Упрощенная и эффективный метод для изоляции первичных человеческие кератиноциты от взрослых кожной ткани

Summary

Здесь мы представляем протокол эффективно изолировать первичной человеческие кератиноциты от взрослых кожных тканей. Этот метод упрощает обычные процедуры с использованием ингибитора Y-27632 рок в средне-прививка спонтанно отделить эпидермальных клеток от кожных клеток.

Abstract

Для лабораторных исследований и клинического применения основного человека кератиноцитов, изолированный от свежих кожных тканей и их расширение в пробирке широко использовались. Обычные изоляции метод человеческие кератиноциты включает в себя последовательное ферментативного пищеварения двухэтапная процедура, которая оказалась неэффективной в генерации начальных клетки от взрослых тканей из-за низкой сотовый скорость восстановления и сокращение клеток жизнеспособности. Недавно мы сообщили расширенный метод изолировать человека первичной эпидермальный прародитель клеток тканей кожи, использующий ингибитора киназы Ро Y-27632 в среде. По сравнению с традиционными протоколом, этот новый метод проще, легче и менее трудоемким и увеличивает урожайность эпителиальных стволовых клеток и усиливает их характеристики стволовых клеток. Кроме того новая методология не требует отделения эпидермис от дермы и, таким образом, подходит для изоляции клетки из различных видов тканей взрослого. Этот новый метод изоляции преодолевает основных недостатков традиционных методов и больше подходит для производства большого количества клеток эпидермиса с высокой потенции, как в лабораторных, так и для клинического применения. Здесь мы опишем новый метод в деталях.

Introduction

Целью было разработать простой и эффективный протокол изолировать первичной человеческие кератиноциты (HKCs) от взрослых тканях, особенно для клинического применения. Эпидермальный стволовых клеток кожи, локализованные в базального слоя кожи, обладают высоким потенциалом размножаться и дифференциации кератиноцитов для поддержания функций кожи^{1,2,3, 4}. HKCs, изолированных от кожи, ткани широко используются для кожи ткани инженерии и регенерации целей, особенно в ремонт поврежденной кожи и генной терапии для клинического применения^5,6. Ключевым вопросом для приложений на базе HKC является эффективно изолировать и расширить большое количество HKCs с высоким потенциальным в vitro^7,8. Хотя различные исследовательские группы разработали методы для производства культур стволовых как HKCs, эти методы являются иногда длительным и сложным для выполнения и другие ограничения, например урожайность низкая клеток и ограничиваясь типом кожи образца используемые⁹. К примеру традиционный метод, чтобы изолировать HKCs от кожных тканей предполагает двухэтапный ферментативного пищеварения с разделением эпидермис дерма⁶. Этот метод обычно хорошо работает для новорожденных тканей, но она становится очень трудно, когда используется для изоляции клетки от взрослых тканях.

Y-27632, ингибитора киназы Ро связанные белком (рок), сообщалось значительно повысить эффективность эпидермальный стволовых клеток изоляции и колонии роста^10,11,12. В предыдущем исследовании мы обнаружили, что Y-27632 облегчает клоновых рост клеток эпидермиса, но уменьшает доходность кожных клеток, дифференциально контролируя экспрессию молекул адгезии¹³. Мы также создали новое средство кондиционером прививка, называется G-средний, который поддерживает рост и урожайность первичных клеток эпидермиса. Объединив G-средний с Y-27632, этот новый метод может спонтанно отдельных клеток эпидермиса и дермы после Пищеварение энзима, удалив таким образом шаг эпидермис дерма разделения^13,14. Основываясь на предыдущих докладах, мы теперь описывают подробные процедуры этот новый метод, чтобы изолировать HKCs от взрослых кожной ткани.

Protocol

Человеческие ткани, используемые в настоящем Протоколе, обрабатывались в соответствии с руководящими принципами Комитета этики Института исследований человеческого (NO.2015120401, Дата: 12 мая 2015).

1. Подготовка

1. Собирать свежие взрослых брюшной кожных тканей, отказаться от пластической хирургии в госпитале в 50-мл тюбик 10 мл ледяной Дульбекко модифицированная Eagle среднего (DMEM). Образец может храниться при температуре 4 ° C до 72 ч без значительно влияющих на жизнеспособность клеток.
2. Подготовка реагентов и питательной среды, как описано ниже.
   1. Добавьте 50 мл раствора фосфатного буфера (PBS) подготовить моющего раствора 1 мл пенициллин (100 ед/мл) и стрептомицин (100 мг/Л).
   2. Подготовить два комплекта фермента пищеварение решения: (1) подготовить dispase (2,5 мг/мл в среде DMEM) 50 мл и 50 мл тип I коллагеназы (2,5 мг/мл в среде DMEM) отдельно для обычного метода; и (2) подготовить 50 мл смеси dispase и типа коллагеназы (растворить 125 мг порошка dispase и 125 мг I тип коллагеназы порошок в 50 мл DMEM) для нового метода.
      Примечание: Все фермента решения должны быть отфильтрованы с 0,22 мкм фильтром и держал at4 ° C.
   3. Подготовить пищеварение решения для обоих методов: 0,05% трипсина и трипсин 0.25% коммерчески были приобретены. Подготовка 10 мг/мл DNase I решения путем растворения 50 мг DNase я порошка в 5 мл PBS, фильтрация с помощью стрейнер 0,22 мкм и хранить его при-20 ° C.
   4. Подготовка 500 мл среды для нейтрализации ферментативного пищеварения: средний DMEM, дополненная плода бычьим сывороточным (ФБС) 10% и 1% пенициллина/стрептомицина.
   5. Подготовка 500 мл средства прививок (рост фактор содержащих средний, называется G-средний): DMEM/F12 (3:1) среде, содержащей 1% пенициллина/стрептомицина, fungizone 40 мкг/мл, 40 нг/мл фактор роста фибробластов 2 (FGF2), 20 нг/мл эпидермального фактора роста (EGF), и Дополнение 2% B27.
   6. Предварительной обработки 100-мм клеточной культуры блюда с 2 мл покрытие матрицы, содержащие тип коллагена для 30 мин при комнатной температуре.

2. обычный метод

1. Предварительная обработка ткани кожи
   1. Возьмите² 1,5 см ткани кожи и мыть его 1 x 10 мл PBS; затем промойте его с 10 мл, этанол 70% для 30 s и проинкубируйте его 2 x 10 мл моющего раствора (PBS, содержащий 2% пенициллина и стрептомицина), 5 мин.
      Примечание: Все моет выполняются в 100-мм ячейку культуры блюда внутри Ламинарный шкаф.
   2. Обрезка ткани с стерильные ножницы, чтобы удалить подкожный жировой слой в блюдо культуры 100-мм ячейку и затем, весят ткани кожи (вес составляет 1 g в этом протоколе).
      Примечание: Достаточно триммирование является очень эффективной сепарации эпидермис от дермы. Желтоватый жирового слоя можно легко отличить визуально.
   3. Передать другой 100-мм стерильные блюдо с стороны дермы ткани вниз и, затем, нарезать полосками 3 - до 4 мм широкий, с помощью скальпеля лезвие ткани кожи.
      Примечание: Стороны дермы с жировой слой легко распознается визуально.
   4. Добавить 10 мл 2,5 мг/мл dispase раствора на кожу тканей в 100-мм культуры блюдо и, затем, инкубировать блюдо на ночь при 4 ° C (не более 20 h).
      Примечание: Количество dispase раствора может рассчитываться с помощью 10 мл dispase раствора для пищеварения каждый грамм ткани.
2. Разделение эпидермис от ткани кожи
   1. На второй день шелушиться эпидермис от дермы с помощью тонкой пинцета.
      Примечание: Если это трудно слезает эпидермиса, dispase пищеварение недостаточно, как это обычно из-за недостаточной обрезки ткани. В этом случае ткани нужно более длиннее время инкубации.
   2. Фарш очищенные эпидермиса с 500 мкл клеток питательной среды в ткани пульпы с помощью лезвия скальпеля; затем Ресуспензируйте с 10 мл 0,25% трипсина в 50-мл пробирку и проинкубируйте его 20 мин на водяной бане при 37 ° C, при встряхивании.
3. Сбор и культивирования клеток первичного
   1. Нейтрализовать действие трипсина, добавляя равным объемом нейтрализации раствора (10 мл в этом протоколе).
   2. Отделить эпидермальных клеток, закупорить решение вверх и вниз 20 x с Серологические Пипетки 10-мл и пройти ячейки решения через стрейнер ячейки 100 мкм для удаления любого мусора остаточной ткани.
   3. Центрифуга клетки решение на 200 x g 5 мин после фильтрации; Ресуспензируйте Пелле клеток в среде нейтрализации для мытья и, затем, центрифуга его снова на 200 x g для получения гранул ячейки.
   4. Ресуспензируйте Пелле клеток в 10 мл низким кальций, сыворотка бесплатно кератиноцитов среды (УЛП). Возьмите 10 мкл этого решения для подсчета числа общей ячейки и, затем, пластины около 2 х 10⁶ клеток с 10 мл в 100-мм ячейку культуры блюда, предварительно обработанных с покрытие матрицы УЛП (содержащий тип I коллагена).
      Примечание: Покрытие является необходимым шагом для обычного метода.
   5. Изменение культуры среднего каждые 2 d.
      Примечание: Проверьте адгезии клеток под микроскопом, до и после изменения питательной среды.
   6. Проход клеток, когда они достигают около 80% слияния.
      Примечание: Все блюда культуры являются предварительно обработанных с покрытие матрицы.

3 новый метод

1. Предварительная обработка ткани кожи
   1. Собирайте ткани как описано выше (шаг 2.1) для обычного метода.
   2. Вымойте ткань кожи 1 x 10 мл PBS и, затем, взвесить его в стерильных пластиковых контейнеров, электронные весы (вес составляет около 1 g в этом протоколе).
      Примечание: Минимальный вес ткани, необходимые для этого протокола — 0,1 г, так как это трудно получить достаточное количество клеток, если используется образец ткани слишком мал. Существует не максимальный вес ткани для этого протокола, который в конечном счете зависит от пропускной способности оператора.
   3. Используйте щипцы для полоскания тканей кожи с 10 мл 70% этанол 30 s.
   4. Инкубировать ткани 2 x 10 мл моющего раствора (подготовленных на шаге 2.1.1), 5 минут каждый раз.
      Примечание: Все шаги Стиральная, отмечалось выше выполняются в 100-мм ячейку культуры блюда внутри Ламинарный шкаф (культуры ткани капот).
   5. Передать другой 100-мм ячейку культуры стерильные блюдо ткани.
   6. С помощью лезвия скальпеля, фарш ткани тщательно в ткани пульпы.
   7. Добавьте 200 мкл PBS каждые 5 мин держать влажной ткани.
      Примечание: Принимать шаги 3.1.5 - 3.1.7 около 15 мин. Все указанные выше действия выполняются при комнатной температуре.
2. Пищеварение ткани кожи
   1. Передача решения гомогенизированные ткани в 50-мл пробирку. Добавьте 10 мл смеси ферментов для каждого 1 г ткани кожи. Тщательно перемешать ферменты с усредненной тканей.
   2. Инкубируйте в смеси с тряски в водяной бане при 37 ° C в течение 1 ч.
   3. Добавить 1/5 объем трипсин 0.25% (2,5 мл в этом протоколе) пищеварение смесь для еще 30 мин на водяной бане при температуре 37 ° C.
   4. Добавить DNase я решение фермент смесь в соотношении 1: 100 (v/v) (250 мкл в этом протоколе) и проинкубируйте 5 мин при комнатной температуре.
3. Сбор и культивирования клеток первичного
   1. Остановите процесс пищеварения, добавив 12,5 мл нейтрализация среды в соотношении 1:1. Пипетка решение вверх и вниз для около 20 x, разбить ячейки с помощью Пипетки серологические 10-мл.
   2. Фильтр диссоциированных клетки через стрейнер ячейки 100 мкм для удаления мусора ткани. Центрифуга супернатант в 200 x g 5 мин наблюдать Пелле в нижней части трубки.
   3. Отменить супернатант и снова вымыть клетки лепешка с 10 мл нейтрализации средних и центрифуги на 200 x g 5 минут собрать клетки.
   4. Ресуспензируйте Пелле клеток в 10 мл средства прививок (G-средний шаг 1.2.5) с 10 мкм Y-27632.
   5. Возьмите 10 мкл раствора для подсчета числа общей ячейки и, затем, пластины около 2 х 10⁶ клеток с 10 мл в 100-мм ячейку культуры блюдо G-среды.
      Примечание: Намывных шаг не является необходимым для нового метода, а не удаление дермального слоя требуется либо.
   6. После 3 d замените средства прививок с низким кальция УЛП среднего. Изменение культуры среднего каждые 2 d.
      Примечание: Проверьте клеточной адгезии, до и после изменения среды.
   7. Проход клеток, когда они достигают около 80% слияния.
      Примечание: При необходимости предварительной обработки клеток с 0,05% трипсина на 2 мин и вымыть клетки с PBS для удаления загрязнения кожных клеток перед trypsinizing клеток эпидермиса.

4. клетки пассированый

1. Удалите носитель, вымыть клетки с PBS и, затем, добавить 2 мл 0,05% трипсина (за каждое блюдо 100-мм).
2. Инкубируйте клетки в инкубаторе (37 ° C с 5% CO₂) 5 мин.
3. Проверьте клетки под микроскопом, чтобы убедиться, что все клетки отделен от культуры блюдо.
4. Добавить 8 мл DMEM с 10% FBS для нейтрализации ферментативной реакции и, затем, собрать клетки в 15 мл.
5. Центрифуга на 200 x g 5 минут для получения гранул ячейки.
6. Удалить супернатант медленно и, затем, Ресуспензируйте клетки лепешка с 10 мл среды УЛП и подсчитать количество ячеек.
7. Пластина 1 х 10⁶ клеток с 10 мл в каждую ячейку 100-мм блюдо УЛП.
8. Изменение среднего каждые 2 d.

Results

На рисунке 1представлены схемы нового метода (рис. 1A) и традиционным методом (рис. 1B). Традиционным методом является двухэтапный пищеварение, которая требует 2-день процедуры. Напротив новый метод это Одношаговая пищеварения, который занимает около 3 часов для выполнения. Важно отметить, что одношаговый метод new можно получить две популяции (клетки эпидермиса и дермы) в то же время, которое зависи...

Discussion

Культивированный первичной HKCs широко использовались для лечения ран в клиниках для более чем трех десятилетий, и с того времени, он был всегда важно эффективно получить достаточное количество клеток для клинического применения своевременно. Таким образом на практике, обычные изоляции метод, который требует разделения эпидермис от дермы, делает его трудно удовлетворить эти требования, из-за низкой урожайностью клеток и низкая способность проход взрослых клеток. Здесь мы опишем новый простой метод, который мы разработали...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Графиня автоматизированный счетчик клеток	Invitrogen Inc.	C10227	Автоматический подсчет ячеек
CO2 Инкубатор	Thermo Scientific	51026333	Для инкубации клеток
Sorvall ST 16R Центрифуга	Thermo Scientific	75004380	Клеточная центрифуга
Шейкер постоянной температуры	Shanghai Boxun	150036	Для водяной бани
Электронные весы	Harbin Zhonghui	1171193	Для взвешивания тканей
Чашка для клеточных культур	Eppendorf	30702115	Для клеточной культуры
50 мл Центрифуга	KIRGEN	171003	Для клеточной центрифуги Клеточный
фильтр	Corning встроенный	431792	Фильтрация клеток
Фосфатный буферный раствор	Solarbio Life Science	P1020-500	Раствор для промывки
DMEM	Thermo Scientific	C11995500	Компонент нейтрализующей среды
Defined K-SFM	Life Technologies	10785-012	Питательная среда для эпидермальных клеток
Пенициллин стрептомицин	Thermo Scientific	15140-122	Антибиотики
Фетальная бычья сыворотка	Biological Industries	04-001-1AC5	Компонент нейтрализующей среды
0,05% Трипсин	Life Technologies	25300-062	Для диссоциации HKC
0,25% Трипсин	Пекин Соларбио Наука и Технология	T1350-100	Для выделения HKC диссоциация
Матричное покрытие	Комплект Life Technologies	R-011-K	Для покрытия матрицы
Dispase	Gibco	17105-041	Для изоляции HKC
Коллагеназа типа I	Life Technologies	17100-017	Для изоляции HKC
Дезоксирибонуклеаза I	Sigma	9003-98-9	Для изоляции HKC
F12 Питательная смесь, Hams	Life Technologies	31765035	компонент G-среды
B27 Добавка	Life Technologies	17504044	Фактор роста в G-среде
FGF-2 Millipore	Merck Biosciences	341595	Фактор роста в G-среде
Y-27632	Sigma-Aldrich	Y0503	ROCK ингибитор Fungizone
	Gibco	15290026	Препарат для G-среды
EGF Рекомбинантный человеческий белок	Gibco	PHG0311	фактор роста в G-среде
Набор для подсчета клеток Набор-8	Thermo Scientific	NC9864731	анализы пролиферации клеток и цитотоксичности
Мышиный античеловеческий цитокератин5	Hewlett-Packard Development Company	MA-20142	Для иммунофлуоресцентного окрашивания для проверки маркера дифференцировки HKC
Кролик Anti-Human Loricrin	Covance	PRB-145p	Для иммунофлуоресцентного окрашивания для проверки маркера дифференцировки HKC
Мышиный античеловеческий Vimentin	Cell Signaling Technology	3390	Для иммунофлуоресцентного окрашивания дермальных фибробластов
Integrin α 6(GOH3)	Санта-Круз	SC-19622	анализ проточной цитометрии HKCs
Rat IgG2a FITC	Santa Cruz	SC-2831	отрицательное контрольное антитело α 6-интегрин  в анализе проточной цитометрии