisted patching: in vivo recording of genetically and morphologically identified neurons throughout the brain. Cell Reports. 9 (6), 2304-2316 (2014).
  6. Lima, S. Q., Hromadka, T., Znamenskiy, P., Zador, A. M. PINP: a new method of tagging neuronal populations for identification during in vivo electrophysiological recording. PLoS One. 4 (7), e6099(2009).
  7. Kuwada, S., Batra, R., Stanford, T. R. Monaural and binaural response properties of neurons in the inferior colliculus of the rabbit: effects of sodium pentobarbital. Journal of Neurophysiology. 61 (2), 269-282 (1989).
  8. Populin, L. C. Anesthetics change the excitation/inhibition balance that governs sensory processing in the cat superior colliculus. Journal of Neuroscience. 25 (25), 5903-5914 (2005).
  9. Duque, D., Malmierca, M. S. Stimulus-specific adaptation in the inferior colliculus of the mouse: anesthesia and spontaneous activity effects. Brain Structure and Function. 220 (6), 3385-3398 (2015).
  10. Cai, R., Richardson, B. D., Caspary, D. M. Responses to predictable versus random temporally complex stimuli from single units in auditory thalamus: impact of aging and anesthesia. Journal of Neuroscience. 36 (41), 10696-10706 (2016).
  11. Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8 (9), 745-752 (2011).
  12. Ito, T., Bishop, D. C., Oliver, D. L. Two classes of GABAergic neurons in the inferior colliculus. Journal of Neuroscience. 29 (44), 13860-13869 (2009).
  13. Ono, M., Yanagawa, Y., Koyano, K. GABAergic neurons in inferior colliculus of the GAD67-GFP knock-in mouse: electrophysiological and morphological properties. Neuroscience Research. 51 (4), 475-492 (2005).
  14. Chen, Q., et al. Imaging neural activity using Thy1-GCaMP transgenic mice. Neuron. 76 (2), 297-308 (2012).
  15. Hirai, Y., Nishino, E., Ohmori, H. Simultaneous recording of fluorescence and electrical signals by photometric patch electrode in deep brain regions in vivo. Journal of Neurophysiology. 113 (10), 3930-3942 (2015).
  16. LeChasseur, Y., et al. A microprobe for parallel optical and electrical recordings from single neurons in vivo. Nature Methods. 8 (4), 319-325 (2011).
  17. Abaya, T. V., Blair, S., Tathireddy, P., Rieth, L., Solzbacher, F. A 3D glass optrode array for optical neural stimulation. Biomedical Optics Express. 3 (12), 3087-3104 (2012).
  18. Bittner, K. C., et al. Conjunctive input processing drives feature selectivity in hippocampal CA1 neurons. Nature Neuroscience. 18 (8), 1133-1142 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

VGAT Channelrhodopsin II

Похожие статьи