Здесь мы обсуждаем ряд протоколов для индукции и проверки клеточного старения в культивируемых клеток. Мы ориентируемся на различных раздражителей, вызывающие старение и описать количественного определения общего старения ассоциированных маркеров. Мы предоставляем технические детали, используя фибробластов в качестве модели, но протоколы могут быть адаптированы к различным сотовой модели.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Индукция и проверки клеточного старения в первичных клеток человека
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Клеточного старения является состояние постоянного клеточного цикла арест активирована в ответ на различные стимулы, повреждения. Активация клеточного старения является отличительной чертой различных патофизиологические условий, включая опухоли подавления, тканей ремоделирования и старения. По-прежнему плохо характеризуются индукторов сотовой старение в естественных условиях . Однако ряд стимулов может использоваться для содействия клеточного старения ex vivo. Среди них наиболее распространенные старение индукторов, репликативной истощения, ионизирующего и неионизирующего излучения, Генотоксичные препараты, оксидативный стресс и demethylating и ацетилировать агентов. Здесь мы предоставим детальные инструкции о том, как использовать эти стимулы, чтобы побудить фибробластов в старение. Этот протокол может быть легко адаптирована для различных типов начальных клеток и клеточных линий, включая раковые клетки. Мы также описывают различные методы для проверки старения индукции. В частности мы сосредоточены на измерение активности лизосомальных ферментов старения-связанные β-галактозидазы (SA-β-gal), скорость синтеза ДНК с помощью 5-ethynyl-2'-дезоксиуридина (EdU) включение анализа уровней экспрессии клеточного цикла Ингибиторы p16 и p21 и выражение и секрецию членов Senescence-Associated секреторной фенотип (SASP). Наконец мы предоставляем пример результаты и обсудить дальнейшие применения этих протоколов.
Введение
В 1961 году Хейфлик и Moorhead сообщили, что первичный фибробластов в культуре потерять их пролиферативный потенциал после последовательных проходов1. Этот процесс является причиной последовательных укорочение теломер после каждого деления клеток. Когда теломеры достигают критически короткой длины, они признаются в повреждения ДНК ответ (РДР), который активирует необратимым арест распространения — также определен как репликативной старение. Репликативной старения в настоящее время является одним из многих раздражителей, которые известны побудить государство ареста постоянного клеточного цикла, что делает клетки нечувствительны митогены и apopto....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Общая подготовка
- Подготовка среднего D10. Дополнить DMEM средне Glutamax с 10% FBS и 1% пенициллина/стрептомицина (конечная концентрация: 100 ед/мл).
- Подготовьте стерильные PBS. Растворите таблетки в воде в соответствии с инструкциями производителя. Стерилизуйте в автоклаве.
- Подготовка 1 x трипсина. Развести 5 мл трипсина-Versene ЭДТА/10 x 1:10 в 45 мл стерильного PBS.
Примечание: В протоколе, мы используем условия культуры клеток, которые находятся ближе к физиологические условия для первичного фибробластов. Это означает, что мы инкубации клеток при 37 ° C и 5% CO2 , как это обычно делается, но использование 5%....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Обогащение SA-β-Гал пятнать в стареющей фибробластов
Β-галактозидазы (β-gal) является лизосомальных ферментов, которая выражается во всех клетках и который имеет оптимальный рН 4,025,26. Однако, во время старения, лизосомы увеличение размера и, следовательно, стареющей клетки накапливаются β-Гал. Увеличение количества этого фермента позволяют обнаружить свою деятельность да.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Протоколы, описанные здесь были оптимизированы для первичной фибробластов, особенно BJ и WI-38 ячеек. Протоколы для репликативной старение, ионизирующего излучения и доксорубицина, успешно применялись к другим типам фибробластов (HCA2 и IMR90) и в других типах клеток (а именно новорожденным меланоцитов и кератиноцитов или iPSC производные кардиомиоцитов) в нашей лаборатории. Однако приспособления для типов дополнительных ячеек могут быть оптимизированы, регулируя некоторые детали, такие как количество клеток в сеяный, ме.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Благодарности
Мы благодарим членов Demaria лаборатории для плодотворных обсуждений и Thijmen ван Влит для совместного использования данных и протокол на УФ индуцированного старения.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| DMEM Media - GlutaMAX | Gibco | 31966-047 | |
| Фетальная бычья сыворотка | Гиклон | SV30160.03 | |
| Пенициллин-стрептомицин (P/S; 10,000 ЕД/мл) | Lonza | DE17-602E | |
| Диметилсульфоксид (ДМСО) | Sigma-Aldrich | SC-202581 | |
| Вода без нуклеазы (не обработанная DEPC) | Ambion | AM9937 | |
| T75 колба | Sarstedt | 833911002 | |
| раствор трипсина/ЭДТА | Lonza | CC-5012 | |
| PBS таблетки | Gibco | 18912-014 | |
| 1,5 мл микроцентрифужные пробирки | Sigma-Aldrich | T9661-1000EA | |
| Corning Центрифужные пробирки 15 мл | Sigma-Aldrich | CLS430791 | |
| 6-луночная пластина | Sarstedt | 83.3920 | |
| 24-луночная пластина | Sarstedt | 83.3922 | |
| 13 мм круглая покровная трубка | Sarstedt | 83.1840.002 | |
| Steriflip | Merck Chemicals | SCGP00525 | |
| цезий137-источник | IBL 637 Цезий-137&гамма;-аппарат | ||
| камеры УФ-излучения Opsytec | , Dr. Gö бел БС-02 | ||
| Доксорубицина дигидрохлорид | BioAustralis Fine Chemicals | BIA-D1202-1 | |
| Раствор перекиси водорода | Sigma-Aldrich | 7722-84-1 | |
| 5-aza-2'-дезоксицитидин | Sigma-Aldrich | A3656 | |
| SAHA | Sigma-Aldrich | SML0061 | |
| Бутират натрия | Sigma-Aldrich | B5887 | |
| X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolil-β-D-galactopyranoside) | Fisher Scientific | 7240-90-6 | |
| Моногидрат лимонной кислоты | Sigma-Aldrich | 5949-29-1 | |
| Двухосновной фосфат | натрия Acros organics | 7782-85-6 | |
| Ферроцианид калия | Fisher Scientific | 14459-95-1 | |
| Феррицианид калия | Fisher | Scientific 13746-66-2 | |
| Хлорид натрия | Merck Millipore | 7647-14-5 | |
| Хлорид магния | Fisher Chemicals | 7791-18-6 | |
| 25% глутаральдегид | Fisher Scientific | 111-30-8,7732-18-5 | |
| 16% формальдегид (w/v) | Thermo-Fisher Scientific | 28908 | |
| EdU (5-этинил-2'-дезоксиуридин) | Lumiprobe | 10540 | |
| Сульфо-цианин3 азид (Sulfo-Cy3-Azide) | Lumiprobe | D1330 | |
| Аскорбат натрия | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| Пентагидрат сульфата меди(II) (Cu(II)SO4.5H2O) | Sigma-Aldrich | 209198 | |
| Triton X-100 | Acros organics | 215682500 | |
| база TRIS | Roche | 11814273001 | |
| LightCycler 480 Multiwell Plate 384, белый | Roche | 4729749001 | |
| Lightcycler 480 уплотнительная фольга | Комплект зондов Lo-ROX от Roche | ||
| Sensifast | Bioline | BIO-84020 | |
| UPL Библиотека зондов | Sigma-Aldrich | Various | |
| Human IL-6 DuoSet ELISA | R& D | D6050 | |
| Bio-Rad TC20 | Bio-Rad | ||
| Счетные слайды | Bio-Rad | 145-0017 | |
| Сухой инкубатор | Thermo-Fisher Scientific | Heratherm | |
| Dimethylformamide | Merck Millipore | 1.10983 | |
| Парапленка 'M' лабораторная пленка | Bemis | ||
| Иглы | |||
| для пинцета |
Ссылки
- Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).
- Muñoz-Espín, D., Serrano, M. Cellular senescence: from physiology to pathology. Nature reviews. Molecular cell biology. 15, 482-496 (2014).
- Sharpless, N. E., Sherr, C. J.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
