Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Очистка и восстановление TRPV1 для спектроскопического анализа

7.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/57796

⸱

3 июля 2018 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, University of Tennessee Health Science Center, 2Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University Medical Center, 3CuriRX, Inc.

В этой статье

Краткое содержание

Эта статья описывает конкретные методы для получения биохимических количества моющих средств солюбилизирован TRPV1 для спектроскопического анализа. Объединенные протоколы обеспечивают биохимические и биофизические инструменты, которые могут быть адаптированы для облегчения структурных и функциональных исследований для млекопитающих ионных каналов в среде с контролируемой мембраны.

Аннотация

Многодисциплинарного ионных каналов передают несколько раздражителей различной природы в аллостерические изменения; Эти динамические конформации являются сложными для определения и остаются в значительной степени неизвестно. С последних достижений в сингл частица крио электронная микроскопия (крио ЭМ) пролить свет на структурные особенности сайтов связывания агониста и механизм активации нескольких ионных каналов этапе устанавливается для углубленного динамического анализа их стробирования механизмы, с помощью спектроскопических подходов. Спектроскопические методы электронного парамагнитного резонанса (НРА) и двойной электронно электронного резонанса (олень) были главным образом ограничивается изучением прокариот ионных каналов, которые могут быть очищены в больших количествах. Требование для большого количества функциональных и стабильные мембранных белков препятствует изучения млекопитающих ионных каналов, с помощью этих подходов. ОРЭД и оленей предлагают множество преимуществ, включая определение структуры и динамических изменений мобильных белка регионов, хотя и с низким разрешением, что может быть трудно получить кристаллографии рентгеновского снимка или крио EM, и мониторинга реверсивные стробирования Переход (т.е., закрытый, Открытый, сенсибилизированных и десенсибилизированных). Здесь мы предоставляем протоколы для получения миллиграммов функциональных моющих средств солюбилизирован Переходный рецепторный потенциал катиона член subfamily канала V 1 (TRPV1), могут быть помечены для оленей и ЭПР спектроскопии.

Введение

С последних достижений в сингл частица крио электронная микроскопия (крио ЭМ) были получены млекопитающих ионного канала структуры чрезвычайные скоростью. Особенно структурные исследования многодисциплинарного ионных каналов, таких как Переходный рецепторный потенциал vanilloid 1 (TRPV1), обеспечили дальнейшее понимание ее активации механизмов1,2,3, 4 , 5. Однако, динамические сведения о встроенных в среде мембранных ионных каналов требуется понять их многодисциплинарного механизмы стробирования и наркотиков привязки.

Электронного парамагнитного резонанса (НРА) и двойной электронно электрон рентгеновская спектроскопия резонанса (олень) предоставили некоторые из наиболее окончательное механистической модели для ионных каналов6,,78,9 , 10 , 11 , 12 , 13. Эти подходы были главным образом ограничивается рассмотрение прокариот и archeal ионные каналы, которые дают большое количество стирального порошка очищенной белков при оверэкспрессировали бактерий. С развитием производства белков мембраны эукариотической насекомых и mammalian клеток для функциональных и структурных характеристик14,,1516это теперь возможно получить биохимические количество стирального порошка очищенной белков для спектроскопических исследований.

ОРЭД и олени сигналы возникают из paramagneticspin этикетку (SL) (например, methanethiosulfonate) к одной цистеин остатков в протеине. Спин этикетки сообщить три вида структурной информации: движение, уровни доступности и расстояния. Эта информация позволяет определить похоронены в пределах белка или подвергаются мембраны или водной среды в АПО и лиганд граница государства13,17,18,19остатков. В контексте структуры с высоким разрешением (при наличии) оленей и ОРЭД данных предоставляют коллекцию ограничений, применяемых для расчета динамических моделей в их родной среде при мониторинге реверсивные стробирования перехода (т.е., закрытый, Открытый, ознакомлены и десенсибилизированных). Кроме того гибкая регионов, которые могут быть трудно определить, рентгеноструктурного анализа или крио EM могут быть получены с помощью этих наборов данных для присвоения вторичных структур, а также расположение в пределах белка20. Крио-EM структур, полученные в nanodiscs липидов представили ценную информацию о стробирования ионных каналов3,21,,2223,24, 25; Однако спектроскопические подходы может обеспечить динамическую информацию из конформационных государств (например, температурные изменения), которые могут быть трудно определить с помощью крио EM.

Необходимо преодолеть многие трудности для осуществления ОРЭД и оленей, включая отсутствие функции протеина при удалении всех остатков цистеина (особенно обильный в mammalian каналы), низкое содержание белка урожая, белок нестабильность во время очищения и после отжима маркировки и агрегации белков в моющего средства или липосом. Здесь мы разработали протоколы преодолеть эти критические барьеры и получили сведения о млекопитающих сенсорных рецепторов оленей и ОРЭД спектров. Здесь цель заключается в том, чтобы описать методологий для выражения, очистки, маркировки и восстановление функциональной минимальной хвоща менее крыса TRPV1 (eTRPV1) построить для спектроскопического анализа. Эта методология является подходящим для тех мембранных белков, что держать их функции, несмотря на удаление остатков цистеина или содержат цистеина формируя дисульфидными облигаций. Эта коллекция протоколов могут быть адаптированы для спектроскопического анализа других млекопитающих ионных каналов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. TRPV1 мутагенеза

Примечание: Минимальный TRPV1 конструкции для спектроскопического анализа26 был построен из полнометражных хвоща менее канала TRPV127 с помощью метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) (рис. 1). Эта хвоща менее минимальной TRPV1 конструкция (упоминаемый как eTRPV1 ниже) состоит из остатков 110-603 и 627-764. eTRPV1 был клонирован в ОУП (на основе pcDNA3.1 вектор) для функционального анализа и вектор рекомбинантных доноров28 , содержащий 8 x гистидин мальтоза связывающий белок (MBP)-табак etch вирус (TEV) для очистки (рис. 2A) и выражение. Цистеин сингл–eTRPV1, мутанты были сгенерированы с помощью сайта Направленный мутагенез. Вектор и канал последовательности указаны в дополнительный файл 1: дополнительные методы.

  1. Дизайн мутагенеза грунты с онлайн инструменты29.
  2. Смешайте в 0,2 мл: 5 мкл 10 x буфер реакции, 1 мкл dNTP смеси (100 мм), 1 мкл 10 мкм прямого и обратного олигонуклеотиды, 1 мкл 100 нг/мкл eTRPV1 шаблона ДНК26, 1.5 мкл ДМСО, 1 мкл мутагенеза фермента и 38,5 мкл обессоленной воды. Перед укладкой труб в Термоциклер спина смеси.
  3. Выполняйте PCR мутагенеза.
    1. Выполнить () Денатурация при 95 ° C на 2 мин, (b) Денатурация при 95 ° C 20 s, (c) отжиг при 60 ° C для 10 s и (d) удлинение 68 ° C в течение 4 мин (30 сек на 1 КБ). Повторите шаги b-d для 18 циклов, а затем выполнить удлинение 68 ° C за 5 мин и поддерживать реакции на 4 ° C до дальнейшего использования.
  4. Добавить 2 мкл Dpnя ферментные реакции; смешать и затем инкубации при 37 ° C за 30 мин.
  5. Выполнить преобразование
    1. Оттепель E. coli сведущие клетки на льду.
    2. Чтобы предварительно охлажденным 14 мл стерильной пробирке добавьте 75 мкл компетентных клеток и 10 мкл Dpnя лечил смеси ПЦР. Осторожно перемешать.
    3. Инкубировать реакции на льду на 30 мин поддерживать трубки при 42 ° C для 45 s и затем сразу же поместить его на льду на 2 мин пластины смесь на бульоне Лурия (LB)-плита агара, содержащих carbenicillin (0,2 мг/мл). Инкубировать пластину на ночь при 37 ° C.
    4. Урожай по крайней мере три одной колонии от плиты и прививать каждый по 4 мл LB, содержащих carbenicillin (0,2 мг/мл) с использованием 14-мл стерильной пробирке. Инкубировать культур на ночь при 37 ° C и погрозит 250 об/мин.
    5. Спин вниз ночь культур на 8000 x g 10 мин и извлечь ДНК следуя инструкциям коммерчески доступных мини-подготовка комплектов.
    6. Проверьте наличие одного цистеин мутантов, стандартных автоматизированных секвенирования ДНК (см. Таблицу материалы).

2. функциональный анализ eTRPV1 и один цистеин мутантов

  1. HEK293 клеток линии Трансфекция 30
    1. Культура клетки HEK293 в 6 - хорошо пластин в 2 мл среды высокой глюкозы (DMEM) за хорошо (37 ° C, 5% CO2, 95% влажность). Подготовка HEK293 клетки, которые являются 70 \u2012 80% притока.
    2. Подготовьте смесь трансфекции в двух отдельных 1,5 мл микро-пробирок.
      1. Для реакции A добавьте 0,5 мкг eTRPV1 или хвоща мутант содержащих pMO 250 мкл минимальные основные среды (например Opti-MEM). Для реакции B добавьте 3 мкл Реагента трансфекции 250 мкл минимальные основные среды. Инкубируйте каждой реакции на 5 мин при комнатной температуре (RT).
      2. Mix реакции A и B с Пипетка 1-мл. Инкубировать смесь для 45 мин на RT.
    3. Также удалите 500 мкл культуры средств массовой информации из 70-80% притока и 500 мкл реакционной смеси. Хранить пластины на ночь для Ca2 + изображений (37 ° C, 5% CO2и 95% влажности).
  2. CA2 + изображений в HEK293 клетках 30
    1. Очистить coverslips стекла диаметром 12 мм с этанол и вода и поместите их в тарелку 24-хорошо.
    2. 75 мкл поли l Лизин в центре каждого coverslip и хранить пластину для 45 мин (37 ° C, 5% CO2, 95% влажность).
    3. Удалите избыток поли l лизин и мыть coverslips три раза с фосфат амортизированное saline (PBS), чтобы удалить любые остатки.
    4. После coverslips будете готовы, переходите к отсоединить клетки от 6-ну пластины.
    5. Удалите средства массовой информации и 500 мкл теплых PBS (37 ° C) для мытья.
    6. Удаление PBS, 500 мкл трипсина и инкубировать в течение 1 мин.
    7. 500 мкл теплой культуре СМИ (37 ° C) для остановки реакции пищеварение и смешать с пипеткой; Избегайте формирования пузырьков. Если необходимо, отрегулировать концентрацию клеток, разбавления этой ресуспендирования с больше культуры средств массовой информации.
    8. Семя 250 мкл transfected клеток HEK293 (70% притока) плюс 250 мкл культуры средств массовой информации (500 мкл окончательный объем в колодец) на предварительно очищенной coverslips и дайте им успокоиться (для крепления) для 1-2 ч в инкубатор (37 ° C, 5% СО2, влажность 95%).
    9. В то же время, готовить раствор загрузки путем добавления кислоты 0,02% плюрониевого и 1 мкм Fluo-4-ам звонаря буфер. Хорошо перемешайте раствор.
    10. Извлеките носитель культуры HEK293 из колодца и 500 мкл раствора загрузки. Инкубируйте клетки для 1 h (37 ° C, 5% CO2, влажность 95%). Вымойте клетки Fluo-4-загружены дважды с теплой звонаря буфера.
    11. Место coverslip с загруженной клеток в чашке Петри 10-мм в микроскопа (с использованием 10 X цели; 494 Нм возбуждения и 506 выбросов Нм) для выполнения внутриклеточных Ca2 + измерений.
    12. Измерения изменений в интенсивности флуоресценции после perfusing соответствующих лигандами (например, 10 мкм капсаицин) с использованием имеющегося программного обеспечения (см. Таблицу материалы).
  3. мРНК и подготовка Xenopus laevis ооцитов 30
    1. Линеаризации eTRPV1 и один цистеин мутантов содержащих ОУП с Pmeя за 1 ч при 37 ° C. Чистота после инструкции коммерчески доступных очистки наборы ДНК.
    2. Использование линеаризации и очищены ННО синтезировать ограничен РНК с коммерчески доступных комплект совместим с T7 РНК-полимеразы.
    3. Очистите ограничен RNAs согласно коммерчески доступных очистки наборы. Подсчитать сумму РНК путем измерения оптической плотности на 260 Нм длины волны.
    4. Передача 5 \u2012 10 мл X. laevis ооцитов (коммерчески доступных) в 50-мл конические трубка, содержащая 20 мл ND96 раствора (96 мм NaCl, 2 мм KCl, 5 мм HEPES, 1 мм MgCl2; рН 7,4) с 1 мг/мл коллагеназы и nutate для 50 мин на RT.
    5. Промыть яйцеклеток в ND96 до тех пор, пока раствор не станет прозрачным; добавить свежие коллагеназы и встряхнуть для 30 мин на RT. изучения яйцеклеток под микроскопом стерео и остановить пищеварение, когда внешний слой фолликулярной (глянцевый слой с красный кровеносных сосудов) отсутствует в большинстве ооцитов (90%). Промывайте яйцеклеток в ND96 до тех пор, пока раствор не станет прозрачным.
    6. Ооциты передачи к 50 мл полистирола с ND96 плюс 1 мм CaCl2 и трясти за 1 ч.-переваривается ооцитов будет придерживаться полистирола трубки.
    7. Вымойте яйцеклеток с ND96 плюс 1 мм2 и дополнение решение CaCl с 50 мкг/мл гентамицина и 50 мкг/мл тетрациклина.
      Примечание: Тетрациклин содержащих решения защищайте от воздействия света.
    8. Выберите большой яйцеклетки без поврежденных мембран и отображение четкое разделение между животного и растительного поляков. Пусть ооциты восстановить за 4 ч до микроинъекции на 16 ° C.
    9. Использовать стеклянные пипетки (O.D.: 1.11 мм, ID: 0.5 и длина 8,8 см) для вставки 1-5 нг mRNA от eTRPV1 и один цистеин мутантов в ооцитов, с помощью системы nanoliter инжектор (46 nL/s) и стерео микроскоп (2 X увеличение). Хранить яйцеклеток на 16 ° C в ND96, дополненная CaCl2 и антибиотики (гентамицин/тетрациклинов 1 x).
    10. После 72 ч ток макроскопических с помощью приобретения системы двух электродом напряжения зажим (TEVC)31.
    11. Вытяните боросиликатного стекла пипетки (0,3 MΩ) и заполнить их с 3 M KCl.
    12. Яйцеклетка в зале записи с помощью пипетки передачи и perfuse раствор для ванн (120 мм NaCl, 2 мм KCl, 2 мм MgCl2, 1 мм EGTA и 10 мм HEPES решение; рН 7,4) при низкой скорости.
    13. Погружайте обоих электродов в Ванна решение скорректировать их смещения пипеткой. Аккуратно вставьте пипеткой электродов (боросиликатное стекло пипетки; Диаметр: 1.5 мм, ID: 1.10 и длиной 10 см) в яйцеклетку до крошечных отступы наблюдается под микроскопом стерео (2 крат), а также изменения мембранного потенциала.
    14. Изменить параметры усилителя для записи режим и мера макроскопических токов при применении пандус мембраной от -80 до + 80 МВ 1 s. нагрузки перфузии системы с решения, используемые в шаг 2.3.12 рН 7,4 (как элемент управления) и при рН 5 для проверки деятельности eTRPV1.

3. Создание рекомбинантных Bacmid и бакуловирусы для выражения протеина

  1. Bacmid
    1. Трансформировать 100 мкл DH10Bac E. coli компетентных клеток с 7,5 ng вектора рекомбинантных доноров, содержащие eTRPV1 или одно цистеин мутантов.
    2. Добавить 900 мкл SOC СМИ (20 мг/мл Триптон, 5 мг/мл дрожжевой экстракт, 2,5 мм KCl, 10 мм MgCl2, 10 мм MgSO4и 20 мм глюкозы) и проинкубируйте 6-7 ч при 37 ° C и 225 об/мин.
    3. Семя 100 мкл непосредственно из смеси и серийных разведений (1/10 и 1/100), в LB-агар плиты, содержащие 100 мкг/мл X-Гал, 40 мкг/мл ИПТГ, 7 гентамицин мкг/мл, 10 мкг/мл тетрациклин и канамицин 50 мкг/мл. Инкубировать пластины для по крайней мере 48 ч при 37 ° C.
    4. Выберите белый колоний, которые являются 2 мм в диаметре, так как синий колоний не хватает Вставка интерес. Используйте стерео микроскоп для проверки, что белых колоний не содержат каких-либо синие пятна.
    5. Урожай по меньшей мере три одного колоний и перенести их в стерильную пробирку 14-мл, содержащих 4 мл LB СМИ дополнена 7 гентамицин мкг/мл, 10 мкг/мл тетрациклин и канамицин 50 мкг/мл. Инкубируйте клетки на ночь (~ 16 h) при 37 ° C и 250 об/мин.
    6. Возьмите 1,5 мл ночи культур и изолировать bacmid рекомбинантных ДНК (см. дополнительный файл 1 для подробного протокола). Храните bacmid на 4 ° C на срок до двух месяцев.
      Примечание: Подготовьте запасы глицерина DH10Bac E. coli , содержащие bacmid ДНК. Возьмите 300 мкл культуры и добавить 200 мкл глицерина на 50% (концентрация окончательный глицерина 20%). Храните Алиготе-80 ° c до дальнейшего использования.
    7. Проверить наличие eTRPV1 в рекомбинантной bacmid, с помощью ПЦР (см 1 дополнительный файл для подробного протокола).
  2. Бакуловирусы
    Примечание: Для выполнения этой процедуры, transfect Sf9 насекомых клетки в формате 6-хорошо. На основе в ну даны все суммы и томов. Избегайте использования антибиотиков.
    1. Пластина 1 х 106 Sf9 клеток в 2 мл насекомых ячейки СМИ. Позволяют клеткам вложить по крайней мере 45 мин.
    2. Разбавьте 1 мкг bacmid рекомбинантных ДНК в 100 мкл насекомых ячейки СМИ. Осторожно перемешать.
    3. 6 мкл Реагента трансфекции (TR) разбавляют в 100 мкл насекомых ячейки СМИ. Осторожно перемешать.
    4. Объединить решения ДНК и TR (от шаги 3.2.2 и 3.2.3, соответственно). Осторожно перемешать и Инкубируйте 30 мин на RT.
    5. Добавить 0,8 мл СМИ насекомых клеток ДНК/TR смеси; Осторожно перемешать.
    6. Удалить насекомых ячейки СМИ из Sf9 клеток и мыть раз с 1 мл свежей среды.
    7. Удалите средство мыть и добавить смесь ДНК/TR (3.2.2 \u2012 3.2.5) в клетки. Инкубируйте клетки при 27 ° C за 5 ч (без агитации).
    8. Снимите смесь transfection и заменить 2 мл СМИ насекомых клеток, содержащих 0,5% плода бычьим сывороточным (ФБС). Инкубируйте клетки при 27 ° C в течение пяти дней.
      ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Предотвращения испарения ячейки СМИ, заполнив пустые скважин с средствами массовой информации и пластина 6-колодец с двумя слоями пленки парафина.
    9. Перевести средства массовой информации культуры клеток в 15 мл пластиковых пробирок. Изолировать первый проход (P1) вирусных акций, крутя трубки на 8000 x g 15 мин при 4 ° C. Супернатант передать чистые 15 мл пластиковых пробирок и немедленно хранить при 4 ° C.
      Примечание: Защитите вирус от воздействия света, покрывая трубы с алюминиевой фольгой.
    10. Для второго поколения (P2) вирусных запасов, положить 25 мл суспензии культуры клеток насекомых СМИ в6 Sf9 1 x 10 кл/мл, содержащий 2% FBS в 125 мл флакон (дном и вентилируемые). Добавьте 25 мкл P1 вируса в культуре 25 мл.
    11. Инкубируйте культуры при 27 ° C за 72 ч.
    12. Урожай вирусные акции P2, передача культуры новой 50 мл трубки и центрифуги на 8000 x g 15 мин при 4 ° C.
    13. Супернатант передать новой 50 мл трубки и немедленно хранить при 4 ° C.
      Примечание: Защитите вирус от воздействия света, покрывая трубы с алюминиевой фольгой. Выполнение небольших эксперимент к Титруйте вирус/Sf9 коэффициент P2 для оптимального TRPV1 выражения (см. дополнительный файл 1 для подробного протокола, раздел 4 под названием «Мелких эксперимент для P2 вирус.»)
    14. Для крупномасштабных белков, задайте 1-Л Sf9 клеток подвеска культуры в 2 х 106 клеток/мл в СМИ насекомых клеток с 0,5% FBS в колбе 2.8 L боросиликатного стекла.
    15. Добавьте 1 mL P2 вирус фонда культуры 1-L и Инкубируйте на 27 ° C в течение 72 ч.
      Примечание: На третий день, плотность клеток должно быть в 1,5 – 2,5 х 106 клеток/мл.

4. eTRPV1 и один цистеин мутант очистки

  1. Мембраны изоляции28
    1. Урожай, 1-L насекомых клеточной культуры подвеска на спиннинг на 4500 x g, 4 ° C, 20 мин весят гранулы ячейки (это ожидается около 6-9 г).
    2. Ресуспензируйте Пелле клеток в 25 мл ледяной буфера A (сахароза 36,5 мм, 2 мм tris(2-carboxyethyl) фосфина (TCEP) и 50 мм трис; рН 7,4) в присутствии ингибиторов протеазы (1 мм phenylmethyl сульфонилфторид (PMSF), 3 мкг/мл leupeptin, 3 мкг/мл Апротинин и pepstatin 1 мкг/мл). Дезагрегировать скопления клеток для получения однородной подвеска и повернуть на 4 ° C в течение 20 мин.
    3. Разбейте ячейки, используя ручной (dounce ткани мясорубку) или высокого давления гомогенизатора. Удалите мусор клетки центрифугированием в 8000 x g 20 мин при 4 ° C.
      Примечание: Держите лизированных клетках и трубы на льду во время всего процесса.
    4. Собирать супернатант и центрифуги на 100,000 x г за 30 мин при 4 ° C. Отменить супернатант и Ресуспензируйте Пелле мембраны в общем объеме 20 мл ледяной буфера B (150 мм NaCl, 10% глицерина, 50 мм HEPES мм TCEP, 2; рН 7,4), дополняют ингибиторы протеазы (как в шаге 4.1.2).
    5. Аликвота 20 мл мембраны подвеска в 50-мл пробирок и флэш замораживание в жидком азоте. Хранить образцы на-80 ° C до дальнейшего использования.
  2. Очистка белков26,28
    1. Оттепель аликвоты мембраны на льду и добавить 3 мл n-Docecyl-β-D-Maltopyranoside (DDM) на трубу (бульон 200 мм). Поворот трубы для 2 ч при 4 ° C.
    2. Центрифугуйте образцы на 100,000 x г за 30 мин при 4 ° C. Собирать супернатант и добавить 1 мл чистой влажной амилоза смолы. Вращать смесь для 2 ч при 4 ° C. Загрузите белка/амилоза смесь в столбцах хроматографии потока гравитации.
      Осторожностью: Не позволяйте смолы сухой во время мойки.
    3. Вымойте белка прыгните амилоза смолы с 10 раз кровати объемы ледяной буфера C (150 мм NaCl, 10% глицерина, 50 мм HEPES, 0.5 мм DDM, 0,1 мкг/мл asolectin, 0,5 мм TCEP; рН 7,4). Промыть 10 кровати объемы ледяной D буфера (150 мм NaCl, 10% глицерина, 50 мм HEPES, 0.5 мм DDM, 0,1 мкг/мл asolectin, рН 7,4).
      Примечание: Перед стиркой, Дега D буфера без моющего средства или липидов, продувки азотом. После дегазации добавьте DDM и asolectin.
    4. Элюировать eTRPV1 белка с фракции 0,5 мл, до 5 мл, ледяной дегазации D буфера, дополнена мальтоза 20 мм. Если это возможно выполните моет и элюции при 4 ° C.
    5. Подсчитать количество белка путем измерения поглощение на длине волны 280 Нм.
      Примечание: Этот протокол дает 0,5-1,0 мг белка на литр культуры. Белка урожай могут различаться для каждого eTRPV1 сингл цистеин мутант. Для оленей и ОРЭД экспериментов, расти 4 \u2012 6 L культуры.

5. eTRPV1 сингл цистеина Mutant Site-Directed спина маркировки

  1. Концентрат eTRPV1-содержащие фракции с помощью центробежного фильтра (отсечки = 100 кДа) до 2 \u2012 2,5 мг/мл для маркировки (циклы 7000 x g 2 мин при температуре 4 ° C).
  2. Добавьте десятикратного Молярная избыток (3 раза, каждые 30 мин) (1-oxyl-2,2,5,5-tetra-methylpyrrolidin-3-yl) метил methanethiosulfonate (MTSSL) спина метки из 100-мм Стоковый раствор в ДМСО в концентрированных белков (eTRPV1 мономеров: MTSSL в 1:10 молярное соотношение) 17. Держите реакции в темноте на RT 1 ч 30 мин, после инкубации на ночь при 4 ° C.
    Примечание: В этот шаг, MBP может быть удалены путем добавления ТэВ протеазы в течение ночи спин маркировки инкубации.
  3. Спин меченых eTRPV1 нагрузки на размер столбца исключение хроматографии достижение равновесного уровня е буфера (150 мм NaCl, 20 HEPES, 0,5 мм DDM; рН 7,4), контролируется системой жидкостной хроматографии (ПСОК) быстро белка. Сбор фракций, содержащих Тетрамер eTRPV1.
    Примечание: Не включают 10% глицерина в этот шаг, как это снижает эффективность реорганизации.
  4. Подсчитать количество белка путем измерения поглощение на длине волны 280 Нм.
  5. Оценка чистоты образца, запустив геля SDS-PAGE (пятно-гель, 4 \u2012 20%). Образец теперь готов для спектроскопических измерений в раствор и/или proteoliposomes.

6. eTRPV1 спин меченых одного хвоща мутант растворения

  1. Сухие 10 мг asolectin с помощью роторный испаритель под вакуумом (≤100 мбар) за 1 час при 40 ° C. Чтобы asolectin липосомы, добавляют 1 мл буфера F (200 мм NaCl, 5 мм швабры; рН 7,4) и sonicate смесь для 15 минут или до тех пор, пока образец является однородной.
  2. Дестабилизировать липосомы, добавив DDM до конечной концентрации 2 мм и Инкубируйте 30 мин на RT.
  3. Концентрат помечены белка в 2 мг/мл и добавить его в липосомах, с использованием в соотношении 1:5 белка/липидов (масса: масса).
    ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Важно сохранить вышеупомянутые белка концентрации, поскольку спин маркировки эффективность снижается при низких концентрациях и высокой, что белок может выпадать в осадок.
  4. Добавление F буфера для регулировки белка/липосом смесь DDM мицеллы критической концентрации (CMC) и инкубировать на ночь при 4 ° C с нежным агитации.
  5. Двойной объем смеси белков/липосом буфера F и удалить моющим средством, последовательно добавив три аликвоты неполярных шарики полистироля адсорбента (30 мг, 50 мг и 80 мг) каждые 1-h с нежным агитации на RT.
  6. Загрузите смесь на фильтр столбцов (тяжести потока хроматографии колонка) удалить бисер и передать proteoliposomes смесь ультрацентрифуга трубки. Центрифугуйте образцы на 100,000 x g за 1 час при 4 ° C. Отменить супернатант и Ресуспензируйте гранулы в 30 мкл буфера F.
    Примечание: Образцы готовы для спектроскопического анализа и инъекции в Xenopus ооцитов. Если образцы не может использоваться в тот же день, флэш заморозить их в жидком азоте и хранить при температуре-80 ° C.
  7. Proteoliposomes -Xenopus ооцитов электрофизиологии26,32
    1. Придать 50 nL различных разведениях спин меченых proteoliposomes в Xenopus ооцитов, как описано в разделе 2.2.
    2. Выполнения TEVC измерений после 12 h инъекции, как описано в разделе 2.3.10.
  8. Перейдите к выполнить Спектроскопические измерения и анализа (раздел 7).

7. оленей и ОРЭД рентгеновская спектроскопия

  1. Двойной электронно Электронная спектроскопия резонанса (олень).
    1. Выполнения измерений оленей в импульсных ЭПР спектрометр на Q-полоса частот (34 ГГц) и оснащена 10-W усилитель с последовательностью бесплатно четыре пульс мертвых время на 83° с помощью программного обеспечения, поставляемые изготовителем33.
    2. Дополнить 50 мкм стирального порошка очищенной eTRPV1 спин меченых хвоща мутантов в буфер E (шаг 5.5) с 30% (v/v) глицерином для крио защиты.
    3. Загрузите образец в запечатанном кварцевый капилляр и спина в нижней части трубки центрифугированием краткий низкой скорости (100 x g).
    4. Место капиллярной трубки в жидкий азот, чтобы заморозить образца. Образцы можно хранить в этот момент в-80 ° C для последующих измерений.
    5. Поместите образец непосредственно в резонаторе Микроволновая печь и дайте ему заново сбалансировать °-83 на 10 \u2012 20 мин.
    6. Измерить образца с помощью стандартного протокола DEER 4 пульс, mw1 (π/2) – τ1 – mw1 (π) – τ1 – mw2 (π) – τ2 – (π) mw1 – τ2 – эхо34. Длины импульса для mw1 (π/2) и (π) mw1, 10 и 20 НС, соответственно и 40 НС для mw2 (π). Задайте частоту разделения на 63 МГц.
      Примечание: Основная оленей распада данные могут быть проанализированы с дома встроенный программного обеспечения (например в Matlab) предполагает сумму распределения Гаусса для описания расстояния между спин этикетки19,35.
  2. Непрерывном (CW) ЭПР спектроскопии
    1. Выполните CW EPR эксперименты на RT на X-диапазона (9,6 ГГц) спектрометра с помощью производитель программного обеспечения.
    2. Запустите инструмент, повернув на охладитель воды, консоль и блок питания магнит. Подключите программное обеспечение к инструмент, поместите документ в гармонии и ждать по крайней мере 30 минут для инструмента для разминки.
    3. Загрузить 20 мкл пример из шага 5.5 в стекла 25 мкл капиллярной трубки с помощью капиллярность и уплотнение конец трубки с герметиком.
    4. Загрузить капиллярной трубки в полости микроволновой и критически пара резонатор, вручную или автоматически с помощью функции auto-tune программного обеспечения.
    5. Собирать первые производные спектры в условиях стандартного инструмента: 100 кГц микроволновой модуляции, 1.6 G магнитного поля модуляции и микроволновой мощностью 10 МВт.
    6. Для анализа и представления данных исправить спектров на фоне и нормализации их путем деления спектры, пик пик значение двойной интеграл.
    7. Определите спин лейбл мобильности путем измерения обратное значение ширины центральной линии первой производной спектров поглощения (ΔHo-1)36.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Функциональная характеристика минимальной хвоща менее построить TRPV1 (eTRPV1) и один цистеин мутантов

Первый шаг к спектроскопических исследований является инженер и характеризуют белка цистеина менее конструкции (рисунок 2A), которые являются функциональными и дают биохимические количества белков. eTRPV1 является функциональным, как определяется Ca2 + изображений и TEVC (

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Современные технологии для очистки млекопитающих мембранных белков и выражения сделали возможным получить достаточное количество белка для спектроскопических исследований14,,1516,42. Здесь мы адаптировали эти технологии, чтобы выразить, очистить, восстановить и спектроскопического анализа в TRPV1.

Среди важных шагов в протоколе ниже являются те, которые мы возникнове...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Мы очень благодарны д-р H. Mchaourab для предоставления доступа к НРА и оленей спектрометры и д-р T. Розенбаум для предоставления полнометражного плазмида TRPV1 хвоща менее.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
QuikChange Lightning Набор для сайт-направленного мутагенезаAgilent Technologies210519-5
2-пропанол (изопропанол)Fisher ScientificA416
Альбумин бычья сыворотка (БСА)GoldBio.comА-420-10
Амилозная смолаNEBE8021L
АпротининGoldBio.comA-655-25
Азолектин из соиSigma11145
Bac-to-Bac Система экспрессии бакуловирусаInvitrogen Life Technologies10359016
Биошарики SM-2 Адсорбенты Bio-Rad152-3920
Пипетки из боросиликатного стекла (3,5'') (инъекция ооцитов)Drummond Scientific3-000-203 G/X
Пипетки из боросиликатного стекла (запись ооцитов)Sutter InstrumentB150-110-10HP
CaCl2 2H2OFisher ScientificC79
Карбенициллин (Динатрий)GoldBio.comC-103-5
Реагент целлфектинInvitrogen Life Technologies10362-010
cellSensOlympus
ChloroformFisher ScientificC606SK
Коллагеназа типа 1Worthington-BiochemLS004196
CritisealVWR18000-299
D-(+)-глюкозаSigma G8270
D-(+)-мальтоза моногидрат FisherScientificBP684
DDM (n-доцецил-B-D-мальтопиранозид)AnatraceD310S
среда с высоким содержанием глюкозы (Dulbecco' s Модифицированный Eagle' SigmaD0572 
Одноразовые обессоливающие колонки PD-10GE Healthcare45-000-148
EGTAFisher ScientificO2783
Фетальная бычья сывороткаInvitrogen Life Technologies10082-147
Fluo-4 AMLife TechnologiesF-14201
GenCatch Plus Plasmid DNA Mini-Prep KitEpoch Life Science, Inc2160250
Набор для очистки GenCatch PCREpoch Life Science, Inc2360050
гентамицина сульфатаLonza17-518Z
Стеклянный капилляр (25 &; l)VWR53432-761
Стеклянная колба 2800 млPyrex США4423-2XL
ГлицеринFisher BioReagentsBP229
HEK293S GnTl-ATCCCRL-3022
HEPESSigma H4034
IPTG (изопропил-тио-B-галактозид)GoldBio.comI2481C25
сульфат канамицинаFisher ScientificBP906-5
KClFisher ChemicalP217
LB бульон,биореагенты Miller FisherBP1426
лейпептин гемисульфатGoldBio.comL-010-5
Липофектамин 2000Invitrogen Life Technologies11668-019
MgCl2 6H2OFisher ScientificBP214
MgSO4 7H2OFisher ScientificBP213
mMESSAGE mMACHINE T7 KitAmbionAM1344
MOPSFisher bioReagentsBP2936
MTSL (1-Oxyl-2,2,5,5-тетраметилпирролидин-3-ил) Methyl МетантиосульфонатToronto Research Chemicals, IncO873900
NaClFisher ChemicalS271
Opti-MEMLife Technologies31985-062
Пепстатин АGoldBio.comP-020-5
Плуроновая кислота F-127 (20%)PromoKine   CA707-59004
PMSFGoldBio.comP4170
Раствор поли-L-лизинаSigma-AldrichP4707
Rneasy Mini KitQiagen74104
Герметичный капиллярныйVitroComспециальный заказ
SF-900 II SFM (среда клеток насекомых)Gibco, Life Technologies10902-088
SF9 Клетки (адаптированные к SFM)Invitrogen Life Technologies11496-015
Экстракт полярных липидов соиAvanti Polar Lipids, Inc541602C
СахарозаFisher ScientificS25590
Superose 6 Increase 10/300 GLGE Healthcare29091596
TCEP HClGoldBio.comTCEP1
тетрациклина гидрохлоридFisher ScientificBP912-100
Tris BaseFisher BioReagentsBP152
TryptoneDifco0123-01
X-galGoldBio.comX4281C
Xenopus ооцитыNascoLM00935M
XL1 - Blue Competent CellsAgilent Technologies, Inc200249
дрожжи ЭкстрактDifco0127-01-7
Econo-Pack хроматографическая колонкаBio-Rad7321010
Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Precast-GelsBio-Rad17000436
pFastBac1 Экспрессиявектора Invitrogen Life Technologies10360-014
DH10Bac Компетентные клеткиInvitrogen Life Technologies10361-012
Critiseal герметик для капиллярных трубокLeica Microsystems02-676-20
ABI Model 3130XL Генетические анализаторыApplied Biosystems4359571
Transfer pipeteFishebrand13-711-9AM
Nanoject IIDrummond Scientific3-000-204

Ссылки

  1. Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy. Nature. 504, 107-112 (2013).
  2. Cao, E., Liao, M., Cheng, Y., Julius, D. TRPV1 structures in distinct conformations reveal activation mechanisms. Nature. 504, 113-118 (2013).
  3. Gao, Y., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. TRPV1 structures in nanodiscs reveal mechanisms of ligand and lipid action. Nature. , (2016).
  4. Yang, F., Xiao, X., Cheng, W., Yang, W., Yu, P., Song, Z., Yarov-Yarovoy, V., Zheng, J. Structural mechanism underlying capsaicin binding and activation of the TRPV1 ion channel. Nat Chem Biol. 11, 518-524 (2015).
  5. Bae, C., Anselmi, C., Kalia, J., Jara-Oseguera, A., Schwieters, C. D., Krepkiy, D., Won Lee, C., Kim, E. H., Kim, J. I., Faraldo-Gomez, J. D., Swartz, K. J. Structural insights into the mechanism of activation of the TRPV1 channel by a membrane-bound tarantula toxin. Elife. 5, (2016).
  6. Cuello, L. G., Cortes, D. M., Perozo, E. Molecular architecture of the KvAP voltage-dependent K+ channel in a lipid bilayer. Science. 306, 491-495 (2004).
  7. Cordero-Morales, J. F., Jogini, V., Lewis, A., Vasquez, V., Cortes, D. M., Roux, B., Perozo, E. Molecular driving forces determining potassium channel slow inactivation. Nat Struct Mol Biol. 14, 1062-1069 (2007).
  8. Cordero-Morales, J. F., Cuello, L. G., Zhao, Y., Jogini, V., Cortes, D. M., Roux, B., Perozo, E. Molecular determinants of gating at the potassium-channel selectivity filter. Nat Struct Mol Biol. 13, 311-318 (2006).
  9. Basak, S., Schmandt, N., Gicheru, Y., Chakrapani, S. Crystal structure and dynamics of a lipid-induced potential desensitized-state of a pentameric ligand-gated channel. Elife. 6, (2017).
  10. Vasquez, V., Sotomayor, M., Cordero-Morales, J., Schulten, K., Perozo, E. A structural mechanism for MscS gating in lipid bilayers. Science. 321, 1210-1214 (2008).
  11. Perozo, E., Kloda, A., Cortes, D. M., Martinac, B. Physical principles underlying the transduction of bilayer deformation forces during mechanosensitive channel gating. Nat Struct Biol. 9, 696-703 (2002).
  12. Perozo, E., Cortes, D. M., Sompornpisut, P., Kloda, A., Martinac, B. Open channel structure of MscL and the gating mechanism of mechanosensitive channels. Nature. 418, 942-948 (2002).
  13. Perozo, E., Cortes, D. M., Cuello, L. G. Structural rearrangements underlying K+-channel activation gating. Science. 285, 73-78 (1999).
  14. Goehring, A., Lee, C. H., Wang, K. H., Michel, J. C., Claxton, D. P., Baconguis, I., Althoff, T., Fischer, S., Garcia, K. C., Gouaux, E. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nat Protoc. 9, 2574-2585 (2014).
  15. Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening. Structure. 20, 1293-1299 (2012).
  16. Gonzales, E. B., Kawate, T., Gouaux, E. Pore architecture and ion sites in acid-sensing ion channels and P2X receptors. Nature. 460, 599-604 (2009).
  17. McHaourab, H. S., Lietzow, M. A., Hideg, K., Hubbell, W. L. Motion of spin-labeled side chains in T4 lysozyme. Correlation with protein structure and dynamics. Biochemistry. 35, 7692-7704 (1996).
  18. Columbus, L., Kalai, T., Jeko, J., Hideg, K., Hubbell, W. L. Molecular motion of spin labeled side chains in alpha-helices: analysis by variation of side chain structure. Biochemistry. 40, 3828-3846 (2001).
  19. Zou, P., McHaourab, H. S. Increased sensitivity and extended range of distance measurements in spin-labeled membrane proteins: Q-band double electron-electron resonance and nanoscale bilayers. Biophys J. 98, L18-L20 (2010).
  20. Vasquez, V., Sotomayor, M., Cortes, D. M., Roux, B., Schulten, K., Perozo, E. Three-dimensional architecture of membrane-embedded MscS in the closed conformation. J Mol Biol. 378, 55-70 (2008).
  21. Autzen, H. E., Myasnikov, A. G., Campbell, M. G., Asarnow, D., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the human TRPM4 ion channel in a lipid nanodisc. Science. 359, 228-232 (2018).
  22. Efremov, R. G., Gatsogiannis, C., Raunser, S. Lipid Nanodiscs as a Tool for High-Resolution Structure Determination of Membrane Proteins by Single-Particle Cryo-EM. Methods Enzymol. 594, 1-30 (2017).
  23. Guo, J., She, J., Zeng, W., Chen, Q., Bai, X. C., Jiang, Y. Structures of the calcium-activated, non-selective cation channel TRPM4. Nature. 552, 205-209 (2017).
  24. McGoldrick, L. L., Singh, A. K., Saotome, K., Yelshanskaya, M. V., Twomey, E. C., Grassucci, R. A., Sobolevsky, A. I. Opening of the human epithelial calcium channel TRPV6. Nature. 553, 233-237 (2018).
  25. Dang, S., Feng, S., Tien, J., Peters, C. J., Bulkley, D., Lolicato, M., Zhao, J., Zuberbuhler, K., Ye, W., Qi, L., Chen, T., Craik, C. S., Nung Jan, Y., Minor, D. L. Jr, Cheng, Y., Yeh Jan, L. Cryo-EM structures of the TMEM16A calcium-activated chloride channel. Nature. , (2017).
  26. Velisetty, P., Stein, R. A., Sierra-Valdez, F. J., Vasquez, V., Cordero-Morales, J. F. Expression and Purification of the Pain Receptor TRPV1 for Spectroscopic Analysis. Sci Rep. 7, 9861(2017).
  27. Salazar, H., Llorente, I., Jara-Oseguera, A., Garcia-Villegas, R., Munari, M., Gordon, S. E., Islas, L. D., Rosenbaum, T. A single N-terminal cysteine in TRPV1 determines activation by pungent compounds from onion and garlic. Nat Neurosci. 11, 255-261 (2008).
  28. Cao, E., Cordero-Morales, J. F., Liu, B., Qin, F., Julius, D. TRPV1 channels are intrinsically heat sensitive and negatively regulated by phosphoinositide lipids. Neuron. 77, 667-679 (2013).
  29. Braman, J., Papworth, C., Greener, A. Site-directed mutagenesis using double-stranded plasmid DNA templates. Methods Mol Biol. 57, 31-44 (1996).
  30. Gracheva, E. O., Cordero-Morales, J. F., Gonzalez-Carcacia, J. A., Ingolia, N. T., Manno, C., Aranguren, C. I., Weissman, J. S., Julius, D. Ganglion-specific splicing of TRPV1 underlies infrared sensation in vampire bats. Nature. 476, 88-91 (2011).
  31. Guan, B., Chen, X., Zhang, H. Two-electrode voltage clamp. Methods Mol Biol. 998, 79-89 (2013).
  32. Jarecki, B. W., Makino, S., Beebe, E. T., Fox, B. G., Chanda, B. Function of Shaker potassium channels produced by cell-free translation upon injection into Xenopus oocytes. Sci Rep. 3, 1040(2013).
  33. Jeschke, G., Polyhach, Y. Distance measurements on spin-labelled biomacromolecules by pulsed electron paramagnetic resonance. Phys Chem Chem Phys. 9, 1895-1910 (2007).
  34. Pannier, M., Veit, S., Godt, A., Jeschke, G., Spiess, H. W. Dead-time free measurement of dipole-dipole interactions between electron spins. J Magn Reson. 142, 331-340 (2000).
  35. Mishra, S., Verhalen, B., Stein, R. A., Wen, P. C., Tajkhorshid, E., McHaourab, H. S. Conformational dynamics of the nucleotide binding domains and the power stroke of a heterodimeric ABC transporter. Elife. 3, e02740(2014).
  36. Farahbakhsh, Z. T., Altenbach, C., Hubbell, W. L. Spin labeled cysteines as sensors for protein-lipid interaction and conformation in rhodopsin. Photochem Photobiol. 56, 1019-1033 (1992).
  37. Caterina, M. J., Schumacher, M. A., Tominaga, M., Rosen, T. A., Levine, J. D., Julius, D. The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway. Nature. 389, 816-824 (1997).
  38. McHaourab, H. S., Steed, P. R., Kazmier, K. Toward the fourth dimension of membrane protein structure: insight into dynamics from spin-labeling EPR spectroscopy. Structure. 19, 1549-1561 (2011).
  39. Jeschke, G. DEER distance measurements on proteins. Annu Rev Phys Chem. 63, 419-446 (2012).
  40. Jeschke, G. Distance measurements in the nanometer range by pulse EPR. Chemphyschem. 3, 927-932 (2002).
  41. Chiang, Y. W., Borbat, P. P., Freed, J. H. The determination of pair distance distributions by pulsed ESR using Tikhonov regularization. J Magn Reson. 172, 279-295 (2005).
  42. He, Y., Wang, K., Yan, N. The recombinant expression systems for structure determination of eukaryotic membrane proteins. Protein Cell. 5, 658-672 (2014).
  43. Ghimire, H., McCarrick, R. M., Budil, D. E., Lorigan, G. A. Significantly improved sensitivity of Q-band PELDOR/DEER experiments relative to X-band is observed in measuring the intercoil distance of a leucine zipper motif peptide (GCN4-LZ). Biochemistry. 48, 5782-5784 (2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Очистка TRPV1электронный парамагнитный резонансдвухэлектронный электронный резонанссольюбилизация детергентомреконституция белковсайт-направленный мутагенезэкспрессия с помощью бакуловирусаэксклюзионная хроматографияформирование протеолипосом
Очистка и восстановление TRPV1 для спектроскопического анализа
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.