Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Индукция и проверки клеточного старения в первичных клеток человека

17.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/57782

⸱

20 июня 2018 г.

 ,  , 
1European Research Institute for the Biology of Aging, University of Groningen, University Medical Center Groningen

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы обсуждаем ряд протоколов для индукции и проверки клеточного старения в культивируемых клеток. Мы ориентируемся на различных раздражителей, вызывающие старение и описать количественного определения общего старения ассоциированных маркеров. Мы предоставляем технические детали, используя фибробластов в качестве модели, но протоколы могут быть адаптированы к различным сотовой модели.

Аннотация

Клеточного старения является состояние постоянного клеточного цикла арест активирована в ответ на различные стимулы, повреждения. Активация клеточного старения является отличительной чертой различных патофизиологические условий, включая опухоли подавления, тканей ремоделирования и старения. По-прежнему плохо характеризуются индукторов сотовой старение в естественных условиях . Однако ряд стимулов может использоваться для содействия клеточного старения ex vivo. Среди них наиболее распространенные старение индукторов, репликативной истощения, ионизирующего и неионизирующего излучения, Генотоксичные препараты, оксидативный стресс и demethylating и ацетилировать агентов. Здесь мы предоставим детальные инструкции о том, как использовать эти стимулы, чтобы побудить фибробластов в старение. Этот протокол может быть легко адаптирована для различных типов начальных клеток и клеточных линий, включая раковые клетки. Мы также описывают различные методы для проверки старения индукции. В частности мы сосредоточены на измерение активности лизосомальных ферментов старения-связанные β-галактозидазы (SA-β-gal), скорость синтеза ДНК с помощью 5-ethynyl-2'-дезоксиуридина (EdU) включение анализа уровней экспрессии клеточного цикла Ингибиторы p16 и p21 и выражение и секрецию членов Senescence-Associated секреторной фенотип (SASP). Наконец мы предоставляем пример результаты и обсудить дальнейшие применения этих протоколов.

Введение

В 1961 году Хейфлик и Moorhead сообщили, что первичный фибробластов в культуре потерять их пролиферативный потенциал после последовательных проходов1. Этот процесс является причиной последовательных укорочение теломер после каждого деления клеток. Когда теломеры достигают критически короткой длины, они признаются в повреждения ДНК ответ (РДР), который активирует необратимым арест распространения — также определен как репликативной старение. Репликативной старения в настоящее время является одним из многих раздражителей, которые известны побудить государство ареста постоянного клеточного цикла, что делает клетки нечувствительны митогены и apoptotic сигналы2,3. Программа старения обычно характеризуются дополнительными функциями, включая высокую активность лизосомальных, митохондриальной дисфункции, ядерные изменения, перераспределений chromatin, эндоплазматического ретикулума стресс, повреждение ДНК и старение связанных секреторный фенотип (SASP)3,4. Стареющей клетки имеют несколько функций в организме: развития, ранение исцеления и опухоли подавления2. Кроме того они известны играть важную роль в старения и, как ни парадоксально, в прогрессии опухоли5. Отрицательный и частично противоречивой, эффекты старения часто приписывают SASP6.

Недавно было показано, что ликвидация стареющей клетки от мышей приводит к продлению жизни и ликвидации многих старения функции7,8,9,10,11, 12. в то же время, несколько препаратов были разработаны для либо устранить стареющей клетки (senolytics) или целевой SASP13,14. Антивозрастной лечебный потенциал недавно привлекло больше внимания к полю.

Изучение механизмов, связанных с сотовой старение и показы для фармакологического вмешательства сильно полагаться на ex vivo модели, особенно на первичной фибробластов. Хотя есть некоторые общие черты, активируются различные старение индукторов, большой изменчивости в старение фенотип наблюдаемыми и зависит от различных факторов, включая ячейки типа, стимулов и времени точки3,15, 16,17. Это необходимо учитывать гетерогенность для изучения и ориентации стареющей клетки. Таким образом этот протокол направлен на обеспечение ряда методов, используемых для вызывают старение в первичной фибробластов с помощью различных методов лечения. Как это будет объяснено, методы может быть легко адаптирована для других типов клеток.

Помимо репликативной старение, мы опишем пять других вызывающих старение лечения: ионизирующего излучения, ультрафиолетовые (УФ) излучения, доксорубицин, оксидативный стресс и эпигеномные изменения (а именно, поощрение ацетилирование гистона или деметилирования ДНК) . Ионизирующего излучения и УФ излучения вызывают прямого повреждения ДНК и, в соответствующих дозах вызывают старение18,19. Доксорубицин также вызывает старение главным образом через повреждения ДНК, интеркалирующие в ДНК и нарушая функцию топоизомеразы II и таким образом остановить ДНК ремонт механизмов20. Экспрессии генов, необходимых для старения обычно контролируется ацетилирование гистона и метилирования дна. Как следствие Ингибиторы гистоновых деацетилаз (например, натрия бутират и Саха) и ДНК-demethylating агентов (например, 5-Аза) вызывают старение в противном случае нормальных клеток21,22.

Наконец, четыре из наиболее распространенных маркеров, связанные для стареющей клетки будет объяснено: активность старение связанные β-галактозидазы (SA-β-gal), скорость синтеза ДНК, EdU включения анализа, гиперэкспрессия регуляторов клеточного цикла и p16 ингибиторы Циклин зависимая киназа p21, гиперэкспрессия и и секрецию членов SASP.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Общая подготовка

  1. Подготовка среднего D10. Дополнить DMEM средне Glutamax с 10% FBS и 1% пенициллина/стрептомицина (конечная концентрация: 100 ед/мл).
  2. Подготовьте стерильные PBS. Растворите таблетки в воде в соответствии с инструкциями производителя. Стерилизуйте в автоклаве.
  3. Подготовка 1 x трипсина. Развести 5 мл трипсина-Versene ЭДТА/10 x 1:10 в 45 мл стерильного PBS.
    Примечание: В протоколе, мы используем условия культуры клеток, которые находятся ближе к физиологические условия для первичного фибробластов. Это означает, что мы инкубации клеток при 37 ° C и 5% CO2 , как это обычно делается, но использование 5% O2 вместо «стандарт» 20% O2.
  4. Обрабатывать все образцы в стерильных условиях, используя Ламинарный шкаф, лабораторный халат и перчатки. Держите клетки на 20% O2 (номер условия) только во время обработки.

2. индукция старение

  1. Репликативной старение
    1. Во время обработки клеток или любой материал, который будет находиться в контакте с их (пипец, фляги, СМИ и т.д.) работают в стерильных условиях, используя Ламинарный шкаф, лабораторный халат и перчатки. Держите клетки на 20% O2 (номер условия) только во время обработки.
    2. Семя 7 x 105 жизнеспособных первичных фибробластов в низкой численности населения, удвоение T75 колбу (~9.3 x 103 клеток/см2), содержащие 10 мл D10 (PD).
    3. Рост клеток в инкубаторе ячейки при 37 ° C с 5% CO2 и 5% O2 до тех пор, пока они достигают 70 – 80% слияния (3 – 4 дня для пролиферирующих культур в низкой PD).
    4. Отсоединить ячейки, используя 3 мл 1 x трипсина и инкубации за ~ 5-7 мин в инкубатор культуры клеток при 37 ° C с 5% CO2 и 5% O2. Регулярно контролировать клетки с микроскопом культуры клеток, чтобы проверить отсоединение процесса.
    5. Когда клетки являются сферические, остановите трипсина реакции путем добавления 9 мл D10. Не инкубировать более чем на 10 мин.
    6. Вращайте клетки на 300 x g для 5 минут клетки будет форма гранул в нижней части трубки, в то время как мусор и мелкие частицы останется в надосадке.
    7. Удалить супернатант и растворяют гранулы клеток в 1 мл D10 и выполняют число ячеек, используя автоматизированные ячейки счетчик согласно инструкции производителя или Нойбауэр камеры для ручной подсчет. Во время подсчета голосов, включают assay проверить жизнеспособность клеток (например, исключение Трипановый синий23).
    8. Рассчитайте совокупный PD, используя эту формулу:
      PDНовый = 3.32* (LOG(cell number total)-(LOG (мобильный номер семенами)) + PDold
      Мобильный телефон всего = все ячейки учитываются: живые и мертвые.
      Мобильный телефон посеян = количество жизнеспособных клеток семенами (8 x 105 ).
      PDстарый = населения, удвоение в момент заполнения.
      PDНовый = населения, удвоение в данный момент подсчета (после инкубации).
      Примечание: Если 7 x 105 первичных фибробластов (35,2 PD) были посеяны на T-75 колбу и, после 4 дней они достигают 80% слияния и разделены снова, считая теперь 1.3 x 106 клеток всего (мертвых + жив).
      PDНовый = 3.32* (LOG(1,300,000 cells)-LOG(700,000)) + 35,2
      PDНовый = 36,1
    9. Повторное заполнение 8 x 105 клеток в новом T75, повторяя шаги 2.1.2–2.1.8.
      Примечание: После нескольких последовательных проходов, культура займет больше времени, чтобы получить вырожденная, пока клетки остановки деления на всех. После того, как клетки остановки деления, тест для старения маркеров или урожай для нисходящие приложения.
    10. Считают, что больше размер стареющей клетки может вызвать культуры появляются полностью и еще имеют низкий клеток счетчик. Таким образом, старение можно предположить при ПД является стабильным и другие маркеры старения появляются в культуре (см. протоколы 3.1-3.5).
      Примечание: Используйте пролиферирующих первичной фибробластов как элемент управления.
  2. Ионизирующего излучения индуцированного старения
    1. Во время обработки клеток или любой материал, который будет находиться в контакте с их (пипец, фляги, СМИ и т.д.), работают в стерильных условиях, используя Ламинарный шкаф, лабораторный халат и перчатки. Держите клетки на 20% O2 (номер условия) только во время обработки.
    2. Семя 7 x 105 жизнеспособных первичных фибробластов в низкой PD в колбе T75 (~9.3 x 103 клеток/см2) содержащие 10 мл D10.
    3. Инкубируйте клетки на ночь в инкубатор культуры клеток при 37 ° C с 5% CO2 и 5% O2.
    4. Разоблачить клетки 10 серый гамма-облучения в соответствии с инструкциями машину в использовании.
    5. Аспирационная среднего из клеток и заменить с 10 мл D10.
    6. Инкубируйте клетки в 10 мл D10 в инкубатор культуры клеток при 37 ° C с 5% CO2 и 5% O2 еще 10 дней, заменив носитель регулярно, примерно каждые 3 дня.
    7. После 10 дней тест на старение маркеры и/или использовать клетки для нисходящие приложения.
      Примечание: Используйте пролиферирующих первичной фибробластов же PD (до облучения) как элемент управления.
  3. Ультрафиолетового (УФ) радиации старение
    1. Во время обработки клеток или любой материал, который будет находиться в контакте с их (пипец, фляги, СМИ и т.д.), работают в стерильных условиях, используя Ламинарный шкаф, лабораторный халат и перчатки. Держите клетки на 20% O2 (номер условия) только во время обработки.
    2. Семя 1,5 – 2 x 105 жизнеспособных первичных фибробластов в низкой PD в одной скважине 6-ну плиты (1,5 – 2,0 x 104 клетки/см2), добавить 2 мл среды D10.
    3. Место клетки в инкубатор культуры клеток при 37 ° C с 5% CO2 и 5% O2 и позволяют им придерживаться пластика для по крайней мере 5 ч.
    4. Возьмите средних от клетки. Место пластину 6-Ну в середине камеры УФ излучения и снять пластиковую крышку. Облучать с UVB, 20 – 30 МДж/см2.
    5. Добавьте 2 мл среды в колодец.
    6. Инкубируйте клетки в 2 мл D10 в инкубатор культуры клеток при 37 ° C с 5% CO2 и 5% O2 еще 7 дней, заменив носитель регулярно, примерно каждые 3 дня.
      Примечание: После 7 дней, клетки могут быть проверены на старение маркеры и используется для приложений, ниже по течению. Использование пролиферирующих первичной фибробластов же PD (до облучения) в качестве управления.
  4. Доксорубицин индуцированного старения
    1. Подготовка 1000 x доксорубицин Стоковый раствор: сделать запас 250 мкм доксорубицин в однократном ПБС, фильтр стерилизуйте решение и Алиготе в 500 мкл в стерильную пробирку. Хранить запас доксорубицин-80 ° c.
    2. Во время обработки клеток или любой материал, который будет находиться в контакте с их (пипец, фляги, СМИ и т.д.), работают в стерильных условиях, используя Ламинарный шкаф, лабораторный халат и перчатки. Держите клетки на 20% O2 (номер условия) только во время обработки.
    3. Семя 7 x 105 жизнеспособных первичных фибробластов в низкой PD в колбе T75 (~9.3 x 103 клеток/см2) содержащие 10 мл D10.
    4. Инкубируйте клетки на ночь в инкубатор культуры клеток при 37 ° C с 5% CO2 и 5% O2.
    5. Разбавить 11 мкл 1000 x доксорубицин Стоковый раствор в 11 мл D10 до конечной концентрации 250 Нм.
    6. Аспирационная среднего из клеток и заменить 10 мл D10 + доксорубицин.
    7. Инкубируйте клетки для точно 24 h в инкубатор культуры клеток при 37 ° C с 5% CO2 и 5% O2.
    8. Аспирационная среднего из клеток и тщательно мыть раз с 10 мл D10.
    9. Инкубируйте клетки в 10 мл D10 еще 6 дней, заменив носитель регулярно, примерно каждые 3 дня.
    10. На 7 день тест на старение маркеры и/или использовать нисходящие приложения.
      Примечание: как управления, использования пролиферирующих первичной фибробластов же PD, лечение за 24 ч с транспортного средства (PBS) 1:1,000 в D10.
  5. Окислительный стресс индуцированного старения
    1. Во время обработки клеток или любой материал, который будет находиться в контакте с их (пипец, фляги, СМИ и т.д.) работают в стерильных условиях, используя Ламинарный шкаф, лабораторный халат и перчатки. Держите клетки на 20% O2 (номер условия) только во время обработки.
    2. Семя 7 x 105 жизнеспособных первичных фибробластов в низкой PD в колбе T75 (~9.3 x 103 клеток/см2) содержащие 10 мл D10.
    3. Инкубируйте клетки на ночь в инкубаторе ячейки при 37 ° C с 5% CO2 и 5% O2.
    4. Приготовляют раствор перекиси водорода ~ 200 мкм в среде D10, добавив 22.6 мкл 30% перекиси водорода в 11 мл D10.
      Примечание: Оптимизация лечения для ячейки тип интереса, сделав кривая доза ответ для оценки токсичности.
    5. Аспирационная среднего из клеток и добавляют 10 мл свежеприготовленные D10 средний + перекись водорода. Проинкубируйте втечение 2 ч при 37 ° C с 5% CO2 и 5% O2.
    6. Аспирационная среднего из клеток и один раз промойте свежие D10 без перекиси водорода.
    7. Добавьте 10 мл D10 без пероксида водорода.
    8. Проинкубируйте 48 ч в инкубатор культуры клеток при 37 ° C с 5% CO2 и 5% O2.
    9. Повторите шаги 2.5.4–2.5.8 в два раза больше для в общей сложности три лечения.
    10. Проверка старения маркеров или урожай для нисходящие приложения.
      Примечание: Как контролировать, использовать пролиферирующих клеток же PD, относились с 22,6 мкл стерильной воды на 2 ч в D10.
  6. Эпигеномно индуцированного старения
    1. Подготовка запасов и рабочие решения для малого molecule(s) для использования согласно таблице 1. Фильтр стерилизуйте решения. Алиготе стерильные пробирки. Хранить при температуре от-20 ° C.
    2. Во время обработки клеток или любой материал, который будет находиться в контакте с их (пипец, фляги, СМИ и т.д.) работают в стерильных условиях, например, с помощью Ламинарный шкаф, лабораторный халат и перчатки. Держите клетки на 20% O2 (номер условия) только во время обработки.
    3. Семя 7 x 105 жизнеспособных первичных фибробластов в низкой PD в колбе T75 (~9.3 x 103 клеток/см2) содержащие 10 мл D10.
    4. Инкубируйте клетки на ночь в инкубатор культуры клеток при 37 ° C с 5% CO2 и 5% O2.
    5. Подготовка 11 мл D10 средний + рабочее решение для желаемого лечения. Точное разведение за лечение можно увидеть в таблице 1.
      1. Подготовка 11 мкл 1 мм Саха рабочего раствора в 11 мл D10.
      2. Подготовьте 44 мкл 1 М натрия бутират рабочего раствора в 11 мл D10.
      3. Подготовка 11 мкл 10 мм 5-Аза рабочего раствора в 11 мл D10.
        Примечание: Оптимизация лечения для ячейки тип интереса, например, делая кривая доза ответ для оценки токсичности.
    6. Добавьте D10 средний + рабочий раствор для желаемого лечения в культуре.
    7. Проинкубируйте 24 ч в инкубатор культуры клеток при 37 ° C с 5% CO2 и 5% O2.
    8. Повторите шаги 2.6.4–2.6.6 в два раза больше, в общей сложности три лечения.
    9. Изменение среднего для простых D10 без наркотиков.
    10. После 3 дней клетки становятся стареющей и готов для тестирования старения маркеров и нисходящие приложения.
      Примечание: как управления, использования пролиферирующих первичной фибробластов же PD, лечение за три дня с D10 средний + транспортного средства. D10 средний + транспортное средство необходимо обновлять каждые 24 ч в течение этих трех дней. Транспортного средства зависит от лечения используются: 1:1,000 ДМСО на Саха и 5-аза и 1: 250 стерильную воду для натрия бутират.

3. маркеры старение

  1. Подготовка
    1. Подготовка 20 мг/мл X-Гал: растворяют 20 мг в 1 мл диметилформамиде или ДМСО X-Гал. Хранить при-20 ° C, защищать от света.
    2. Подготовить раствор лимонной кислоты 0,1 М: растворить 2,1 г, лимонной кислоты моногидрат в 100 мл воды. Хранить при комнатной температуре.
    3. Приготовляют раствор натрия фосфат 0,2 М: растворить 2,84 г двуосновной фосфат натрия или 3.56 g двуосновной фосфат натрия дигидрат в 100 мл воды. Хранить при комнатной температуре.
    4. Подготовить 0,2 М лимонной кислоты/натрия фосфат pH 6.0: растворить 36.85 мл 0,1 М раствора лимонной кислоты и 63.15 мл фосфат натрия 0,2 М. Отрегулируйте точно до pH 6.0. Хранить при комнатной температуре.
    5. Подготовка 100 мм Ферроцианид калия: растворить 2.1 g Ферроцианид калия в 50 мл воды. Хранить при 4 ° C, защищать от света.
    6. Подготовка 100 мм калия Гексацианоферрат: растворить 1,7 г калия Гексацианоферрат в 50 мл воды. Хранить при 4 ° C, защищать от света.
    7. Подготовить 5 M натрия хлорида: растворить 14,6 г хлорида натрия в 50 мл воды. Хранить при комнатной температуре.
    8. Подготовить 1 М магния хлорид: растворить 4,8 г, магния хлорида в 50 мл воды. Хранить при комнатной температуре.
    9. Готовить 2% формальдегида + 0,2% глютаральдегид в PBS: растворить 800 мкл глютаральдегид 25% и 12,5 мкл 16% формальдегида в 100 мкл PBS. Хранить при комнатной температуре в защищенном от света.
    10. Приготовляют раствор окрашивание свежие согласно Таблица 2.
  2. Связанные старения β-галактозидазы пятнать
    1. Для каждого образца семян 1 х 104 клетки в по крайней мере один хорошо 24-ну пластины (5.2 x 103 клеток/см2) содержащий 500 мкл D10, так что клетки являются редкими. Лечение (если применимо) могут быть выполнены непосредственно на этой табличке или, альтернативно, клетки, лечение уже может быть вновь посеяны в 24-ну плиту.
    2. Инкубируйте клетки на ночь при 37 ° C с 5% CO2 и 5% O2.
    3. Вымойте клетки два раза с 500 мкл PBS.
    4. Исправление 3 – 5 мин при комнатной температуре с помощью 500 мкл/хорошо 2% формальдегида + 0,2% глютаральдегид в PBS.
    5. Вымойте клетки два раза с 500 мкл PBS.
    6. Подготовьте свежие пятнать решения, по данным количество образцов пятно.
    7. Добавьте окрашивание раствора (500 мкл/а) и печать пластины с парафина, чтобы избежать испарения.
      Примечание: Испарение может вызвать кристаллы формы и препятствовать наблюдению под микроскопом.
    8. Инкубируйте клетки в темноте (например в алюминиевой фольги) при 37 ° C в сухой инкубатора (без CO2) для 12 – 16 ч.
      Примечание: CO2 может повлиять на рН и таким образом изменить результаты. Некоторые типы клеток может потребовать короче инкубационного раз.
    9. Мыть два раза с 500 мкл PBS.
    10. Оценить результаты. Позитивные клетки представляют голубой (главным образом) perinuclear окрашивание под микроскопом нормального света (рис. 1A).
    11. Для количественной оценки соблюдать по меньшей мере 100 клеток на сэмпл и подсчитать количество положительных клеток. Так как стареющей клетки изменить форму, часто бывает трудно определить границы ячейки и подсчитать количество ячеек. Изображение с DAPI для облегчения визуализации и количественная оценка отдельных клеток (рис. 1B). Количественно образцы (процент положительных клеток против общее количество клеток) с помощью флуоресцентный микроскоп (рис. 1 c). Принять несколько фотографий того же образца, так что в конце вы можете рассчитывать по крайней мере 100 сингл клетки и оценить процент положительных клеток SA-β-гал в них.
    12. Сравните результаты стареющей клетки против их соответствующего элемента управления для лечения используются.
      Примечание: Совместное окрашивание с EdU на том же образце Возможен экспорт. Рассмотрим, что клетки затем должна быть заполнена на coverslips.
  3. Включение анализа EdU
    1. Поставьте coverslip/колодец в пластине 24-Ну согласно количество образцов для оценки.
    2. 4 клетки семян 1 x 10 в по крайней мере один хорошо 24-ну плиты (5.2 x 103 клеток/см2) за состояние, содержащий 500 мкл D10, так что клетки являются редкими. Лечение (если применимо) могут быть выполнены непосредственно на этой табличке или, альтернативно, уже обработанные клетки могут быть вновь посеяны в 24-ну плиту.
    3. Инкубируйте клетки на ночь при 37 ° C с 5% CO2 и 5% O2.
    4. Сделайте раствор 20 мкм EdU в D10 (1: 250) согласно количество выборок для лечения (250 мкл на сэмпл).
    5. Удаление половины среднего (250 мкл) из каждой скважины для лечения и заменить его с D10 + EdU решение, которое было только что приготовленный. Конечная концентрация EdU-10 мкм.
    6. Инкубируйте 18 – 24 h в инкубатор культуры клеток при 37 ° C с 5% CO2 и 5% O2. Используйте то же время инкубации в управления и стареющей клетки.
    7. Вымойте 2 x с 500 мкл PBS.
    8. Исправьте ячейки для 10 мин с 500 мкл 4% формальдегида в PBS.
    9. Инкубируйте 5 мин в 500 мкл, 100 мм трис (рН 7,6).
    10. Разрушения клеток для 10 мин в 500 мкл 0,1% тритон X-100 в PBS.
    11. Вымойте 3 x с PBS.
    12. Подготовка 50 мкл метки смеси для каждого coverslip, добавляя компоненты в следующем порядке: 44,45 мкл PBS, 0.5 мкл Cu (II) т4, 0,05 мкл сульфогруппу Cy3-азид, 5 мкл Аскорбат натрия.
    13. Положите 50 мкл метки смеси на кусок парафина. Снять coverslip с помощью пара пинцеты и иглы и дайте ему отдохнуть на вершине лейбл микс, с поверхностью, содержащие клетки вниз. Убедитесь, что есть никаких пузырей и что вся поверхность coverslip трогательно лейбл микс. Инкубируйте 30 мин в темноте.
    14. Положите клетки обратно в скважинах пластину 24-Ну и мыть их в три раза с PBS.
    15. Смонтировать с монтажными средствами массовой информации (включая DAPI визуализировать ядер) на стеклянных вставках и дайте им высохнуть на ночь.
    16. Визуализируйте EdU включение с помощью флуоресцентный Микроскоп. Используйте фильтр, подходящий для Cy3 (возбуждения/выбросов: 552/570 Нм).
    17. Принимать несколько фотографии клеток для более поздних количественной оценки по крайней мере 100 ячеек на условие (Cy3 и DAPI).
    18. Подсчитать процент клеток, которые включены EdU с использованием следующей формулы:
      EdU позитивных клеток (%) = (количество положительных клеток Эду (Cy3) / общее количество клеток (DAPI)) * 100
    19. Сравните результаты стареющей клетки против их соответствующего элемента управления для лечения используются.
      Примечание: Совместное окрашивание с SA-β-Гал на том же образце Возможен экспорт. Рассмотрим, что клетки по-прежнему должна быть заполнена на coverslips.
  4. Выражение гена p16, p21 и SASP
    1. Подготовьте грунт наборы генов интерес (праймер 50 мкм).
      Примечание: ПЦР p16, p21 и некоторые соответствующие факторы SASP информативный старение статуса. Протокол описанных здесь делает использование системы универсальная библиотека зонд (ЕП) для относительной количественной оценки, с помощью реального времени ПЦР. Таблица 3 показывает обзор грунты, используемые для обнаружения CDK ингибиторы p16 и p21 и наиболее актуальных SASP-членов, а также тубулин и актина, которые служат в качестве справочных генов для assay. В последней колонке таблицы 3 привлекает особое УПЛ зонд для калибровочных.
    2. Подготовка смесь реакции отдельных ПЦР для желаемого анализов. Всегда включают ссылку генов также согласно таблице 4.
    3. Выполните все образцы в двух экземплярах или в трех экземплярах.
    4. Загрузите 7,5 мкл/хорошо смеси реакции ПЦР на тарелку, 384-хорошо.
    5. Добавить ~ 5 нг cDNA растворяют в 2,5 мкл РНКазы свободной воды.
      Примечание: Желательно иметь аналогичные количество cDNA для всех образцов для сравнения. Это может быть достигнуто с помощью равного количества РНК для обратной транскрипции.
    6. Крышка с уплотнением и убедитесь, что он прилипает правильно покрытие равномерно все скважины на плите.
    7. Спиновые пластину на 2000 x g за 1 мин.
    8. Запустите пластину в Lightcycler за 40 циклов, используя следующий протокол:
      95 ° C 7 мин
      40 циклов 95 ° c за 5 s и 60 ° C за 30 s
      37 ° C за 1 мин
    9. Для анализа результатов используйте метод, предложенный для Livak и коллег для анализа ПЦР данных24. Использовать или тубулин, или актин как ссылку генов для вычисления ΔCt значение и использовать соответствующий элемент управления для вычисления значения ΔΔCt для конкретных вызывающих старение лечения.
  5. Выражение протеина и секрецию ИЛ 6
    1. Семена 5 – 10 x 104 клетки в по крайней мере один хорошо 6-ну плиты (5.2-10.5 x 103 клеток/см2) за условия, содержащие 2 мл D10. Лечение (если применимо) могут быть выполнены непосредственно на этой табличке или, альтернативно, клетки, лечение уже может быть вновь посеяны в 24-ну плиту. Пусть он стоять на ночь после посева.
    2. Удалите носитель и заменить на 2 мл DMEM средних, без FBS. Инкубируйте в нормальных условиях за 24 ч.
    3. Соберите среднего в 15 мл.
    4. Центрифуга образца на 300 x g 5 мин среднего может храниться при температуре-80 ° C до обработки.
    5. Следуйте инструкциям производителя для выполнения ELISA.
    6. Сравните результаты стареющей клетки против соответствующего элемента управления для конкретных вызывающих старение лечения

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Обогащение SA-β-Гал пятнать в стареющей фибробластов

Β-галактозидазы (β-gal) является лизосомальных ферментов, которая выражается во всех клетках и который имеет оптимальный рН 4,025,26. Однако, во время старения, лизосомы увеличение размера и, следовательно, стареющей клетки накапливаются β-Гал. Увеличение количества этого фермента позволяют обнаружить свою деятельность да...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Протоколы, описанные здесь были оптимизированы для первичной фибробластов, особенно BJ и WI-38 ячеек. Протоколы для репликативной старение, ионизирующего излучения и доксорубицина, успешно применялись к другим типам фибробластов (HCA2 и IMR90) и в других типах клеток (а именно новорожденным меланоцитов и кератиноцитов или iPSC производные кардиомиоцитов) в нашей лаборатории. Однако приспособления для типов дополнительных ячеек могут быть оптимизированы, регулируя некоторые детали, такие как количество клеток в сеяный, ме...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Благодарности

Мы благодарим членов Demaria лаборатории для плодотворных обсуждений и Thijmen ван Влит для совместного использования данных и протокол на УФ индуцированного старения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
DMEM Media - GlutaMAXGibco31966-047
Фетальная бычья сывороткаГиклонSV30160.03
Пенициллин-стрептомицин (P/S; 10,000 ЕД/мл)LonzaDE17-602E
Диметилсульфоксид (ДМСО)Sigma-AldrichSC-202581
Вода без нуклеазы (не обработанная DEPC)AmbionAM9937
T75 колбаSarstedt833911002
раствор трипсина/ЭДТАLonzaCC-5012
PBS таблеткиGibco18912-014
1,5 мл микроцентрифужные пробиркиSigma-AldrichT9661-1000EA
Corning  Центрифужные пробирки 15 млSigma-AldrichCLS430791
6-луночная пластинаSarstedt83.3920
24-луночная пластинаSarstedt83.3922
13 мм круглая покровная трубкаSarstedt83.1840.002
SteriflipMerck ChemicalsSCGP00525
цезий137-источникIBL 637 Цезий-137&гамма;-аппарат
камеры УФ-излучения Opsytec, Dr. Gö бел БС-02
Доксорубицина дигидрохлорид BioAustralis Fine ChemicalsBIA-D1202-1
Раствор перекиси водородаSigma-Aldrich7722-84-1
5-aza-2'-дезоксицитидинSigma-AldrichA3656
SAHASigma-AldrichSML0061
Бутират натрия Sigma-AldrichB5887
X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolil-β-D-galactopyranoside)Fisher Scientific7240-90-6
Моногидрат лимонной кислотыSigma-Aldrich5949-29-1
Двухосновной фосфатнатрия Acros organics7782-85-6
Ферроцианид калия Fisher Scientific14459-95-1
Феррицианид калияFisherScientific 13746-66-2
Хлорид натрияMerck Millipore7647-14-5
Хлорид магнияFisher Chemicals7791-18-6
25% глутаральдегидFisher Scientific111-30-8,7732-18-5
16% формальдегид (w/v)Thermo-Fisher Scientific28908
EdU (5-этинил-2'-дезоксиуридин)Lumiprobe10540
Сульфо-цианин3 азид (Sulfo-Cy3-Azide)LumiprobeD1330
Аскорбат натрияSigma-AldrichA4034
Пентагидрат сульфата меди(II) (Cu(II)SO4.5H2O)Sigma-Aldrich209198
Triton X-100Acros organics215682500
база TRISRoche11814273001
LightCycler 480 Multiwell Plate 384, белый Roche4729749001
Lightcycler 480 уплотнительная фольга Комплект зондов Lo-ROX от Roche
Sensifast BiolineBIO-84020
UPL Библиотека зондовSigma-AldrichVarious
Human IL-6 DuoSet ELISAR& DD6050
Bio-Rad TC20Bio-Rad
Счетные слайдыBio-Rad145-0017
Сухой инкубаторThermo-Fisher ScientificHeratherm
DimethylformamideMerck Millipore1.10983
Парапленка 'M' лабораторная пленкаBemis 
Иглы
для пинцета
4729757001 #PM992

Ссылки

  1. Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).
  2. Muñoz-Espín, D., Serrano, M. Cellular senescence: from physiology to pathology. Nature reviews. Molecular cell biology. 15, 482-496 (2014).
  3. Sharpless, N. E., Sherr, C. J. Forging a signature of in vivo senescence. Nature Reviews Cancer. 15 (7), 397-408 (2015).
  4. Correia-Melo, C., et al. Mitochondria are required for pro-ageing features of the senescent phenotype. The EMBO Journal. 10, e201592862(2016).
  5. Loaiza, N., Demaria, M. Cellular senescence and tumor promotion: Is aging the key? Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Cancer. , (2016).
  6. Coppe, J. P., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS Biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).
  7. Baker, D. J., et al. Naturally occurring p16(Ink4a)-positive cells shorten healthy lifespan. Nature. 530 (7589), 184-189 (2016).
  8. Xu, M., et al. Targeting senescent cells enhances adipogenesis and metabolic function in old age. Elife. 4, e12997(2015).
  9. Baker, D. J., et al. Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders. Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).
  10. Jeon, O. H., et al. Local clearance of senescent cells attenuates the development of post-traumatic osteoarthritis and creates a pro-regenerative environment. Nature Medicine. 23 (6), 775-781 (2017).
  11. Demaria, M., et al. Cellular Senescence Promotes Adverse Effects of Chemotherapy and Cancer Relapse. Cancer Discovery. 7 (2), 165-176 (2017).
  12. Chang, J., et al. Clearance of senescent cells by ABT263 rejuvenates aged hematopoietic stem cells in mice. Nature Medicine. 22 (1), 78-83 (2016).
  13. Soto-Gamez, A., Demaria, M. Therapeutic interventions for aging: the case of cellular senescence. Drug Discov Today. 22 (5), 786-795 (2017).
  14. Childs, B. G., et al. Senescent cells: an emerging target for diseases of ageing. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (10), 718-735 (2017).
  15. Marthandan, S., et al. Conserved genes and pathways in primary human fibroblast strains undergoing replicative and radiation induced senescence. Biological Research. 49, 34(2016).
  16. Marthandan, S., et al. Conserved Senescence Associated Genes and Pathways in Primary Human Fibroblasts Detected by RNA-Seq. PLoS One. 11 (5), e0154531(2016).
  17. Hernandez-Segura, A., et al. Unmasking Transcriptional Heterogeneity in Senescent Cells. Current Biology. 27 (17), 2652-2660 (2017).
  18. Le, O. N., et al. Ionizing radiation-induced long-term expression of senescence markers in mice is independent of p53 and immune status. Aging Cell. 9 (3), 398-409 (2010).
  19. Hall, J. R., et al. C/EBPalpha regulates CRL4(Cdt2)-mediated degradation of p21 in response to UVB-induced DNA damage to control the G1/S checkpoint. Cell Cycle. 13 (22), 3602-3610 (2014).
  20. Nitiss, J. L. Targeting DNA topoisomerase II in cancer chemotherapy. Nature Reviews Cancer. 9 (5), 338-350 (2009).
  21. Pazolli, E., et al. Chromatin remodeling underlies the senescence- associated secretory phenotype of tumor stromal fibroblasts that supports cancer progression. Cancer Research. 72, 2251-2261 (2012).
  22. Venturelli, S., et al. Differential induction of apoptosis and senescence by the DNA methyltransferase inhibitors 5-azacytidine and 5-aza-2'-deoxycytidine in solid tumor cells. Molecular Cancer Therapeutics. 12, 2226-2236 (2013).
  23. Tennant, J. R. Evaluation of the Trypan Blue Technique for Determination of Cell Viability. Transplantation. 2, 685-694 (1964).
  24. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  25. Lee, B. Y., et al. Senescence-associated β-galactosidase is lysosomal β-galactosidase. Aging Cell. 5, 187-195 (2006).
  26. Kopp, H. G., Hooper, A. T., Shmelkov, S. V., Rafii, S. Beta-galactosidase staining on bone marrow. The osteoclast pitfall. Histology and Histopathology. 22 (9), 971-976 (2007).
  27. Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (20), 9363-9367 (1995).
  28. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (7), 2415-2420 (2008).
  29. Sherr, C. J., McCormick, F. The RB and p53 pathways in cancer. Cancer Cell. 2 (2), 103-112 (2002).
  30. Bunz, F., et al. Requirement for p53 and p21 to sustain G2 arrest after DNA damage. Science. 282 (5393), 1497-1501 (1998).
  31. Severino, J., Allen, R. G., Balin, S., Balin, A., Cristofalo, V. J. Is beta-galactosidase staining a marker of senescence in vitro and in vivo. Experimental Cell Research. 257 (1), 162-171 (2000).
  32. Stolzing, A., Coleman, N., Scutt, A. Glucose-induced replicative senescence in mesenchymal stem cells. Rejuvenation Research. 9 (1), 31-35 (2006).
  33. Blazer, S., et al. High glucose-induced replicative senescence: point of no return and effect of telomerase. Biochemical and Biophysical Research Communications. 296 (1), 93-101 (2002).
  34. Wiley, C. D., Campisi, J. From Ancient Pathways to Aging Cells-Connecting Metabolism and Cellular Senescence. Cell Metabolism. 23 (6), 1013-1021 (2016).
  35. Kumar, R., Gont, A., Perkins, T. J., Hanson, J. E. L., Lorimer, I. A. J. Induction of senescence in primary glioblastoma cells by serum and TGFbeta. Scientific Reports. 7 (1), 2156(2017).
  36. Hypoxia Blagosklonny, M. V. MTOR and autophagy: converging on senescence or quiescence. Autophagy. 9 (2), 260-262 (2013).
  37. Meuter, A., et al. Markers of cellular senescence are elevated in murine blastocysts cultured in vitro: molecular consequences of culture in atmospheric oxygen. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 31 (10), 1259-1267 (2014).
  38. Coppe, J. P., et al. A human-like senescence-associated secretory phenotype is conserved in mouse cells dependent on physiological oxygen. PLoS One. 5 (2), e9188(2010).
  39. van Deursen, J. M. The role of senescent cells in ageing. Nature. 509 (7501), 439-446 (2014).
  40. Kim, Y. M., et al. Implications of time-series gene expression profiles of replicative senescence. Aging Cell. 12, 622-634 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

SAEdUp16 p21SASP
Индукция и проверки клеточного старения в первичных клеток человека
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.