Method Article

На основе биотина пулдаун Assay для проверки mRNA цели сотовой адаптивной

DOI:

10.3791/57786

⸱

June 12th, 2018

 ,  ,  , 
1School of Biotechnology, Kalinga Institute of Industrial Technology University, 21. Center for AIDS Health Disparities Research Department of Biochemistry and Cancer Biology, Meharry Medical College, 3Kalinga Institute of Industrial Technology University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В настоящем докладе описывается быстрый и надежный метод для проверки мРНК-мишеней клеточных адаптивной. Метод использует Мирна Locked LNA нуклеиновой кислоты на основе синтетических биотинилированным имитирует захватить цель мРНК. Впоследствии, с покрытием стрептавидина магнитные бусы используются для выпадающих целевой мРНК для количественной ПЦР полимеразной цепной реакции.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

МикроРНК (интерферирующим) являются класс малых некодирующей РНК, которые post-transcriptionally регулировать экспрессию клеточных генов. Интерферирующим привязку к 3' непереведенные региона (утр) целевых мРНК ингибировать белков перевод или в некоторых случаях привести к деградации мРНК. Связывание Мирна с 3' УТР цели, которую мРНК при посредничестве 2 – 8 нуклеотидной последовательности семян к 5' концу Мирна. Хотя роль адаптивной как сотовой регуляторных молекул является хорошо организованной, идентификация целевого мРНК с функциональной значимости остается проблемой. Инструменты bioinformatic использовались для прогнозирования последовательностей в течение 3' УТР мРНК как потенциальных объектов для привязки Мирна. Эти средства использовались также определить эволюционной сохранения таких последовательностей среди родственных видов в попытке предсказать функциональную роль. Однако эти вычислительные методы часто создавать ложных положительных результатов и ограничиваются прогнозирования канонические взаимодействие между Мирна и мРНК. Таким образом экспериментальные методы, измеряющих прямую привязку Мирна mRNA цели необходимы для создания функционального взаимодействия. В настоящем докладе мы описываем чувствительный метод для проверки прямого взаимодействия между сотовой микроРНК miR-125b и 3' УТР ППА-1 мРНК. Мы разработать протокол, в котором синтетических биотинилированным miRNA имитирует были transfected в клетки млекопитающих и Мирна мРНК комплекс в lysate сотовых был потянул вниз с покрытием стрептавидина магнитные бусы. Наконец цель, которую мРНК в потянул вниз нуклеиновой кислоты комплекс был количественно с помощью стратегию на основе ПЦР.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

МикроРНК (интерферирующим) малы некодирующих РНК, которые негативно регулируют выражение протеина1. Предшественники микроРНК проживают в кластерах через многие регионы генома, наиболее часто в intergenic регионах и интронов белка кодирование генов2,3. Биогенеза интерферирующим включают транскрипции pri адаптивной от miRNA кодирование генов4. Pri адаптивной проходят последовательной обработки, сначала в ядре и затем в цитоплазме для создания единого мель Зрелые интерферирующим4,5. Впоследствии, Зрелые интерферирующим включены в РНК-комплекс (RISC): multimeric белка РНК комплекс, который включает в себя членом семьи Argonaute белков для целевых признание4,5, 6,7. Зрелые интерферирующим в RISC комплекс преимущественно привязку к 3' УТР целевой mRNAs8,9,10 , но можно также привязать иногда кодирование и 5' УТР регионе мРНК10,11 . Связывание Мирна к мРНК последовательностей результаты в трансляционной глушителей12,13,14 и в некоторых случаях мРНК дестабилизации15. Поскольку один Мирна можно ориентировать многие мРНК, эти регуляторные молекулы участвуют в почти каждый клеточных процессов и были вовлечены в различные болезни условия16,17,18.

Глубокое понимание как интерферирующим регулировать сотовой пути требует идентификации целевого мРНК. Биоинформатика платформ доступны прогнозировать предполагаемый miRNA:mRNA взаимодействия19,20. Эти предсказания полагаются на идеальный Уотсона-крика низкопробный спаривать между 2-8 семян нуклеотидной последовательности Мирна и взаимодополняющих последовательности в рамках целевой мРНК4,21. Кроме того эти инструменты создать вторичную структуру miRNA:mRNA дуплекс, расчет термодинамических параметров этого молекулярного взаимодействия и показать сохранения привязки сайтов различных видов для повышения функциональной значимости цели предсказание. К сожалению эти средства также имеют ограничение прогнозирования ложных положительных целей очень высокий уровень (~ 27 – 70%)15,22. Самое главное эти платформы в silico не признать неканонических взаимодействия интерферирующим с их цели23. Таким образом такой интеллектуальный анализ часто комбинируются с экспериментальные методы для проверки функционально соответствующих целей.

Были разработаны несколько подходов для экспериментально проверить miRNA:mRNA взаимодействия. Генетических экспериментов с использованием Мирна мимики, губки и ингибиторов, которые изменяют уровни интерферирующим в ячейке предоставляют ключи для его регулирования воздействия на25,24,выражение гена целевой26. Кроме того репортер на основе анализов через совместное трансфекции клона, содержащий 3' УТР регионе целевой мРНК и Мирна имитирует или ингибиторов в клетки свидетельствуют о регулирующей функции интерферирующим26. Хотя эти методы имеют решающее значение для изучения post-transcriptional регуляции экспрессии генов, адаптивной, transfection эффективность и pleotropic эффекты изменений в клеточных Мирна уровнях являются основные ограничения этих генетических подходов23, 26. Таким образом взаимодополняющие биохимические методы, проверяющие прямое взаимодействие между Мирна и его цели работают лучше понять клетчатую функцию адаптивной.

Один широко используемый метод изучения прямое взаимодействие между Мирна и его целью является иммунопреципитации RISC комплекс следуют обнаружения mRNA цели в пределах комплекса27,28,29,30 . Недавно усовершенствованный метод ловушки RISC была также использована для выявления Мирна целей; Это пары стабилизации целей в рамках промежуточных RISC-miRNA мРНК с очисткой мРНК-мишеней. Однако эти methodsface присущие проблемы неспецифичные взаимодействия РНК и RNA-связывая протеинов, которые обычно разделяются на клеточном отсеков31,32. Кроме того эти анализы зависит от наличия давности2 белка для иммунопреципитации RISC комплекс33. Учитывая, что давности2 является не только argonaute для эффективного miRNA:mRNA взаимодействие, исключение других argonautes может привести к предвзятым результаты34. Таким образом альтернативные стратегии необходимы для изучения прямую привязку Мирна к мРНК.

В настоящем докладе, мы разрабатываем одноэтапный подход для проверки прямого взаимодействия между Мирна и его целевых мРНК. Во-первых 3' биотинилированным заблокирован нуклеиновой кислоты (LNA) Мирна имитирует являются transfected в mammalian клетках. Затем miRNA:mRNA комплекс в lysate сотовых фиксируются с помощью магнитной бусины стрептавидина покрытием. Целевой мРНК, обязан ее дополнительных Мирна количественно с помощью ПЦР.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. transfection 3'-биотинилированным Мирна

Примечание: Выполните следующие действия внутри стерильной Ламинарный шкаф.

  1. Семя 4 x 105– 5 x 105 ГЭС 293T клеток на скважину в 2 мл полное Дульбекко изменение Eagle среднего (DMEM) [DMEM дополнена 10% плода Bovine сыворотки (ФБС) и 1 х перо стрептококк антибиотик]. Культура клетки в инкубаторе набор при 37 ° C, 5% CO2 на ночь.
  2. Следующий день, проверьте соблюдение покрытием клеток под микроскопом света и здоровья.
    Примечание: Убедитесь, что клетки придерживался и достигнуты соответствующие морфологии перед переходом к следующему шагу. ГЭС 293T клетки обычно готовы к трансфекции 18 – 24 h сообщение обшивки.
  3. В стерильные 1,7 мл отцентрифугировать трубку разбавляют 75 пикомоль биотинилированным микроРНК в 200 мкл минимальных основных СМИ. Передавать этот микс еще 1,7 мл отцентрифугировать трубки содержащие липосом основе трансфекции реагента (8 мкл/хорошо) разбавляют в 200 мкл минимальных основных СМИ. Mix тщательно, но осторожно, закупорить и проинкубируйте 20-25 мин при комнатной температуре, чтобы позволить образование комплексов transfection.
  4. Удалите старые средства массовой информации от пластины 6 хорошо культуры, нежный закупорить и пополнить каждой скважины с 1,6 мл свежеприготовленный полный DMEM (без 1 х перо стрептококк антибиотиков).
  5. Добавьте трансфекции комплексы (1.3) каплям в ячейки 6-ну пластину, используя хорошо калиброванный пипетки. Вихревой мягко пластины при добавлении комплексов для обеспечения их равномерное распределение по всей пластине.
    Примечание: Этот шаг очень важен для достижения высокой эффективности transfection и должны выполняться с осторожностью и терпение.
  6. Культура клетки при 37 ° C и 5% CO2 для по крайней мере 36 часов.

2. Подготовка стрептавидина покрытием магнитные бусы — я

  1. Ресуспензируйте тщательно стрептавидина магнитные бусы, vortexing. Передача 30 мкл суспензии из бисера (на сэмпл) в 2-мл пробирку свободной от нуклеиназы отцентрифугировать.
  2. Место трубка, содержащая подвески из бисера на стенде Сепаратор магнитный шарик («магнит» далее) 2 мин. Убедившись, что бисер тянутся к стороне трубки при контакте с магнитом, осторожно удалите с помощью микропипеткой супернатант.
  3. Добавьте 100 мкл буфера мытья шарик (10 мм трис-Cl рН 7,5, ЭДТА 0,5 мм, 1 M NaCl) бисер. Снять трубку от магнита. Вихрь для 15 s при комнатной температуре мыть бисер.
  4. Место трубка, содержащая бусы на магните для 2 мин и осторожно снимите и выбросьте супернатант.
  5. Повторите шаги, 2.3 и 2.4 для в общей сложности три автомойки. После окончательного мыть шага извлеките трубку от магнита.
  6. 100 мкл РНКазы, освобождая решение (0,1 М NaOH, 0,05 М NaCl) бисер, смешайте хорошо vortexing для 15 s и инкубации при комнатной температуре за 5 минут место трубка, содержащая бусы на магните для 2 мин, тщательно удалить и удалить супернатант.
  7. Повторите шаг 2.6 в общей сложности три раза.
  8. Шарик ресуспендирования решение (0.5 М NaCl) добавить бисер, вихревой 15 s и инкубации при комнатной температуре для 5 минут место ресуспензированы бусы на магните для 2 мин и тщательно удалить супернатант.
  9. Добавьте 200 мкл шарик, преграждая разрешение (1 мкг/мкл BSA, 2 мкг/мкл дрожжи tRNA) бисер. Микс, нежный vortexing для 15 s при комнатной температуре. Инкубируйте на 4 ° C для 16 h (ночь) на вращателе мульти трубки.

3. Подготовка Lysates клетки

  1. Урожай transfected клеток ГЭС 293T нежный соскабливания скребком стерильные клеток внутри ламинарных капюшоном, а затем перевести каждый образец в стерильные 2-мл пробирку отцентрифугировать.
  2. Пелле царапины клетки центрифугированием на 1500 x g за 5 мин Ресуспензируйте гранулы в 1 x стерильные PBS (фосфат буфер солевой), рН 7,2. Центрифуга снова на 1500 x g 5 минут для получения гранул свободной от остатков средств массовой информации. Сразу же окунуться трубка, содержащая Пелле в лед.
  3. Подготовить буфер lysis клетки свежий полный (150 мм NaCl, 25 мм трис-Cl, рН 7,5, 5 DTT, 0,5% IGEPAL, 60 Superase ед/мл, 1 x ингибитор протеазы).
    Примечание: Запас буфера lysis клетки, не хватает IGEPAL, Superase и протеазы ингибитор коктейль может заранее подготовлены и хранятся при комнатной температуре. Подготовьте свежая порция буфера lysis полного ячейки, добавив выше добавки в рекомендуемых окончательный концентрациях в буфер lysis клетки запасов и хранить его на льду.
  4. 260 мкл буфера lysis ледяной полный ячейки для каждого образца в отцентрифугировать трубки (то есть, каждая трубка отцентрифугировать содержит клетки заготавливаемым из одной скважины 6-ну плиты) и Ресуспензируйте Пелле клеток в однородная суспензия, закупорить.
  5. Лизировать клетки, с помощью метода замораживания оттаивания: инкубировать трубы на-80 ° C для 10 – 15 мин. Затем позволяют клеткам оттаять на льду.
  6. Центрифуга результирующая ячейка lysate на 16000 x g 5 мин в охлажденных настольная центрифуга на 4 ° C.
  7. Передать стерильные 1,7 мл отцентрифугировать очищается lysate клетки на льду. Выбросите гранулы.
    Примечание: Окончательный объем очистили lysate должно быть ~ 240-250 мкл.
  8. Добавить 5 М NaCl на очищенное lysate в конечной концентрации 1 м и поддерживать образцы на льду.

4. Подготовка стрептавидина магнитные бусы — II

  1. Готовят свежий полный выпадающее мыть буфера (10 мм KCl, 1,5 мм MgCl2, 10 мм трис-Cl рН 7,5, 5 мм DTT, 1 M NaCl, 0,5% IGEPAL, 60U/мл Superase и 1 x ингибитор протеазы коктейль)
    Примечание: Запас выпадающее мыть буфера хватает коктейль ингибитора протеазы, IGEPAL и Superase может заранее подготовлены и хранятся при комнатной температуре. Подготовьте свежая порция буфера lysis полного ячейки, добавив выше добавки в рекомендуемых окончательный концентрациях в буфер lysis клетки запасов и хранить его на льду.
  2. Место труб, содержащий подготовленный бусины (из шага 2.9) на магните для 2 мин, тщательно снимите и выбросьте супернатант.
  3. Добавьте 150 мкл буфера ледяной полное выпадающего мыть в бисер. Вихрь для 15 s и инкубации при комнатной температуре за 30 – 60 s. место трубы на магните для 2 мин, тщательно снимите и выбросьте супернатант.
  4. Повторите шаг 4.3 в общей сложности 3 раза.
  5. Ресуспензируйте бисер в 300 мкл буфера полное выпадающего мыть.

5. pull-down целевых мРНК miRNA комплексов

  1. Перевести 300 мкл lysate клетки (из шага 3.8) к отцентрифугировать трубка, содержащая 300 мкл бусины (от шага 4.5).
  2. Инкубируйте смесь на смесителе nutating за 1 ч при комнатной температуре.
  3. Место трубки на магните для 5 минут осторожно снимите и выбросьте супернатант.
  4. Добавьте 300 мкл буфера ледяной полное выпадающего мыть в бисер. Вихрь для 15 s при комнатной температуре и место трубки на магните для 5 минут осторожно снимите и выбросьте супернатант.
  5. Повторите шаг 5.4 еще два раза.
  6. Ресуспензируйте бисер в 100 мкл нуклеиназы свободной воды и инкубировать на льду.

6. Общее извлечение RNA, синтез cDNA и ПЦР

  1. Извлечение всего РНК из ресуспензированы бусы (от шага 5.6) с использованием соответствующего метода (см. Таблицу материалы). Ресуспензируйте извлеченные всего РНК в 25 мкл воды, свободной от нуклеиназы. Определение концентрации РНК и качества, используя спектрофотометр (поглощение на 260/280). Подготовьте рабочий запас РНК в 50 нг/мкл.
  2. Выполнить синтез cDNA, в triplicates, используя 50 нг всего РНК (от шага 6.1) с помощью синтеза cDNA соответствующего комплекта (см. Таблицу материалы) с использованием oligo dT грунтовки в окончательном объеме 20 мкл (Таблица 1). Затем нагрузки ПЦР трубы в ПЦР инструмент для выполнения тепловой Велоспорт на условиях, описанных в таблице 2.
  3. Выполнять ПЦР на CDNA (от шага 6.2) с помощью SYBR Зеленая химия (см. таблицу материалы):
    1. Выполните все ПЦР-реакции в triplicates в 96 хорошо четких днище в стерильных условиях.
    2. Аликвота 9 мкл реакционной смеси от мастера ПЦР смесь (см. таблицу 3) в каждой скважине пластины. Затем добавить 1 мкл cDNA в каждой скважине для достижения окончательный объем 10 мкл. уплотнение ПЦР пластину, используя жаростойкие ПЦР пластины герметик и загрузить в инструмент ПЦР
    3. Выполните, тепловой Велоспорт на условиях, описанных в таблице 4.
    4. Нормализации уровня выражения (Ct значения) каждого образца до уровня выражения кинулись элемента управления. Используйте эти значения для вычисления раз изменения в выражении.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Интерферирующим регулировать клеточных процессов путем привязки к целевой мРНК. Таким образом определение мРНК-мишеней являются ключом к понять функции Мирна. Здесь мы подробно метод для выявления мишенью мРНК клеточных Мирна. Этот протокол является адаптирована из Вани и др. 35 с изменением использования биотинилированным на основе LNA Мирна имитирует для выпадающих целевой мРНК. Использование на основе LNA олигонуклеотида имитирует повышает специфичность...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Определение мРНК-мишеней сотовой интерферирующим имеет важное значение для понимания их функции регулирования. Несколько вычислительных средств используются для прогнозирования цели, основанные на взаимодополняемости семян последовательности и сохранения целевого объекта последовательности19,20. Хотя эти инструменты являются ценными, они могут генерировать высокий уровень ложных срабатываний и негативы ложных. Таким образом эти прогнозы являются наряду с эксперим...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют не конкурирующие интересы финансовых и нефинансовых.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа частично поддерживается DA037779 национальных институтов здравоохранения (НИЗ) гранты (до Ю.П.), DA024558, DA30896, DA033892, DA021471, AI22960 и MD007586 (для ПД). Работа также была поддержана RCMI Грант G12MD007586, Вандербильт CTSA Грант UL1RR024975, Мехарри переводческая научно-исследовательский центр (MeTRC) CTSA Грант (U54 RR026140 от NCRR/низ, Грант MD007593 U54 от NIMHD/низ и Теннесси центр СПИДа Исследования (P30 AI110527).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Клеточная линия- HEK293T клеткиATCCCRL-3216
Термоинактивированная фетальная бычья сыворотка (Hi-FBS)GIBCO/Thermofisher10438-026
Dulbecco' s модифицированный Eagle' s среда (DMEM)GIBCO/Thermofisher11995-065
Фосфатный буферный раствор (PBS) (1x)GIBCO/Thermofisher20012-027
Трипсин-ЭДТА (0,25%) GIBCO/Thermofisher25200-056
Раствор пенициллина-стрептомицина (100x)Cellgro/Mediatech30-002-CI
ДНКаза AmbionAM2238
Opti-MEM Восстановленные сывороточные средыGIBCO/Thermofisher3198-088
Liopfectamine 2000 Реагент для трансфекцииInvitrogen/ Thermofisher11668-019
Биотинилированный has-miR-125bExiqon339178/ID-27281622
Биотинилированный омлет контрольExiqon479997-671/ID-714884
IGEPALSigma-Aldrich18896
Стрептавидин Магнитные шарикиPierce88816
Дрожжевая тРНКInvitrogen/Thermofisher15401-011
Бычий сывороточный альбумин (BSA)Sigma-AldrichA2153
Раствор хлорида калия (KCl)Sigma-Aldrich60142
Магния хлорид (MgCl2) растворSigma-AldrichM1028
Гидроксид натрия (NaOH)Sigma-Aldrich795429
Этилендиамина тетрауксусная кислота, раствор динатриевой соли (ЭДТА), 0,5 М, pH 8,0Sigma-AldrichE7889
Дитиотрейтол (DTT)Sigma-Aldrich43815
СуперазаAmbion/ThermofisherAM2694
Коктейль ингибиторов протеазыSigma-AldrichP8340
РНКаза/ДНКаза свободная водаGIBCO/Thermofisher10977-015
RNeasy набор для экстракцииQiagen74104
iScript-Select набор для синтеза кДНКBiorad170-8897
qPCR Primers Invitrogen/Thermofisher
iTaq-Universal SYBR зеленая суперсмесьBiorad172-5120
DynaMag-Spin MagnetInvitrogen/Thermofisher12320D

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Behm-Ansmant, I., Rehwinkel, J., Izaurralde, E. MicroRNAs silence gene expression by repressing protein expression and/or by promoting mRNA decay. Cold Spring Harborsymposia on quantitative biology. 71, 523-530 (2006).
  2. Rodriguez, A., Griffiths-Jones, S., Ashurst, J. L., Bradley, A. Identification of mammalian microRNA host genes and transcription units. Genome research. 14, 1902-1910 (2004).
  3. Lagos-Quintana, M., Rauhut, R., Meyer, J., Borkhardt, A., Tuschl, T. New microRNAs from mouse and human. RNA. 9, 175-179 (2003).
  4. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297 (2004).
  5. Lee, Y., Jeon, K., Lee, J. T., Kim, S., Kim, V. N. MicroRNA maturation: Stepwise processing and subcellular localization. The EMBO journal. 21, 4663-4670 (2002).
  6. Diederichs, S., Haber, D. A. Dual role for argonautes in microRNA processing and posttranscriptional regulation of microRNA expression. Cell. 131, 1097-1108 (2007).
  7. Perron, M. P., Provost, P. Protein interactions and complexes in human microRNA biogenesis and function. Frontiers in bioscience: A journal and virtual library. 13, 2537-2547 (2008).
  8. Wightman, B., Ha, I., Ruvkun, G. Posttranscriptional regulation of the heterochronic gene lin-14 by lin-4 mediates temporal pattern formation in C. elegans. Cell. 75, 855-862 (1993).
  9. Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell. 75, 843-854 (1993).
  10. Kloosterman, W. P., Wienholds, E., Ketting, R. F., Plasterk, R. H. Substrate requirements for let-7 function in the developing zebrafish embryo. Nucleic acids research. 32, 6284-6291 (2004).
  11. Lee, I., et al. New class of microRNA targets containing simultaneous 5'-UTR and 3'-UTR interaction sites. Genome research. 19, 1175-1183 (2009).
  12. Djuranovic, S., Nahvi, A., Green, R. miRNA-mediated gene silencing by translational repression followed by mRNA deadenylation and decay. Science. 336, 237-240 (2012).
  13. Iwakawa, H. O., Tomari, Y. The Functions of MicroRNAs: mRNA Decay and Translational Repression. Trends in cell biology. 25, 651-665 (2015).
  14. Wilczynska, A., Bushell, M. The complexity of miRNA-mediated repression. Cell deathand differentiation. 22, 22-33 (2015).
  15. Selbach, M., et al. Widespread changes in protein synthesis induced by microRNAs. Nature. 455, 58-63 (2008).
  16. Kloosterman, W. P., Plasterk, R. H. The diverse functions of microRNAs in animal development and disease. Developmental cell. 11, 441-450 (2006).
  17. Mendell, J. T., Olson, E. N. MicroRNAs in stress signaling and human disease. Cell. 148, 1172-1187 (2012).
  18. Sayed, D., Abdellatif, M. MicroRNAs in development and disease. Physiologicalreviews. 91, 827-887 (2011).
  19. Steinkraus, B. R., Toegel, M., Fulga, T. A. Tiny giants of gene regulation: Experimental strategies for microRNA functional studies. Wiley interdisciplinary reviews. Developmental biology. 5, 311-362 (2016).
  20. Watanabe, Y., Tomita, M., Kanai, A. Computational methods for microRNA target prediction. Methods in enzymology. , 65-86 (2007).
  21. Lewis, B. P., Shih, I. H., Jones-Rhoades, M. W., Bartel, D. P., Burge, C. B. Prediction of mammalian microRNA targets. Cell. 115, 787-798 (2003).
  22. Baek, D., et al. The impact of microRNAs on protein output. Nature. 455, 64-71 (2008).
  23. Thomson, D. W., Bracken, C. P., Goodall, G. J. Experimental strategies for microRNA target identification. Nucleic acids research. 39, 6845-6853 (2011).
  24. Ebert, M. S., Neilson, J. R., Sharp, P. A. MicroRNA sponges: Competitive inhibitors of small RNAs in mammalian cells. Nature. 4, 721-726 (2007).
  25. Elmen, J., et al. Antagonism of microRNA-122 in mice by systemically administered LNA-antimiR leads to up-regulation of a large set of predicted target mRNAs in the liver. Nucleic acids research. 36, 1153-1162 (2008).
  26. Jin, H. Y., et al. Transfection of microRNA mimics should be used with caution. Frontiersin genetics. 6, 340(2015).
  27. Beitzinger, M., Peters, L., Zhu, J. Y., Kremmer, E., Meister, G. Identification of human microRNA targets from isolated argonaute protein complexes. RNA biology. 4, 76-84 (2007).
  28. Chi, S. W., Zang, J. B., Mele, A., Darnell, R. B. Argonaute HITS-CLIP decodes microRNA-mRNA interaction maps. Nature. 460, 479-486 (2009).
  29. Easow, G., Teleman, A. A., Cohen, S. M. Isolation of microRNA targets by miRNP immunopurification. RNA. 13, 1198-1204 (2007).
  30. Hafner, M., et al. Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP. Cell. 141, 129-141 (2010).
  31. Cambronne, X. A., Shen, R., Auer, P. L., Goodman, R. H. Capturing microRNA targets using an RNA-induced silencing complex (RISC)-trap approach. Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America. , 20473-20478 (2012).
  32. Mili, S., Steitz, J. A. Evidence for reassociation of RNA-binding proteins after cell lysis: implications for the interpretation of immunoprecipitation analyses. RNA. 10, 1692-1694 (2004).
  33. Meister, G., et al. Human Argonaute2 mediates RNA cleavage targeted by miRNAs and siRNAs. Molecular cell. 15, 185-197 (2004).
  34. Su, H., Trombly, M. I., Chen, J., Wang, X. Essential and overlapping functions for mammalian Argonautes in microRNA silencing. Genes & development. 23, 304-317 (2009).
  35. Wani, S., Cloonan, N. Profiling direct mRNA-microRNA interactions using synthetic biotinylated microRNA-duplexes. bioRxiv. , (2014).
  36. Grunweller, A., Hartmann, R. K. Locked nucleic acid oligonucleotides: The next generation of antisense agents? BioDrugs: clinical immunotherapeutics,biopharmaceuticals and gene therapy. 21, 235-243 (2007).
  37. Guerard, M., et al. Locked nucleic acid (LNA): Based single-stranded oligonucleotides are not genotoxic. Environmental and molecular mutagenesis. 58, 112-121 (2017).
  38. Song, R., Ro, S., Yan, W. In situ hybridization detection of microRNAs. Methods inmolecular biology. , 287-294 (2010).
  39. Edbauer, D., et al. Regulation of synaptic structure and function by FMRP-associated microRNAs miR-125b and miR-132. Neuron. 65, 373-384 (2010).
  40. Le, M. T., et al. MicroRNA-125b promotes neuronal differentiation in human cells by repressing multiple targets. Molecular and cellular biology. 29, 5290-5305 (2009).
  41. Dash, S., et al. Poly (ADP-Ribose) Polymerase-1 (PARP-1) induction by cocaine is post-transcriptionally regulated by miR-125b. eNeuro. 4, (2017).
  42. Micheli, F., et al. Regulation of proapoptotic proteins Bak1 and p53 by miR-125b in an experimental model of Alzheimer's disease: Protective role of 17beta-estradiol. Neuroscience letters. 629, 234-240 (2016).
  43. Orom, U. A., Lund, A. H. Isolation of microRNA targets using biotinylated synthetic microRNAs. Methods. 43, 162-165 (2007).
  44. Cloonan, N. Re-thinking miRNA-mRNA interactions: Intertwining issues confound target discovery. BioEssays: News and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 37, 379-388 (2015).
  45. Guo, Y. E., Steitz, J. A. 3'-Biotin-tagged microRNA-27 does not associate with Argonaute proteins in cells. RNA. 20, 985-988 (2014).
  46. Mook, O., et al. In vivo efficacy and off-target effects of locked nucleic acid (LNA) and unlocked nucleic acid (UNA) modified siRNA and small internally segmented interfering RNA (sisiRNA) in mice bearing human tumor xenografts. Artificial DNA, PNA & XNA. 1, 36-44 (2010).
  47. Owczarzy, R., You, Y., Groth, C. L., Tataurov, A. V. Stability and mismatch discrimination of locked nucleic acid-DNA duplexes. Biochemistry. 50, 9352-9367 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Biotin based Pulldown AssaymiRNA Target ValidationStreptavidin coated Magnetic BeadsBiotinylated miRNA MimicsLocked Nucleic Acid MimicsqPCR based QuantificationCellular Lysate PreparationmiR 125b PARP 1 InteractionNucleic Acid Pull downRNA Isolation Protocol

Related Articles