Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Жесткость измерения мягкого силикона субстратов для Mechanobiology исследований с использованием Widefield флуоресцентным микроскопом

6.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/57797

⸱

3 июля 2018 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Mechanical & Aerospace Engineering, Old Dominion University, 2Department of Biological Sciences, Old Dominion University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Субстратов с жесткостью в диапазоне килопаскаль полезны для изучения реакции клеток физиологически соответствующей жесткости микро среды. Используя просто widefield флуоресцентным микроскопом, Юнга мягкие силиконовые гели могут быть определены с помощью отступов с подходящей сфере.

Аннотация

Мягких тканей в организме человека, как правило, имеют жесткость в диапазоне килопаскаль (kPa). Соответственно силикона и гидрогелевые гибких подложках было доказано быть полезным субстратов для культивирования клеток в физической микроокружения, который частично имитирует условия в естественных условиях . Здесь мы представляем простой протокол для характеризующие модули Юнга изотропной линейной эластичной субстратов, обычно используется для mechanobiology исследования. Протокол состоит из подготовки субстрата мягкого силикона на Петри блюдо или жесткой силиконовые, покрытие верхней поверхности субстрата силикона с бусами Флюоресцентная, с помощью миллиметровой шкалы сферы для отступа верхней поверхности (по тяжести), визуализации люминесцентные Бусы на поверхности с отступом силикона с помощью микроскопа флуоресценции и анализ результирующего изображения для вычисления Юнга силиконовые подложки. Муфта верхней поверхности субстрата с белков внеклеточного матрикса модулей (кроме флуоресцентный бусины) позволяет силиконовые подложки легко использоваться для ячейки покрытия и последующие исследования, с помощью экспериментов микроскопии силы тяги. Использование жесткой силикона, вместо Петри блюдо, как основа мягкого силикона, позволяет использовать mechanobiology исследований с участием внешних стрейч. Конкретные преимуществом этого протокола является widefield флуоресцентным микроскопом, которая обычно доступна во многих лабораториях, основного оборудования, необходимого для выполнения этой процедуры. Мы демонстрируем это протокол путем измерения Юнга мягкого силикона субстратов различных упругих модулей.

Введение

Клетки в мягких тканях находятся в микро среды, чьи жесткость находится в килопаскаль диапазона1, в отличие от культуры ткани блюда которого жесткость несколько порядков выше. Первые эксперименты с клетки на внеклеточная матрица белка покрытием мягкие субстраты показал, что жесткость субстрат влияет как клетки двигаться дальше, а также придерживаться внеклеточного матрикса под2,3. В самом деле субстрат жесткость принципиально влияет на функции клеток4 в аналогии с широко распространенной биохимических сигналы. Полиакриламидных гелей (покрытые белков внеклеточного матрикса) (вода проникая) гидрогели, широко использовались как клетки культуры субстратов для mechanobiology исследований5. Полидиметилсилоксан (PDMS), наиболее распространенных силиконовые (полисилоксан), широко используется как жесткая силикона с мегапаскаль диапазона жесткости для изготовления микрон шкала6. Совсем недавно, мягкого силикона, который субстратов с жесткостью в диапазоне более физиологически соответствующих килопаскаль были заняты в качестве подложки культуры клеток для mechanobiology исследования,78.

Некоторые методы были использованы для измерения жесткости гибких подложках, включая атомно-силовой микроскопии, макроскопической деформации всей образцов на растяжение, реологии и отступы с помощью сферы и сферически наконечником microindentors9 . Хотя каждая техника имеет свои преимущества и недостатки, отступы со сферой является особенно простой, но довольно точный метод, который требует только доступ к widefield флуоресцентным микроскопом. Отступы с металлический шар был использован для измерения жесткости гидрогели в предыдущие работы3,9,10. Ранние работы, которая продемонстрировала важность субстрат жесткость клеточного движения использовали этот метод для определения гидрогеля субстрата жесткость3. Совсем недавно конфокальная микроскопия используется также для элегантной характеристика10.

Здесь, мы представляем пошаговые протокол для подготовки субстрата мягкого силикона, муфты флуоресцентные бусины (и белков внеклеточного матрикса, таких как коллаген я) только к верхней поверхности, воображения отступов сферы и верхней поверхности с использованием фазы и флуоресценции изображений, соответственно и, наконец, анализ изображений для вычисления Юнга силиконовые подложки. Мягкие силиконовые подложки, подготовленных таким образом легко может использоваться для тяговой силы микроскопии экспериментов. Использование жесткой силиконовые (вместо чашку Петри) как база для мягкого силикона также позволяет mechanobiology исследования с использованием внешних стрейч. Где это уместно, также указаны практические соображения, необходимые для предотвращения возможных осложнений.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Изготовление мягкого силикона субстрата

  1. Весят, 1,75 г компонента A и 1,75 г компонента B (: b = 1:1) из мягкого силикона эластомер комплекта с помощью (полистирол) весом поддонов.
  2. Добавьте компонент A B компонент в лотке весом и смешивать их вместе в течение 5 мин, используя соответствующие Аппликатор ручки.
  3. Добавьте выше смеси до 35 мм Петри. Разрешить смесь равномерно распределены по Петри за пару минут.
    Примечание: Выбор Петри блюдо диаметр и количество мягкого силикона определит толщина мягкого силикона. Здесь толщина будет около 3,5 мм; Подробнее о выборе толщина эластомера в разделе обсуждения .
  4. Место Петри с силиконовые смеси, с крышкой, в вакуумной камере за 15 минут, чтобы удалить все пузырьки воздуха. В это время подогрева горячей плите до 70 ° C.
  5. Как только поджарки достигает 70 ° C, место на стеклянное скольжение на него и затем поместите Петри с силиконовые смеси на стеклянное скольжение. Пусть силиконовые лечения при 70 ° C за 30 мин. Не размещайте полистирола блюдо непосредственно на горячей плите, как Петри может расплавить.

2. муфта флуоресцентные микрошарики для мягкого силикона

  1. Мягкая силиконовая (в открытые Петри) место в подземной камеры УФ (корпус с глубокой УФ-лампы света длиной волны 185 и 254 Нм). Мягкие силиконовые образца (~ 5-10 см от УФ-лампа) подвергайте глубокого Ультрафиолета на 5 мин.
    1. В то время как силикон подвергается глубокого ультрафиолета, приступайте шаги 2.2-2.6 ниже. После глубокого ультрафиолета Дега подземной камеры УФ для по крайней мере 5 минут до получения образца.
  2. В то же время весят из 19 мг Карбодиимиды (EDC) 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) в пробки microcentrifuge 1,5 мл и добавьте 500 мкл воды деонизированной воды (DI). Растворите EDC, осторожно встряхивая трубки.
  3. В отдельном 1,5 мл microcentrifuge трубку весят из 11 мг N- hydroxysulfosuccinimide (сульфогруппу NHS), добавить 500 мкл воды ди к нему и распустить сульфогруппу NHS, осторожно встряхивая трубки. Затем объединить EDC и сульфогруппу NHS решения в одном microcentrifuge трубку.
  4. В этот раствор EDC/сульфогруппу NHS добавьте 30 мкл 0,44 красный Диаметр мкм (или любой другой цвет флуоресценции, основанный на фильтр Кубы, доступные в флуоресцентным микроскопом) карбоксилат изменение флуоресцентные микрошарики (с фондовых концентрации 1% w/v).
  5. EDC/сульфогруппу стоматология/шарик смесь, добавить 0,02 мг коллагена I (от крыс хвост, запасов концентрации 4 мг/мл в уксусной кислоты 0,02 М) для получения концентрации около 0,02 мг/мл.
  6. Вихревой EDC/стоматология/шарик/коллагена я смесь кратко обеспечить, что бисер равномерно рассеяны по всему, до сцепления.
  7. Пипетка 1 мл EDC/стоматология/шарик/коллагена я смесь на кусок парафина, укладывают поверх другой мелкой, плоская крышка (меньшего диаметра). Инвертируйте Петри с мягкого силикона на этой смеси, так что поверхности мягкие силиконовые контакты смесь, но непосредственно не прикасаться к поверхности меньше Петри крышку ниже. Чтобы поднять Перевернутый Петри, используйте один или два стеклянных скольжениях под обе стороны Перевернутый Петри распорки.
    Примечание: Обратитесь к рис. 1 , чтобы увидеть, как выполняется шаг 2.7.
  8. Обложка образца с алюминиевой фольгой и проинкубируйте его при комнатной температуре за 30 мин.
  9. Удаление Петри с мягкого силикона и установить вертикально (силикон стороной вверх).
  10. Мыть поверхности мягкого силикона с фосфат амортизированное saline (PBS), добавив 2 мл PBS (рН 7,4) на блюдо. Пусть это сидеть в течение нескольких минут. Аспирационная от PBS и мыть силикона снова с 2 мл ФСБ. Пусть силиконовые лечения далее примерно в день. По этой причине Поместите образец мягкого силикона в PBS при 37 ° C на ночь.

3. Измерение жесткость силикона с сфере отступа с помощью микроскопа флуоресценции Widefield

  1. Получить чашку Петри с мягкого силикона и убедитесь, что он содержит по крайней мере 1 мл PBS иметь силиконовая поверхность несколько мм ниже уровня жидкости.
  2. Используя острые щипчики, падение пять 1 мм циркония сфере наконечники на мягкого силикона. Погрузите сферы в жидкой среде и поместите их, от края слой силикона и по крайней мере 5 indentor диаметров от местоположения других наконечники.
    Примечание: Когда сбросили над поверхностью жидкости, сферах может не вступить в жидкой среде (дробное) из-за жидкой среде поверхностного натяжения.
  3. Поместите Петри с мягкого силикона на микроскопа, так что это возможно к изображению через Петри базы.
  4. Использование изображений фазы с 10 X цели (например сухой 10 X цель NA 0,30), найти и принести indentor сфере в фокус.
  5. Возьмите фазы изображение части или весь indentor и сохранить этот образ. Используйте проверку плитки, если таковые имеются. Если indentor имеет каких-либо видимых дефектов, отменить и заменить его на другой indentor.
  6. Под живой этап визуализации, Пан слева от края indentor так, что левого края фрейма по крайней мере на расстоянии ~1.5 R от центра indentor. Убедитесь, что центр indentor остается видимым на правой стороне, недалеко от правого края кадра. Фаза образ и сохранить его.
  7. Переключатель Микроскоп источник света для освещения для красных флуоресцентных канала. С x- и y-координаты без изменений ( x-y позицию центра indentor внутри, но у правого края фрейма), фокус вниз (уменьшение Z) до красной флуоресцентной микрошарики под сферу indentor центр как раз пойдите вне фокуса.
  8. Возьмите z стек с изображения для каждого z приращения 0,5 мкм до микрошарики в верхний слой силикона далеко от indentor (вблизи левого края изображения кадра) пойти вне фокуса.
  9. Повторите шаги 3.4-3.8 с другими наконечники на образце.

4. Расчет жесткости силиконовые (модуль Юнга)

  1. Откроем изображение фазы indentor, используя ImageJ, нажмите на инструмент «Линия» и измерить диаметр indentor в пикселях. Нажмите и удерживайте на точку на краю indentor, переместите курсор к диаметрально противоположной точке на краю и отмечаем длины в пикселях, отображается в строке состояния главного окна ImageJ перед выпуском курсор.
    1. Убедитесь, что единица длины в пиксели, нажав анализ | Задать масштаб и проверка единица длины.
    2. Преобразовать мкм indentor радиус в пикселах, принимая во внимание объективные увеличение и размер пикселя камеры CCD (R в мкм = R в точках x размер пикселей ПЗС камеры в мкм / цель увеличения).
  2. Откройте красного канала z стек microbead изображений (если микрошарики красная лампа дневного света) в ImageJ, нажав на файл | Импорт | Изображение последовательности и выберите любое изображение в стеке и нажмите кнопку ОК , чтобы открыть в стек.
    Примечание: F1-номер кадра в котором микрошарики под центр indentor находятся в лучших возможных фокус и F2 номер кадра, на котором микрошарики (в регионе ~1.5 R от центра шарик) вблизи левого края фрейма находятся в лучших возможных фокус. Z-разница между двумя кадрами является глубина δ отступа.
    1. Используя инструмент «линия» в ImageJ, нарисуйте линию через четко microbead в изображении. Нажмите кнопку на анализ | Участок профиля и нажмите на кнопку Live , чтобы получить обновленный линии сканирования интенсивности через шарик при выборе различных кадров. Кадр, который дает наибольшее значение максимальной интенсивности может быть выбран как кадр в фокусе.
    2. Так как z приращение между кадрами в стеке z 0,5 мкм, рассчитать глубину отступ в мкм как δ = (F2-F1) x 0.5.
  3. Вычислить силу оказываемого на гель, indentor из-за ее веса (минус сопротивляясь сила), то есть, отступы силы F, как объем indentor x (плотность indentor - плотность жидкой среды) x ускорение свободного падения. Использовать уравнения F = (4/3) x 3.142 x (R3) x (ρindentor - ρсреднего) x g , где R — радиус indentor,indentor ρ — плотность indentor, ρсреднего -плотность жидкой среды и g — ускорение свободного падения (9,812). Экспресс всех величин на правой стороне в единицах Си для получения F (в N).
  4. Вычислите Юнга (E) из силикона, с использованием модифицированных11 Герц модель12 уравнение:
    figure-protocol-1
    Где:
    c = поправочный коэффициент, который изменяет выражение модели Герц, следующим за ним;
    v = коэффициент Пуассона силиконового геля (берется как 0,5 а несжимаемой материалы7);
    F = усилие отступ;
    R = радиус indentor; и
    Δ = глубина отступа.
    Экспресс всех величин на правой стороне в единицах Си для получения E в ПА.
    1. Вычислите коэффициент коррекции c следующим3:
      figure-protocol-2
      Где:
      figure-protocol-3
      figure-protocol-4; и
      figure-protocol-5.
      Следует отметить, что данный поправочный коэффициент специально должно использоваться только тогда, когда мягкие силиконовые придерживается хорошо Петри (или жесткой силиконовые) под ним, (который в данном случае).
    2. Рассчитайте высоту h слоя мягкого силикона, основанный на количестве силиконовые добавил и Петри диаметром. Кроме того, получить h непосредственно путем определения z координата верхней и нижней поверхностей слой силикона на этап визуализации (незначительные примеси вступают в фокус на любой поверхности). Обратите внимание, что для большой h (h2 > Rδ), коэффициент коррекции c близка к 1.
  5. Повторите шаги 4.1-4.4 для каждого indentor. Средняя Юнга, полученные от каждого indentor чтобы получить среднее Юнга для образца силикона.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Используя протокол, подробно говорилось выше, мы подготовили мягкого силикона в 35 мм Петри, вылечить при 70 ° C за 30 мин и сочетании флуоресцентные микрошарики (и коллаген я) к верхней поверхности как схематично изображены на рисунке 1. Глубокая УФ ранее использовались для возможного белка, муфты для субстратов13. Обратите внимание, что (I) лечения условия, используемые здесь являются специфическими для этого мягкого силикона и ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В то время как сфера отступ метод прост в реализации, особое внимание должно уделяться выбор indentor и толщина мягкого силикона образца. Уравнение используется для вычисления Юнга действует под набор условий11и обычно они удовлетворены когда толщина образца силикона-> 10% от радиуса indentor и < ~ 13 x indentor радиус. Мы обнаружили, что силиконовые толщиной 5-10 x indentor радиус был хороший выбор, где толщина образца не слишком высока (т.е., объективные рабочее расстояние не стать огра...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Мы благодарим Гардель Маргарет за щедро позволяет использовать Реометр. Мы признаем поддержку от НИЗ (1R15GM116082), что позволило этой работы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
CY 52-276 Комплект силиконовых эластомеров A/B Dow CorningCY 52-276Хранить при комнатной температуре
Thermo Scientific Pierce EDCFisher ScientificPI22980Хранить при -20°С; C
Thermo Scientific  Сшивающий агент Pierce Sulfo-NHSFisher ScientificPI-24510Магазин по адресу 4° C
Карбоксиловые флуоресцентные розовые частицы, 0,4-0,6 &; м, 2 млСферотек, Инк.CFP-0558-2Склад при 4° C, не замораживать
1,0 мм Промытые кислотой циркониевые шарикиOPS Diagnostics LLCBAWZ 1000-250-33
Глубокая УФ-камера с озоновым эвакуаторомNovascan Technologies, Inc.PSD-UV4, OES-1000D
Широкопольный флуоресцентный микроскопLeica MicrosystemsDMi8
Collagen I, из крысиного хвостаCorning354236Стоковая концентрация = 4 мг/мл; хранить при 4°С; C
ImageJ-NIHN/AПрограммноеобеспечение, находящееся в общественном достоянии

Ссылки

  1. Handorf, A. M., Zhou, Y., Halanski, M. A., Li, W. J. Tissue stiffness dictates development, homeostasis, and disease progression. Organogenesis. 11 (1), 1-15 (2015).
  2. Pelham, R. J., Wang, Y. -L. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (25), 13661-13665 (1997).
  3. Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophysical Journal. 79, 144-152 (2000).
  4. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their Substrate. Science. 310, 1139-1143 (2005).
  5. Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses. Methods in Cell Biology. 83, 29-46 (2007).
  6. Johnston, I. D., McCluskey, D. K., Tan, C. K. L., Tracey, M. C. Mechanical characterization of bulk Sylgard 184 for microfluidics and microengineering. Journal of Micromechanics and Microengineering. 24 (3), 035017(2014).
  7. Style, R. W., et al. Traction force microscopy in physics and biology. Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).
  8. Lee, E., et al. Deletion of the cytoplasmic domain of N-cadherin reduces, but does not eliminate, traction force-transmission. Biochemical and Biophysical Research Communications. 478 (4), 1640-1646 (2016).
  9. Frey, M. T., Engler, A., Discher, D. E., Lee, J., Wang, Y. L. Microscopic methods for measuring the elasticity of gel substrates for cell culture: microspheres, microindenters, and atomic force microscopy. Methods Cell Biol. 83, 47-65 (2007).
  10. Lee, D., Rahman, M. M., Zhou, Y., Ryu, S. Three-dimensional confocal microscopy indentation method for hydrogel elasticity measurement. Langmuir. 31 (35), 9684-9693 (2015).
  11. Dimitriadis, E. K., Horkay, F., Maresca, J., Kachar, B., Chadwick, R. S. Determination of elastic moduli of thin layers of soft material using the atomic force microscope. Biophysical Journal. 82 (5), 2798-2810 (2002).
  12. Hertz, H. Über die Berührung fester elastischer Körper. Journal für die reine und angewandte Mathematik. 92, 156-171 (1882).
  13. Azioune, A., Carpi, N., Tseng, Q., Théry, M., Piel, M. Protein micropatterns: a direct printing protocol using deep UVs. Microtubules: In Vivo. Cassimeris, L., Tran, P. , Academic Press. Burlington, San Diego. 133-146 (2010).
  14. Bashirzadeh, Y., Qian, S., Maruthamuthu, V. Non-intrusive measurement of wall shear stress in flow channels. Sensors and Actuators A: Physical. 271, 118-123 (2018).
  15. Muhamed, I., Chowdhury, F., Maruthamuthu, V. Biophysical tools to study cellular mechanotransduction. Bioengineering (Basel). 4 (1), 12(2017).
  16. Dumbali, S. P., Mei, L., Qian, S., Maruthamuthu, V. Endogenous sheet-averaged tension within a large epithelial cell colony. Journal of Biomechanical Engineering. 139 (10), 101008(2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

ImageJ
Жесткость измерения мягкого силикона субстратов для Mechanobiology исследований с использованием Widefield флуоресцентным микроскопом
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.