Методическая статья

Трассировка экспрессии генов путем обнаружения активности β-галактозидазы в целом мыши эмбрионов

DOI:

10.3791/57785

⸱

26 июня 2018 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Faculty of Biomedical and Health Sciences, Universidad Europea de Madrid, 2Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC), 3School of Doctoral Studies and Research, Universidad Europea de Madrid

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы опишем стандартный протокол для выявления активности β-галактозидазы в начале всего мыши эмбрионов и метод для парафина секционирование и counterstaining. Это простая и быстрая процедура для мониторинга экспрессии генов в процессе разработки, которые могут также применяться для разделов ткани, органов или культивируемых клеток.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Кишечная палочка LacZ гену, β-галактозидазы, в основном используется как репортер экспрессии генов и как трассировщик клеток линии исследований. Классическая гистохимические реакция основана на гидролиз субстрата X-гал в сочетании с ионами железа и черных, который производит нерастворимых синий осадок, который легко визуализировать. Таким образом активность β-галактозидазы выступает в качестве маркера для выражения гена интереса по мере развития. Здесь мы опишем стандартный протокол для выявления активности β-галактозидазы в начале всего мыши эмбрионов и последующий метод для парафина секционирование и counterstaining. Кроме того процедура для уточнения весь эмбрионов предоставляется лучше визуализировать X-Гал пятнать в более глубоких зонах эмбриона. Согласованные результаты получаются путем выполнения этой процедуры, хотя оптимизация условий реакции необходима для сведения к минимуму фоновой активности. Ограничения в assay должны рассматриваться также, особенно в отношении размера эмбриона окрашивания всю гору. Наш протокол обеспечивает чувствительной и надежный метод для обнаружения β-галактозидазы в процессе разработки мыши, который может применяться в криостата секций, а также целые органы. Таким образом динамический ген выражение шаблоны разработки может быть легко проанализирован с помощью этого протокола в целом эмбрионов, но также подробные выражение на клеточном уровне может оцениваться после разрезания парафин.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для того чтобы описать картин выражения определенного гена, использование репортер генов как маркеры был исключительно от дрозофилы до млекопитающих. В экспериментах с участием нокаут и трансгенных животных гена бактериальной β-галактозидазы (LacZ) Escherichia coli (E. coli) является одним из наиболее широко используемых в1,2,3, 4. β-галактозидазы (β-gal) катализирует гидролиз β-galactosides (например, лактоза) в моносахариды (глюкозы и галактозы)5. Его наиболее часто используемые с....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все экспериментальные процедуры были утверждены Комитетом по этике животных эксперименты CNIC (Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares) и Autónoma Comunidad де Мадрид для обеспечения минимальной животное страдает.

1. сбор эмбрионов от беременных мышей (от E8.5 до E12.5)

  1. Пожертвуйте беременных мышей шейки матки вывих или CO2 ингаляции. Первый день Вагинальные вилка считался эмбриональных день 0,5 (E0.5).
  2. Положите животное в лежачем положении на абсорбирующей прокладки и очистить брюшной кожу мыши с 70% этиловом спирте.
    Примечание: Стерильность не требуется в следующих шагах.
  3. Пинч и подн....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы показываем результаты от применения стандартный протокол для β-галактозидазы гистохимические реакции с помощью X-Гал как субстрат в целом мыши эмбрионов (рис. 1 и рис. 2). Используя этот протокол, осматриваем мембраны типа 4-матрицы металлопротеиназы (Mt4-mmp) выражение на разных этапах эмбрионального развития (E9.5, E11.5 и E12.5) с помощью Mt4-ММЗ мутантных мышей, которые Экспресс LacZ репортер под контролем эндогенные.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

E. coli ген LacZ широко используется как репортер в исследованиях картин выражения гена из-за его высокой чувствительностью и легкости обнаружения. Настоящий Протокол описывает классический метод для обнаружения β-Гал выражение на основе ферментативные реакции, которая легко и быстро выполнять а также недорогой. Этот метод может применяться без серьезных изменений в всю гору эмбрионов, нетронутыми органов, разделах ткани криостата или культивируемых клеток.

Точное применение этого мет.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что они имеют не конкурирующие финансового интереса.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы хотели бы поблагодарить службу гистопатологические их технической помощи в Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC). Мы также благодарим д-р Motoharu Seiki для любезно предоставление Mt4-ММЗLacZ мышей и д-р Алисия G. Арройо, для поддержки нашего проекта и для ее критического чтения рукописи. Мы хотим поблагодарить Питера Бонни для корректуры этой статьи. Эта работа была поддержана Europea Мадридский посредством гранта (# 2017UEM01) в ЦСК

....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<сильно>РЕАГЕНТЫ>
2-ПропанолSIGMA-ALDRICH24137-1L-R
АгарозаSCHARLAU50004/ LE3Q2014
Водная монтажная средаVECTOR LABSH-5501
Синтетическая монтажная средаMERCK100579
96% этанолPROLABO
99,9% Абсолют этанолаSCHARLAUET00021000
50% Раствор глутаральдегидаSIGMA-ALDRICHG6403-100ml
85% ГлицеринMERCK104094
99,9% ГлицеринSIGMA-ALDRICHG5516
Магния хлорид гексагидратSIGMA-ALDRICH63064
Неионогенное поверхностно-активное вещество (Nonidet P-40)SIGMA-ALDRICH542334
Ядерное быстрое красное противопятноSIGMA-ALDRICHN3020
Парафиновые пастилкиMERCK111609
ПараформальдегидSIGMA-ALDRICH158127-500g
Фосфатно-солевой буфер (таблетки)SIGMA-ALDRICHP4417-50TAB
Ферроцианат калияMERCK1049840500
Ферроцианид калияMERCK1049731000
Азид натрияSIGMA-ALDRICHS8032
Дезоксихолат натрияSIGMA-ALDRICH30970
Моногидрат дигидрофосфата натрияSIGMA-ALDRICH106346
Дигидрат фосфата натрия двухосновнойSIGMA-ALDRICH71638
ТимолSIGMA-ALDRICHT0501
Трис гидрохлорид (Tris HCl)SIGMA-ALDRICH10812846001 (Roche)
X-GALVENN NOVAR-0004-1000
XyleneVWR ХИМИКАТЫVWRC28973.363
ОБОРУДОВАНИЕ
Одноразовые пластиковые криоформы 15x15x5 ммSAKURA4566
Rotatory MicrotomeLeicaRM2235
КассетыOxford TradeOT-10-9046
Чехлы для микроскопа 24x60 ммVWRECN631-1575
Предметные стекла для микроскопаThermo Scientific, MENZEL-GLÄ SERAGAA000001#12E
Адгезионные микроскопы слайдыThermo Scientific, MENZEL-GLÄ SERJ1820AMNZ
Флотационная водяная баняLeicaHI1210
Одноразовые низкопрофильные лопасти для микротомаFeatherUDM-R35
Парафиновая печьJ.R. SELECTA
Диспенсер для парафинаJ.R. SELECTA
СтереомикроскопLeicaDM500
Полипропиленовые микроцентрифужные пробирки 2,0 мл SIGMA-ALDRICHT2795
Полипропиленовые микроцентрифужные пробирки 1,5 мл SIGMA-ALDRICHT9661
Орбитальный шейкерIKA LabortechnikHS250 BASIC
Мешалка для нагрева BibbyHB502
Вихревой шейкерIKA LabortechnikMS1
Лабораторные весыGRAMFH-2000
Прецизионные весыSartoriusISO9001
pHmeterCrisonBasic 20
OpticFiberOptech PL2000
20824365 2000205 4000490

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shuman, H. A., Silhavy, T. J., Beckwith, J. R. Labeling of proteins with beta-galactosidase by gene fusion. Identification of a cytoplasmic membrane component of the Escherichia coli maltose transport system. The Journal of Biological Chemistry. 255, 168-174 (1980).
  2. Cui, C., Wani, M. A., Wight, D., Kopchick, J., Stambrook, P. J.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Beta galactosidase DetectionX gal StainingMouse Embryo AnalysisParaffin SectioningHistochemical AssayGene Expression TracingWhole Mount StainingCell Lineage StudiesEmbryo ClarificationDevelopmental Biology

Похожие статьи