Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Экран 2-гибрид дрожжи в пакете для сравнения взаимодействий протеина

13.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/57801

⸱

6 июня 2018 г.

 ,  , 
1Molecular Physiology and Biophysics, University of Iowa

В этой статье

Краткое содержание

Пакетная обработка экранов 2-гибрида дрождей позволяет для прямого сравнения профилей взаимодействия нескольких приманки белков с весьма сложным набором добычу синтеза белков. Здесь мы описываем, изысканные методы, новые реагенты и как осуществлять их использования для таких экранов.

Аннотация

Скрининг для взаимодействий протеин протеина используя пробирного 2-гибрида дрождей уже давно эффективным средством, но его использование во многом был ограниченным к открытию высокоспецифичные посредники, которые сильно обогащенный в библиотеке взаимодействующих кандидатов. В традиционном формате пробирного 2-гибрида дрождей может принести слишком много колоний для анализа при проведении в низкой жесткости где низкого сродства посредники могут быть найдены. Кроме того без всеобъемлющей и полной допроса той же библиотеки против различных приманки плазмид, сравнительный анализ невозможно. Хотя некоторые из этих проблем могут быть решены с использованием библиотек выстроились добычу, стоимость и инфраструктуры, необходимых для работы таких экранов может быть непомерно высока. В качестве альтернативы, мы адаптировали дрожжи 2-гибрид assay одновременно раскрыть десятки переходных и статические белковых взаимодействий в одном экране, используя стратегию называют DEEPN (динамический обогащения для оценки белка сетей), который включает в себя высокопроизводительного секвенирования ДНК и вычисление проследить эволюцию популяции плазмиды, которые кодируют взаимодействия партнеров. Здесь мы описываем заказной реагентов и протоколы, которые позволяют DEEPN экрана, чтобы быть выполнен легко и экономически эффективно.

Введение

Полное понимание биологических процессов клетки основывается на поиске сетей взаимодействия белков, которые лежат в основе их молекулярные механизмы. Один из подходов к идентификации взаимодействий протеина является дрожжи assay (Y2H) 2-гибрид, который работает путем сборки функционирования химерных транскрипционный фактор, после двух доменов протеина интереса связывать друг с другом1. Типичный Y2H экран осуществляется путем создания население дрожжей, что дома обе библиотеки плазмид кодирования взаимодействуя белками, сливается с transcriptional активатор (например., «добычу» синтез белка) и плазмида данного «приманки» состоит из белка из интереса сливается с ДНК связывающий домен (например, Gal4 ДНК-связывающих домен, который связывает вверх по течению Gal4 активируя последовательности). Одним из главных преимуществ Y2H подход является, что это сравнительно легко и недорого провести в типичной лаборатории оснащены для рутинной молекулярных биологических работы2. Однако когда традиционно выполняется, пользователь образцы отдельных колоний, которые возникают при выборе для позитивного взаимодействия Y2H. Это серьезно ограничивает количество библиотека «добычу» клоны, которые могут быть обследованы. Эта проблема усугубляется, когда обилие конкретных взаимодействующих добычу очень высока по сравнению с другими, уменьшая вероятность обнаружения взаимодействия с низкой численности хищных плазмид.

Одним из решений для использования Y2H принципа всеобъемлющего охвата протеома является использование матрицы формате подхода, которой массив плазмид известных индивидуальных добычу могут допрашиваться цифровой. Однако такой подход требует инфраструктуры, которая не является легко доступной или экономически отдельных следователей, которые заинтересованы в определении interactome небольшое количество белков или домены3. Кроме того очень сложные добычу библиотек, которые могут кодировать несколько фрагментов взаимодействующих белков будет расширять размер такой матрицы массивов непрактичным размеров. Альтернативой является для выполнения анализов с комплекс библиотек в пакетах и оценить наличие взаимодействующих клонов, используя массивной параллельной последовательности высок объём4. Это может быть применено к assay присутствие плазмид добычу, которые возникают в несколько колоний, с использованием типичного Y2H формате подход, в котором дрожжи клетки жилья взаимодействующие синтеза белков могут расти на пластине5,6. Эта общая идея может акцентировал увеличить запрос оба несколько приманки и добычей компонентов на же время7,8.

Тем не менее многие расследования требуют что проще еще более целенаправленный характер усилий на нескольких белка «приманки» и может принести пользу более запросом исчерпывающим и полуколичественных единый комплекс добычу библиотеки. Мы разработали и проверены подход для выполнения белка широкомасштабного взаимодействия исследования с использованием Y2H принцип в пакетный формат4. Скорость расширения конкретной жертвой плазмида использует в качестве прокси для относительной силы взаимодействия Y2H9. Глубокие секвенирования всех плазмид в рамках населения подвергается нормальному росту или селективный рост условий производит полную карту клонов, которые дают сильные и слабые Y2H взаимодействий. Репертуар посредники могут получить и непосредственно сравнивать по несколько плазмидов приманки. Полученный рабочий процесс, называется DEEPN (динамический обогащения для оценки белка сетей) таким образом может использоваться для определения дифференциального interactomes же добычей библиотек для идентификации белков, позволяя сравнение одного белка против другой.

Здесь, мы демонстрируем DEEPN и внесения улучшений в лабораторных методов, которые облегчают его использования, которые приводятся на рисунке 1. Значительные усовершенствования включают в себя:

Поколение популяций хищных дрожжи. Одним из ключевых требований DEEPN порождает населения дрожжей с различные приманки плазмиды, которые имеют такое же распределение библиотек добычу плазмиды. Эквивалентные базовых популяций хищных плазмида библиотеки необходимы для точных сопоставлений между interactomes разных приманки. Это лучше всего достигается, когда библиотека плазмида уже расположен в haploid дрожжей населения и перемещение заданного приманки плазмида в населения достигается путем спаривания производить диплоидные. Здесь мы предоставляем четкое руководство в том, как сделать такое население, с использованием коммерческих библиотек, размещенный в haploid дрожжей. Хотя мы нашли методы, которые генерируют большое количество diploids, общей спаривания эффективности эти коммерческие библиотеки, содержащей штаммов дрожжей был низким. Таким образом мы построили новый штамм, который может дом добычу библиотек, что дает гораздо больше diploids за спаривания реакции.

Новый набор приманки плазмид. Многие текущие плазмиды, которые выражают протеины сплавливания «приманки» входят протеина интереса и ДНК связывающих домена на основе 2μ, позволяя им для того усилить их копии номер. Этот номер копии могут быть вполне переменной в населенности и привести к изменчивости в ответ transcriptional Y2H. Это в свою очередь может исказить возможность оценить силу взаимодействия данного белка, основываясь на ответе роста клеток под выбор. Это может быть частично адрес с помощью низкой копировать плазмиду, некоторые из которых ранее были описаны как коммерчески доступных pDEST3210. Мы построили новые приманки плазмида (pTEF ГПБ), которая производит Gal4-ДНК связывающих белков фьюжн домена внутри центромер низкая копирования плазмида TRP1 , перевозящих ген сопротивления Kanr, также позволяет клонирования приманки фрагментов оба вверх по течению и вниз по течению от Gal4 ДНК-связывающих домена.

Библиотека фрагмент новой высокоплотного Y2H. Мы построен новый плазмида дом Y2H добычу библиотек и использовал его для построения сложных Y2H библиотеки из случайно стриженый фрагментов геномной ДНК из Saccharomyces cerevisiae. Анализ последовательности показали, что эта библиотека более 1 миллиона различных элементов, гораздо более сложным, чем ранее описанные дрожжи геномной Y2H плазмиды библиотек11. С этой новой библиотеки мы смогли показать, что процесс DEEPN достаточно прочным для того, чтобы вместить комплекс библиотек с много различных плазмид в манере, которая является надежным и воспроизводимость.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. подготовка средств массовой информации и плиты

Примечание: Все пластины должны быть сделаны как минимум 2 дня перед началом протокол. Средства массовой информации могут быть сделаны в любой точке. Однако буферизации дрожжевой экстракт Пептон Декстроза аденин (bYPDA) необходимо предусмотреть в день, из которых он будет использоваться. Некоторые средства массовой информации производится с использованием дополнения смеси, содержащей уровень аденин, что больше, чем обычно используется. Большинство дополнений минимальные средства массовой информации укажите аденин 10 мг/Л. Добавки с надписью «+ 40Ade» укажите в общей сложности 40 мг/Л аденин.

  1. Подготовка раствора глюкозы (50% w/v). Для 1 Л, растворить в 500 g D-(+)-глюкозы в 800 мл дистиллированной воды в стакан 1000 мл. Отрегулируйте громкость до 1000 мл с помощью мерного цилиндра и фильтр через 0,2 мкм стерильным фильтром в бутылку хранения СМИ стерильные 1000 мл.
  2. Подготовьте дрожжевой экстракт Пептон Декстроза (YPD) пластины. Для 1 Л, растворяют 20 g Пептон и 10 г дрожжей экстракт в 800 мл дистиллированной воды в стакан 1000 мл. Налейте в мерный цилиндр, заполнить до 960 мл дистиллированной водой. Налить в 2000 мл колбу Эрленмейера и добавить 15 г агара. Автоклавы и прохладный 37 ° C водяной бане до тех пор, пока температура ванны вода остынет до приблизительно 42-50 ° C. Использование пипетки для добавления 40 мл 50% глюкозы. Смешайте хорошо крутятся.
    1. Залейте серии 100 мм пластин с 20 мл СМИ с пипеткой.
  3. Подготовить полный синтетических минимальный СМИ (CSM)-Trp пластины. Для 1 Л, растворяются 6,7 г дрожжей азота базы без аминокислот в 800 мл дистиллированной воды в стакан 1000 мл. Налейте в мерный цилиндр, заполнить до 960 мл дистиллированной водой. Налейте в 2000 мл колбу Эрленмейера и добавьте 0,7 г - Trp-встретился отсева микс, 20 мг метионин и 15 г агара. Автоклавы и прохладный 37 ° C водяной бане до тех пор, пока температура ванны вода остынет до приблизительно 42-50 ° C. Использование пипетки для добавления 40 мл 50% глюкозы. Смешайте хорошо крутятся.
    1. Залейте серии 100 мм пластин с 20 мл СМИ с пипеткой.
  4. Подготовьте CSM-леи-Met пластины. Для 1 Л, растворяются 10.05 г дрожжей азота базы без аминокислот в 800 мл дистиллированной воды в стакан 1000 мл. Налить в мензурку и заполнить до 940 мл дистиллированной водой. Налейте в 2000 мл колбу Эрленмейера и добавить 1,005 г - леи-встретил отсева смеси и 15 г агара. Автоклавы и прохладный 37 ° C водяной бане до тех пор, пока температура ванны вода остынет до приблизительно 42-50 ° C. Использование пипетки для добавления 60 мл 50% глюкозы. Смешайте хорошо крутятся.
    1. Залейте серии 100 мм пластин с 20 мл СМИ с пипеткой.
  5. Подготовьте CSM-леи-Trp пластины. Для 1 Л, растворяются 10.05 г дрожжей азота базы без аминокислот в 800 мл дистиллированной воды в стакан 1000 мл. Налейте в мерный цилиндр, заполнить до 940 мл дистиллированной водой. Налейте в 2000 мл колбу Эрленмейера и добавить 1,005 г - Trp-лей + 40Ade отсева микс, 240 мг аденин и 15 г агара. Автоклавы и прохладный 37 ° C водяной бане до тех пор, пока температура ванны вода остынет до приблизительно 42-50 ° C. Использование пипетки для добавления 60 мл 50% глюкозы. Смешайте хорошо крутятся.
    1. Залейте серии 100 мм пластин с 20 мл СМИ с пипеткой.
  6. Подготовьте CSM-леи-Trp-его тарелки. Для 1 Л, растворяются 10.05 г дрожжей азота базы без аминокислот в 800 мл дистиллированной воды в стакан 1000 мл. Налейте в мерный цилиндр, заполнить до 940 мл дистиллированной водой. Налейте в 2000 мл колбу Эрленмейера и добавьте 0.975 g - Trp-леи-его + 40Ade смесь отсева, 240 мг аденин и 15 г агара. Автоклавы и прохладный 37 ° C водяной бане до тех пор, пока температура ванны вода остынет до приблизительно 42-50 ° C. Использование пипетки для добавления 60 мл 50% глюкозы. Смешайте хорошо крутятся.
    1. Залейте серии 100 мм пластин с 20 мл СМИ с пипеткой.
  7. Подготовьте CSM-леи-Trp-его 3AT пластины. Для 1 Л, растворяются 10.05 г дрожжей азота базы без аминокислот в 800 мл дистиллированной воды в стакан 1000 мл. Налейте в мерный цилиндр, заполнить до 940 мл дистиллированной водой. Налейте в 2000 мл колбу Эрленмейера и добавьте 0.975 g - Trp-леи-его + 40Ade смесь отсева, 240 мг аденин и 15 г агара. Автоклавы и прохладный 37 ° C водяной бане до тех пор, пока температура ванны вода остынет до приблизительно 42-50 ° C. Использование пипетки для добавления 60 мл 50% глюкозы. Смешайте в 100 мкл стерильные запас 1 M 3-амино-1,2,4 триазола (3AT), закрученной.
    1. Залейте серии 100 мм пластин с 20 мл СМИ с пипеткой.
  8. Подготовьте LB-Kanr пластины. Для 1 Л, Растворите 10 g Триптон, 5 г дрожжей экстракт и 10 г NaCl в 800 мл дистиллированной воды в стакан 1000 мл. Налейте в мерный цилиндр, заполнить до 1000 мл дистиллированной водой. Налить в 2000 мл колбу Эрленмейера и добавить 15 г агара. Автоклавы и прохладный 37 ° C водяной бане до тех пор, пока температура ванны вода остынет до приблизительно 42-50 ° C. Добавьте 50 мг канамицин и смешать с закрученной.
    1. Залейте серии 100 мм пластин с 20 мл СМИ с пипеткой.
  9. Подготовьте YPD, CSM-леи-Met, CSM-ГТО, CSM-леи-ГТО и CSM-леи-Trp-его средств массовой информации. Описанные выше для пластин за исключением вместо вливаются в колбу Эрленмейера, налить в бутылку для хранения средств массовой информации и опустить агар.
  10. Подготовка bYPDA (буферизованное YPDA). Возьмите стерильные YPD СМИ и добавить 200 мг/Л аденин в стерильной дистиллированной воде. Скорректировать рН 3,7 с HCl. фильтра через 0,2 мкм стерильным фильтром в стерильных бутылку.
  11. Подготовить преобразования буфера: 2 M сорбитол, дигидрат ацетат лития 1 М, 10 мм трис рН 7,6, 0.5 мм ЭДТА, кальция хлорид 0,2 мм в дистиллированной воде. Фильтрация через фильтр 0.2 мкм стерильным в стерильных бутылку.
  12. Подготовить PEG решение: 70% w/v полиэтиленгликоля 3350 в дистиллированной воде. Стерилизуйте в автоклаве.
  13. Подготовить вертеть: 8 M мочевины, SDS 4% w/v, 50 мм трис рН 6,8, 10% v/v глицерина, 0,02% w/v бромфеноловый синий в стерильной дистиллированной воды.
  14. Подготовить sTE (сильный TE): 50 мм трис, 20 ЭДТА, рН 8,0 в дистиллированной воде. Фильтрация через фильтр 0.2 мкм стерильным в стерильных бутылку.
  15. Подготовить раствор Zymolase: 10 мг/мл Zymolase 100т в 50 мм калия фосфат двухосновной pH 7.5, 50% v/v глицерин буфер в стерильной дистиллированной воды (хранятся при температуре-20 ° C).

2. клонирование и проверка приманки плазмиды

Примечание: Строительство Gal4-ДНК связывающих домена плазмид. В настоящее время существует целый ряд коммерчески доступных и академически доступны Y2H систем. DEEPN может вместить многие из них, условии, что приманка плазмида выражения протеина интереса, сливается в ДНК связывающих домен находится в TRP1-содержащих плазмиды. Другие требования, ниже по течению, что последовательность сразу вверх по течению добычу библиотеки известен вставки и позитивного взаимодействия Y2H может быть забит с производством His3 позволяет для выбора в средствах массовой информации не хватает гистидина. Здесь мы будем описывать использование новой плазмида Y2H приманку (pTEF ГПБ, рис. 2), однако, могут также использоваться другие приманки плазмид Y2H, включая pGBKT7. Для строительства и оценки приманки плазмид мы будем описывать использование pTEF ГПБ. Общее замечание мы рекомендуем гена синтеза производить открытое чтение кадр, который придерживается предвзятости кодон дрожжей чтобы обеспечить хорошее выражение и легкость с клонирования. Убедитесь, что клонирования схема позволяет приманку, чтобы быть в рамка с Gal4 ДНК-связывающий домен и что при клонировании в 3' сайт, стоп-кодон следующим регионе приманки кодирования.

  1. Подготовьте вектор плазмиды. Плазмида pTEF ГПБ позволяет для клонирования шифруя протеин интереса либо 5' и 3' региона кодирования Gal4 ДНК-связывающий домен, с помощью метода быстрой сборки. Для вставки на 5' сайте, дайджест 3 мкг pTEF ГПБ Нари и EcoRI или для вставки на сайт 3', дайджест с BamHI и XhoI для 2-4 ч. Electrophorese образца ДНК агарозы 1% гель содержащие 0,2 - 0,5 мкг/мл ethidium бромид (бромистый этидий) на 100 г. акцизный вырезать 5,630 bp КТЭ-ГПБ и очистить с помощью комплекта извлечения геля ДНК в соответствии с инструкциями производителя и количественного определения ДНК путем поглощения на 260 Нм на спектрофотометре12.
    Примечание: Поколение приманки кодирования вставок. Фрагменты ДНК кодирования белков или фрагменты белка интерес может быть изготовлен с использованием гена синтеза и доступны как uncloned фрагменты. Рекомендуется, что кодоны оптимизированы для выражения в Saccharomyces cerevisiae и онлайн инструменты для оптимизации кодон, включены в список материалов.
  2. Для 5' вставки, обрамляют фрагмента ДНК кодирования кодон начала ГПТ, 5'-TTAAGAAAAACAAACTGTAACGAATTC-3 'и 5'-GCGCCTATGTGTGAACAAAAGCTTATT-3, соответственно. 3' вставки в рамке с связывающий домен Gal4 ДНК, обрамляют фрагмента кодирования, 5'-ctgcatatggccatggaggccgaa-3 "и 5'-tagtaactagcataaccccttggggcc-3».
  3. Для строительства плазмида используйте метод быстрой сборки согласно инструкциям производителя для клонирования фрагментов в резки pTEF ГПБ.
    1. Плита все превращается E. coli на LB-Kanr пластины и проинкубируйте 16-20 ч при 37 ° C. Колонии жилья pTEF ГПБ с требуемой вставки могут быть идентифицированы по амплификации PCR используя олигонуклеотиды: 5'-CGGTCTTCAATTTCTCAAGTTTCAG-3 ' и 5'-GAGTAACGACATTCCCAGTTGTTC-3' 5' Вставка и 5'-CACCGTATTTCTGCCACCTCTTCC-3' и 5'-GCAACCGCACTATTTGGAGCGCTG-3' по 3' вставить. Эти олигонуклеотиды может также служить грунты для секвенирования insert.
    2. План по подготовке > 10 мкг каждого pTEF ГПБ производной и pTEF ГПБ самостоятельно предоставлять материалы для преобразования последовательности и дрожжи.
    3. Используйте следующие условия PCR: 3 мин при 98 ° C, а затем 25 циклов 30 s на 98 ° C, 30 s при 55 ° C и 2 мин при 72 ° C, а затем 5 мин при 72 ° C, используя буфер, содержащий 2,5 мм2 MgCl , 0.5 U/100 мкл ДНК-полимеразы и проприетарные буфера.

3. выражение домена Gal4-ДНК связывающих белков Fusion

  1. Сделайте компетентным дрожжей.
    1. Полоса из PJ69-4A дрожжей на YPD пластину, принимая стерильные деревянные аппликатор, соскоб 1 мм3 -80 ° c замороженных фондовых и растирая его мягко через пластину YPD. Переместите деревянным аппликатором вниз пластину, так что каждый проход идет через нетронутые частью поверхности СМИ. Инкубируйте YPD пластины при 30 ° C в течение 2 дней или до тех пор, пока один колоний видны. Сделать замороженные запасы PJ69-4A дрожжей, приостановив дрожжи в воде или роста СМИ, дополняющего с ДМСО до 7% и хранения при температуре-80 ° C.
    2. Прививок одной колонии в 5 мл культуры YPD в трубу культуры 20 мм x 150 мм, с помощью стерильных аппликатор деревянные и расти на ночь при 30 ° C в тряску инкубатор на 200 об/мин.
    3. Прививать 50 мл YPD в 250 мл стерильную колбу Эрленмейера с 4 мл ночь культуры PJ69-4A штамм дрожжей. Растут в пожимая инкубатора при 30 ° C, 200 rpm оптической плотности (600OD) приблизительно 1.2, как определено методом спектрофотометрии с пути света стандартного 1 см. Рост обычно занимает 5-7 ч.
    4. Изолируйте дрожжей, седиментации в 50 мл конические пробки на 4,696 g x 5 мин при комнатной температуре в центрифуге benchtop. Выбросите супернатант сбросами в жидких отходов. С помощью пипетки, Ресуспензируйте гранулы в 5 мл буфера для преобразования и передачи 15 мл Конические трубки. Resediment чтобы отменить супернатанта и Ресуспензируйте дрожжи в 1 мл окончательный объем преобразования буфера с 1000 мкл пипетки.
    5. Инкубировать дрожжевых клеток для 60 мин при 30 ° C при встряхивании в 200 об/мин, а затем поместить на льду за 30-90 мин.
  2. Дрожжи плазмида преобразование.
    1. 1,5 мл стерильного microcentrifuge трубки добавьте 1 мкг на основе pTEF ГПБ плазмиды и 5 мкл 10 мг/мл спермы лосося перевозчика ДНК решения. Также включать трубка, содержащая только лосося спермы перевозчик ДНК как элемент негативные трансформации. Добавьте 100 мкл суспензии клеток ледяной дрожжей в каждую пробирку, пипетки. 100 мкл 70% PEG решение с 1000 мкл пипетки и смешайте нежно, стряхивая трубки 5 - 10 раз (делать не вихрь).
    2. Инкубируйте на 30 ° C, в дрожь инкубатор на 200 об/мин за 45 мин.
    3. Теплового шока при 42 ° C 15 мин.
    4. Осадков в microcentrifuge в 845 g x 3 мин при комнатной температуре, Пипетка с удалить супернатант, Ресуспензируйте Пелле в 150 мкл стерильной воды, закупорить вверх и вниз и распределяют по поверхности плиты CSM-ГТО.
    5. Разместите таблички справа вверх в инкубаторе 30 ° C и проинкубируйте 2-3 дня до тех пор, пока колоний видны. Плиты могут быть перевернуто во избежание образования конденсата на поверхности пластины после инкубации при 30 ° C для 6-12 ч.
    6. Взять 2-3 колоний за преобразования и полоска как патч на CSM-Trp пластину с помощью стерильных зубочисткой. Позволяют расти в течение 24 ч при температуре 30 ° C.
  3. Сделайте лизатов для выражения протеина.
    1. Прививок 3 мл жидких сред CSM-ГТО с размером матч руководитель дрожжей из патча и расти на ночь при 30 ° C в трубке культура 20 мм x 150 мм, при встряхивании в 200 об/мин. Сделайте два ночи культур на приманку и пустой pTEF ГПБ вектора.
    2. Добавьте 1 mL YPD для каждого 3 мл CSM-Trp ночь культуры. Расти в течение 1 ч при 30 ° C, при встряхивании в 200 об/мин. Проверьте на од клеток, спектрофотометр.
    3. Отложения эквивалентное количество клеток, нормализующее согласно ОД. Используйте стерильные 1,5 мл microcentrifuge трубок с 5 мин спина на 2348 x g при комнатной температуре в microcentrifuge. Использование пипетки отказаться супернатант. Окончательный акций соответствует как минимум 2.1 ОД.
      Примечание: При расчете эквивалентное количество клеток, это может произойти, что разные тома может потребоваться от каждой ночи культуры для достижения минимальной 2.1 ОД.
    4. Ресуспензируйте гранулы в 450 мкл 0,2 М NaOH, закупорить вверх и вниз. Инкубируйте 5 мин при комнатной температуре. Recentrifuge клетки на 2 мин на 2348 x g при комнатной температуре и отбросить супернатант в пипетку.
    5. Ресуспензируйте лепешка с 50 мкл буфера ВЕРТЕТЬ, закупорить вверх и вниз тщательно, чтобы не сделать пузыри. Пример тепла для 5 мин при 70 ° C.
  4. Проверка выражения протеина SDS-PAGE.
    1. Использование градиента гель 4-20%, обеспечить широкий спектр молекулярным весом могут быть решены. Эквивалент нагрузки (же OD) образцов в SDS-PAGE гель и не забудьте включить по крайней мере один образец, содержащий в неизмененном pTEF ГПБ вектор13,14,15.
    2. После электрофоретического разделения передачи гель нитроцеллюлозы и immunoblot с помощью моноклональных и поликлональных антител анти myc и ECL обнаружения раствора (рис. 3).

4. самостоятельной активации теста

  1. Полоса из дрожжей MATalpha от соответствующего жилья добычу библиотека интерес на пластину YPD, принимая стерильных аппликатор деревянные, соскоб небольшое количество дрожжей из флакона и мелирование через пластину YPD штамм акций-80 ° C. Инкубируйте YPD пластины при 30 ° C в течение 2 дней или до тех пор, пока один колоний видны. Патч пару один колоний на YPD пластину и Инкубируйте на ночь на 30 ° C.
    Примечание: Новый штамм, разработанных здесь дом добычу библиотеки является PLY5725, тогда как некоторые совместимый коммерчески доступных библиотек Y2H размещены в Y187.
  2. Выполните процедуры, описанные в 3.3.1 - 3.3.4 для преобразования PLY5725 с LEU2-на основе плазмид, используются для размещения библиотеки желаемого добычу. Для библиотек, разработанных здесь, соответствующий плазмида является pGal4AD (pPL6343). Чтобы восстановить трансформантов дрожжи, пластину на CSM-леи-Met пластины. После колонии возникают, полоска как патчи на CSM-леи-Met пластину и инкубировать в течение 24 ч при температуре 30 ° C.
  3. Следуйте протокола в 3.4 для подтверждения выражение pPL6343 пустой вектор с использованием анти-Ха моноклональных и поликлональных антител и решения обнаружения ECL.
  4. Streak которую каждый преобразованный PJ69-4A дрожжей в крест узор с PLY5725 строит на YPD пластина, которая была подтверждена выразить белка в протоколе раздел 3.4 и 4.3 и Инкубируйте на 30 ° C на ночь. Возьмите 1 мм3 клеток, где два штаммов выросли вместе и патч на отдельные CSM-леи-Met, CSM-ТРП и CSM-Trp-леи пластин и расти 24 h.
    Примечание: Желаемый diploids будет расти на тарелках CSM-Trp-лей. Рост на CSM-леи-мет и CSM-Trp плиты служат положительный контроль для роста дрожжей.
  5. Расти diploids в 1 мл CSM-Trp-леи СМИ на ночь на 30 ° C. Осадков 500 мкл клетки в 1,5 мл microcentrifuge трубки на 2348 x g, 3 мин при комнатной температуре в microcentrifuge. Отказаться от супернатанта, пипетки. Ресуспензируйте клеток в 1 мл стерильной воды и повторите седиментации и ресуспендирования. Проверка ОД600 клеток.
  6. Сделать серию 1:10 серийных разведений каждого суспензии клеток, используя стерильную воду с начиная с наиболее концентрированный раствор каждого в ОД 0.5. SPOT 5 мкл каждого разведения на тарелку CSM-леи-ГТО, CSM-леи-Trp-его тарелку и CSM-леи-Trp-его + 3AT пластины. Инкубируйте на 30 ° C и проверить для роста ежедневно в течение 3 дней (рис. 4).
    Примечание: для 1:10 серийный разрежения, Пипетка 10 мкл трубка, содержащая ОД 0,5 в 90 мкл воды и перемешать, закупорить вверх и вниз. Продолжать делать 1:10 серийных разведений, пока есть в общей сложности шесть различных концентраций в месте.

5. Создайте дрожжей населения с приманкой и добычей Библиотека

Примечание: Y187 штамм, который дома коммерческой добычи библиотека плазмиды также не мат. Таким образом следующие оптимизированные условия требуются для поддержания сложности библиотеки. PLY5725 штамм содержащие Y2H добычу библиотек товарищей лучше и же спаривания процедура может использоваться с этот штамм (рис. 5).

  1. Прививать 3 мл культур каждого из трансформантов PJ69-4A, перевозящих различные TRP1-содержащих pTEF ГПБ приманки плазмида в CSM-ГТО СМИ в трубке культуры. Включает два отдельных культур, содержащих pTEF ГПБ вектор плазмиды самостоятельно выступать в качестве процедурного контроля. Инкубировать культур при 30 ° C, 200 rpm для 6 h и затем разбавляют в 25 мл в стерильную колбу Эрленмейера ночь роста культуры.
  2. Разморозить замороженные (-80 ° C) флакон MATalpha клетки, содержащие LEU2-проведение «добычей» библиотека при комнатной температуре. Прививать 125 мл CSM-леи-Met СМИ в стерильную колбу Эрленмейера с целом талой флакона. Растут всех культур на ночь на 30 ° C с встряхивания на 200 об/мин.
    Примечание: OD600 ночи культур необходимо диапазоне от 1,0 до 1,5 перед переходом к следующим шагам.
  3. Центрифуга 21 ОД эквиваленты каждого из культур transformant PJ69-4A с 5 мин спина на 4,696 x g при комнатной температуре. За каждые 10 спаривания реакции желаемого, Пелле 39600 эквиваленты ОД MATalpha штамма, перевозящих библиотека плазмид в отдельных 50 мл конические трубы.
    1. Ресуспензируйте клетки в 10 мл стерильной воды и повторно Пелле в новой 50 мл Конические трубки 4,696 x г 5 мин при комнатной температуре в центрифуге benchtop. С помощью пипетки, аккуратно удалите супернатант без нарушения гранулированных клетки.
    2. Ресуспензируйте гранулы PLY5725 клеток в 10 мл bYPDA (рН 3,7) и PJ69-4A клеток в 4 мл.
  4. Для настройки спаривания реакций, добавить 1 мл PJ69-4A преобразовали клетки, 1 мл MATalpha библиотека содержащих клеток и 1 мл bYPDA рН 3,7 до новой 50 мл Конические трубки. Инкубируйте на 30 ° C с нежным орбитальных агитации (100-130/мин) 90 мин.
    1. Центрифуга клетки для 5 мин при 4,696 x g, при комнатной температуре в центрифуге benchtop. Удалить супернатант пипетки и Ресуспензируйте гранулы в 2 мл bYPDA:YPD 1:1. Пластина все 2 мл на 100 мм YPD пластину на пипетку и Инкубируйте на 30 ° C около 20 мин.
  5. Урожай клетки от YPD плит с помощью скребка ячейки выбить клетки в 2-3 мл CSM-леи-ГТО СМИ. Пипетка выбили клетки в 50 мл Конические трубки. Промойте пластины 4 - 5 раз с 2-3 мл CSM-леи-ГТО СМИ, закупорить вверх, что средства массовой информации, используя 1000 мкл Пипетка и осторожно извлечь средства массовой информации по всей поверхности пластины YPD.
    1. Центрифуга клетки для 5 мин при 4,696 x g при комнатной температуре в центрифуге benchtop. Отказаться от супернатанта, дозаторов и Ресуспензируйте клетки в 40 мл CSM-леи-ГТО СМИ, закупорить вверх и вниз (ДУ не вихрь).
  6. Чтобы оценить количество формируется диплоидный клеток, разбавляют 4 мкл диплоидных смеси в 200 мкл и 2000 мкл CSM-Trp-леи СМИ. Плита 200 мкл каждого разведения на тарелку CSM-леи-ГТО.
    Примечание: Две пластины представляют мэм и картирование раз разведение акций diploids собирают и приносит ожидаемый ~ 9000-27000 колоний на пластину разрежения мэм после инкубации при 30 ° C для 36-40 ч. Проверка пластин после шага 5.7. Минимальное количество 200 колоний на пластину разрежения мэм необходим для перехода к шагу 5.8
  7. Немедленно занять оставшуюся часть каждого 40 мл клеток ресуспендирования и прививать 1000 мл колбу Эрленмейера, содержащий 500 мл CSM-леи-ГТО СМИ. Возьмите первоначальный ОД600. Инкубируйте эти фляги при 30 ° C с встряхивания на 180 об/мин, до тех пор, пока они достигают насыщения (~2.0 ОД/мл). Это обычно занимает около 36-40 ч. рост монитор на 24 ч потом снова на 36 h ОД600.
  8. С помощью пипетки, удалите 20 мл аликвоты каждого из насыщенных 500 мл культур и innoculate 2000 мл Эрленмейер колбы, один содержащие 750 мл CSM-леи-ГТО СМИ и второй содержащие 750 мл CSM-леи-Trp-его с низким уровнем 3AT, устраняет фон (ранее определяется в разделе 4.5). Mix новых культур (770 мл) хорошо крутятся и принять первоначальный ОД600.
  9. Инкубируйте культур при 30 ° C во время тряски на 180 об/мин до достижения насыщения, который обычно происходит в течение 24 ч для невыбранных CSM-леи-Trp культуры и может занять более 70 h для культур под выбор для Y2H взаимодействия.
  10. После культуры достигли насыщения (ОД ~ 2.0), удалить 11 мл с пипеткой, отложений клетки с 5 мин спина на 4,696 x g при комнатной температуре, отказаться от супернатанта, пипетки и заморозить при температуре-20 ° C или продолжить на экстракции ДНК. Образцы выбранных и невыбранных будет использоваться для глубокого последовательности.

6. Пробоподготовка для секвенирования глубоко DEEPN

  1. Экстракции ДНК.
    1. Используйте пипетку для Ресуспензируйте клеток окатышей из протокола раздел 5.7 в 500 мкл буфера sTE и передачи для 1.5 мл пробки microcentrifuge. Добавьте 3 мкл betamercaptoethanol и 10 мкл Zymolase запасов. Хорошо перемешайте и инкубировать в инкубаторе 37 ° C для 24-36 ч.
    2. Извлечь образец два раза с 500 мкл фенол/хлороформ/изоамилового спирта при использовании вытяжки дыма16.
    3. Добавление 7 мкл 4 М NaCl, 900 мкл ледяной 100% этанола (ETOH), микс от инверсии и либо замораживания-20 ° C или продолжать отложений ДНК, спиннинг на 21,130 x g 10 мин при комнатной температуре в microcentrifuge.
    4. Отказаться от супернатанта, пипетки. Помыть лепешка трижды с 900 мкл 70% ETOH.
    5. Отложениях Пелле 21,130 g x 2 мин и удалить остаточные ETOH мыть с пипеткой. Сухие гранулы для 7 мин при 42 ° C.
    6. Ресуспензируйте Пелле в 120 мкл 0.1 x sTE в ванну воды 37 ° C, 90 мин, Флик трубы смешивать каждые 30 мин.
    7. Пипетка 60 мкл ДНК в стерильных 1,5 мл пробки microcentrifuge. 120 мкл sTE, 3.5 мкл РНКазы A акций, Флик смешивать и инкубировать при 37 ° C в течение 1 ч.
    8. Преципитат этанола, как ранее сделали в раздел 6.1.3 - 6.1.5, но использовать 7 мкл ацетата аммония 5 М вместо 4 М NaCl.
    9. Ресуспензируйте РНКазы A-обработал дна в 55 мкл 0.1 x sTE в ванну воды 37 ° C, 90 мин, Флик трубы смешивать каждые 30 мин Quantify ДНК путем поглощения на 260 Нм на спектрофотометре.
  2. ПЦР cDNA вставляет.
    1. Выполняют два, 50 мкл ПЦР-реакции на образец ДНК. Каждый реакции содержит 25 пмоль каждого прямого и обратного грунтовки, соответствия плазмида добычу библиотеки (см. материалы). Реакции также содержат 25 мкл высококачественный 2 x PCR Мастер микс, 5 мкг ДНК образца и воды до 50 мкл. Amplify реакций для 25 циклов с расширение раз 3 мин при 72 ° C, обжигают Температура 55 ° c за 30 сек и денатурировать на 98 ° C для 10 s. предшествует Велоспорт по 30 s денатурации 98 ° C и следовать с 5 минут инкубации при 72 ° C.
    2. Анализ 4 мкл каждого реакции PCR, электрофорез геля агарозы 1% ДНК с дна агарозы гель содержащие 0,2 - 0,5 мкг/мл бромистый этидий17. Визуализации образца ДНК путем просвечивания УФ. Образцы покажет что мазок ДНК около 1-3 КБ, где диапазонов шаблон может быть найдена для образцов, где взаимодействие Y2H был выбран (рис. 6).
    3. Объединить повторяющиеся образцы ПЦР и очистить, используя комплект для очистки ПЦР в соответствии с инструкциями производителя и количественного определения ДНК путем поглощения на 260 Нм на спектрофотометре.

7. глубокая последовательности

Примечание: Пробоподготовка и последовательности на платформе глубокий последовательности обычно доступен в коммерческих и академических учреждениях ядро секвенирования ДНК.

  1. Сдвига 600 нг ПЦР продукта с помощью высокопроизводительных ультра sonicator дать фрагменты средней длиной ~ 300 bp.
  2. Создания индексированных последовательности библиотек с помощью подготовки комплекта для глубоких последовательности, которая добавляет линкеры кодирования штрих-кодов, грунтовка сайтов, и захват последовательности несимметрично на концах фрагментов ДНК.
  3. Выполните подготовку библиотека согласно инструкциям производителя. Бассейн индексируются библиотек и последовательности, как долго в паре конец читает на платформе глубокую последовательности (например, 2 x 150 bp PE прочтений). Нужное количество операций чтения для каждого образца находится между 10 и 40 миллионов, с более читает, требуемой для невыбранных групп населения, которые являются более сложными, как правило. Мы рекомендуем по крайней мере 20 миллионов или более читает для невыбранных групп населения.

8. Bioinformatic обработка и проверка

  1. Процесс ДНК последовательности данных в виде fastq с набором автономные программного обеспечения, программы построены для (1) карта последовательности чтения файлов в формате универсального Сэм (2) количественно гена обогащения между наборами данных (3) выполнять статистический анализ данных в Чтобы ранжировать какой кандидат гены являются позитивными для взаимодействия Y2H () 4) предоставлять информацию о том, что регион(ы) и какие поступательные кадр каждый cDNA добычу за гена фрагменты, дают позитивные Y2H взаимодействия состоят, и (5) инструменты для восстановления не только 5' но и 3' концу взаимодействующих фрагментов, позволяя их реконструкции и проверки в традиционном формате Y2H. Работы этих программ подробно в исследовании, сопровождающих.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Y2H assay широко используется для поиска: протеин взаимодействия и несколько систем и адаптации были разработаны. По большей части те же соображения, которые помогут обеспечить успех этих предыдущих подходов имеют важное значение для DEEPN. Некоторые из важных контрольных показателей включают: обеспечение выражение ДНК связывающих домена синтез белков, обеспечивая низкий фоне ложных его + рост в diploids, содержащие приманки интерес с пустым добычу плазмида, высокой спаривания эффективнос...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Здесь мы предоставляем руководство по как для выполнения анализов Y2H в пакете с помощью оптимизированные методы. Есть несколько критических шаги процедуры, чтобы помочь обеспечить население дрожжей, который будет находиться в разделе выбор представителя начала библиотеки и что достаточно начиная дрожжей населения используется для прохождения отбора для ограничения изменчивость . Важно отметить, что эти критерии являются относительно легко достичь вместе с адаптации методов и материалов для традиционных Y2H assay, таким ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать

Благодарности

Мы благодарим сотрудников в рамках Института генетики человека для подготовки NGS библиотеки и последовательности. Мы благодарим Эйнат Снир за ее опыт в подготовке геномная библиотека фрагментов для библиотеки плазмида Y2H здесь. Эта работа была поддержана национальными институтами здравоохранения: низ R21 EB021870-01A1 и NSF исследовательский проект Грант: 1517110.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Illumina HiSeq 4000Платформаглубокого секвенирования
Моноклональные антитела против HABiolegend901514Первичное антитело для обнаружения экспрессии HA в pGal4AD конструирует
поликлональные анти-myc антителаQED Biosciences Inc18826Первичное антитело для обнаружения экспрессии MYC в pTEF-GBD конструирует
NarINew England BioLabsR0191S
EcoRI-HFNew England BioLabsR3101S
BamHI-HFNew England BioLabsR3236S
XhoINew England BioLabsR0146S
Полиэтиленгликоль 3350, порошокJ.T. BakerU2211-08
Сперма лососяDNA Trevigen, Inc продается Fisher Scientific50-948-286ДНК-носитель для трансформации дрожжей раздел 3.2.1.
Канамицин моносульфатProducts InternationalK22000
LE AgaroseGeneMateE-3120-500используется для изготовления ДНК агарозных гелей
Sodium Chloride ResearchProducts InternationalS23025
TryptoneResearch Products InternationalT60060
D-сорбитResearch Products InternationalS23080
Дигидрат ацетата литияMP Биомедицинские 155256
хлорид кальцияThermoFisherC79
EDTA Sodium SaltProducts InternationalE57020
Порошок экстракта дрожжейResearch Products InternationalY20020
Дрожжевое азотное основание (сульфат аммония) без аминокислотИсследовательская продукция InternationalY20040
CSM-Trp-Leu+40ADEFormediumDCS0789
CSM-Trp-Leu-His+40ADEFormediumDCS1169
CSM-Leu-MetFormediumDCS0549
CSM-Trp-MetBio 101, Inc4520-922
L-метионинFormediumDOC0168
AdenineResearch Products InternationalA11500
D-(+)-GlucoseResearch Products InternationalG32045
Bacto AgarBD214010используется для изготовления медиапластин в разделе 1
PeptoneResearch Products InternationalP20240
3-амино-1,2,4 ТриазолSigmaA8056
2- Меркаптоэханол (BME)Sigma-AldrichM6250
Zymolyase 100TUSBiologicalZ1004
Диосновной фосфат калияSigmaP8281
Фенол:Хлороформ:IAAAmbionAM9732
Ацетат аммонияSigma-Aldrich238074
этанолDecon Laboratories, INC2716
РНКаза АThermoFisherEN0531
UreaResearch Products InternationalU20200
SDSResearch Products InternationalL22010
глицеринSigma AldrichG5516
Tris-HClGibco15506-017
бромофенол синийAmresco449
Набор для клонирования Gibson Assembly NewEngland BiolabsE5510SМетод быстрой сборки для клонирования плазмид в разделе 2
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master MixNew England BiolabsM0541SИспользуется для амплификации продуктов для сборки Gibson в разделе 2.3, а также для подготовки образцов для глубокого секвенирования DEEPN в разделе 6.2.1
Бромид этидияAmresco0492-5G
Набор для очистки ПЦР QIAquickQiagen28104Используется для очистки продуктов ПЦР в разделе 6.2.3
Набор для экстракции геля Qiaquick DNA Gel Extraction KitQiagen28704Используется для очистки переваренного pTEF-GBD в разделе 2.1
KAPA Hyper Prep набордля подготовки KAPA BiosystemsKK8500Набор для подготовки к глубокому секвенированию
Оптимизация кодоновhttp://www.jcat.de
Оптимизация кодоновhttps://www.idtdna.com/CodonOpt
gBlocksIntegrated DNA TechnologiesФрагменты ДНК, используемые для клонирования в разделе 2.2
СтрокиThermofisherФрагменты ДНК, используемые для клонирования в разделе 2.2
Мини-набор для подготовки плазмиды ДНКGenCatch EPOCH Life SciencesИспользуется для подготовки большого количества ДНК в разделе 2.3
Covaris E220Высокопроизводительный ультразвуковой аппаратCovaris
олигонуцелотид 5'- CGGTCTT
CAATTTCTCAAGTTTCAG -3'		Integrated DNA Technologies или Thermofisherдля ПЦР-амплификации и секвенирования 5' вставки pTEF-GBD при конструировании плазмид
олигонуцелотида 5'-GAGTAACG
ACATTCCCAGTTGTTC-3'		Integrated DNA Technologies или Thermofisherдля ПЦР-амплификации и секвенирования 5' вставки pTEF-GBD при конструировании плазмид
олигонуцелотида 5'-CACCGTAT
TTCTGCCACCTCTTCC-3'		Integrated DNA Technologies или Thermofisherиспользуется для ПЦР-амплификации и секвенирования 3' вставки pTEF-GBD при конструировании плазмид
олигонуцелотида 5'-GCAACCGC
ACTATTTGGAGCGCTG-3'		Integrated DNA Technologies или Thermofisherдля ПЦР-амплификации и секвенирования 3'-вставки pTEF-GBD при конструировании плазмидного
олигонуклеотида 5'-GTTCCGATG
CCTCTGCGAGTG-3'		Integrated DNA Technologies или Thermofisher5' Pimer, используемый для инсертной амплификации
олигонуцелотида pGAL4AD 5'-GCACATGCT
AGCGTCAAATACC-3'		Integrated DNA Technologies или Thermofisher3' Pimer, используемый для интрижной амплификации
олигонуцелотида pGAL4AD 5'-ACCCAAGCA
GTGGTATCAACG-3'		Integrated DNA Technologies или Thermofisher5' Pimer используется для инсертной амплификации
олигонуцелотида pGADT7 5'- TATTTAGA
AGTGTCAACAACGTA -3'		Integrated DNA Technologies или Thermofisher3' Pimer, используемый для инсертной амплификации
штамма дрожжей pGADT7 PJ69-4A MatAhttp://depts.washington.edu/yeastrc/ James P, Halladay J, Craig EA: Genomic Libraries и штамма-хозяина, разработанного для высокоэффективной двухгибридной селекции в дрожжах. ГЕНЕТИКА 1996 144:1425-1436MATA leu2-3,112 ura3-52 trp1-901 his3-200 gal4D, gal80D, GAL-ADE2 lys2::GAL1-HIS3 met2::GAL7
pTEF-GBDDr. Robert Piper LabGal4-DNA связывающая экспрессия доймаина плазмида
pGal4AD (pPL6343)Д-р Роберт Пайпер LabGal4-активация домена экспрессии плазмида
100 мм чашки ПетриKord-Vallmark продано VWR2900
Колба Эрленмейера PYREX 125 млFisher ScientificS63270
250 мл PYREX Колба ЭрленмейераFisher ScientificS63271
1 000 мл PYREX Колба ЭрленмейераFisher ScientificS63274
2 000 мл PYREX Колба ЭрленмейераFisher ScientificS63275
20 X 150 мм Одноразовая пробирка для культивированияThermofisher14-961-33
пипеткаDrummond4-000-100
5 мл серологическая пипеткаDenvilleP7127
10 мл серологическая пипеткаDenvilleP7128
25 мл серологическая пипеткаDenvilleP7129
1 000 мл PYREX Griffin BeakerFisher Scientific02-540P
1 000 мл PYREX Reuasable Media Storage BottleFisher Scientific06-414-1D
1,000 мл градуированный цилиндрFisher Scientific08-572-6G
SpectraMax 190Молекулярные устройствадля измерения оптической плотности клеток
NanoDrop 2000Thermo ScientificND-2000Спектрофотометр для количественного определения количества ДНК
Electronic UV трансиллюминаторUltra LumMEB 20используется для визуализации ДНК в агарозном геле бромида этидия
P1000 Gilson PIPETMANFisher ScientificF123602G
P200 Gilson PIPETMANFisher ScientificF123601G
P20 Gilson PIPETMANFisher ScientificF123600G
P10 Gilson PIPETMANFisher ScientificF144802G
1250 & микро; L Наконечники для пипеток с низким удержаниемGeneMateP-1236-1250
200 & микро; Наконечники для пипеток LLow RetentionVWR10017-044
10 &; L XL Наконечники для пипеток с низким удержаниемVWR10017-042
50 мл Коническая трубкаVWR490001-627
Коническая трубка 15 млVWR490001-621
скребок для клетокDenville ScientificTC9310
1,5 мл Микроцентрифужные пробиркиСША Scientific1615-5500
HClFluka Analytical318949-1L
NaOHJ.T. Baker5674-02
Деревянные аппликаторыSolon Care55900
Eppendorf микроцентрифуга 5424Fisher Scientific05-400-005микроцентрифуга
Sorvall ST16RThermo Fisher Scientific75004381настольная центрифуга
Amersham ECL Rabbit IgG, HRP-связанная целая Ab (от осла)GE ЗдравоохранениеNA934-1MLВторичное антитело
Amersham ECL Mouse IgG, HRP-связанный целый Ab (от овцы)GE HealthcareNA931-1MLВторичное антитело
SuperSignal West Pico Хемилюминесцентный субстратThermo Fisher Scientific34080ECL обнаружение раствор
для обнаружения Isotemp ИнкубаторThermo Fisher Scientific
Mutitron 2INFORS HTВстряхивающий инкубатор
Isotemp с цифровым управлением Модель 205водяная баняFisher Библиотека
кДНК мыши Y2H в Y187 (ткань кастрюли)Clontech630482коммерчески доступная библиотека кДНК
Y2H библиотека кДНК мыши в Y187 (мозг мыши)Clontech630488коммерчески доступная библиотека кДНК
pGADT7 AD VectorClontech630442коммерчески доступный AD Vector, содержащий множество библиотек кДНК
pGBKT7 DNA-BD VectorClontech630443коммерчески доступный DNA-BD Vector
Biolase DNA PolymeraseBiolineBIO-21042DNA полимераза, используемая для раздела 2.4
GeneMate GCL-60 Thermal CyclerBioExpressP-6050-60PCR машина
TempAssure 0,5 мл ПЦР пробиркиСША Сайентифик1405-8100
Research Research в секции 7 Научная мыши

Ссылки

  1. Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).
  2. Bruckner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology. International Journal of Molecular Sciences. 10 (6), 2763-2788 (2009).
  3. Vidal, M., Fields, S. The yeast two-hybrid assay: still finding connections after 25 years. Nature Methods. 11 (12), 1203-1206 (2014).
  4. Pashkova, N., et al. DEEPN as an Approach for Batch Processing of Yeast 2-Hybrid Interactions. Cell Reports. 17 (1), 303-315 (2016).
  5. Rajagopala, S. V. Mapping the Protein-Protein Interactome Networks Using Yeast Two-Hybrid Screens. Advances in Experimental Medicine and Biology. 883, 187-214 (2015).
  6. Weimann, M., et al. A Y2H-seq approach defines the human protein methyltransferase interactome. Nature Methods. 10 (4), 339-342 (2013).
  7. Yachie, N., et al. Pooled-matrix protein interaction screens using Barcode Fusion Genetics. Molecular Systems Biology. 12 (4), 863(2016).
  8. Trigg, S. A., et al. CrY2H-seq: a massively multiplexed assay for deep-coverage interactome mapping. Nature Methods. , (2017).
  9. Estojak, J., Brent, R., Golemis, E. A. Correlation of two-hybrid affinity data with in vitro measurements. Molecular and Cellular Biology. 15 (10), 5820-5829 (1995).
  10. Rajagopala, S. V., Hughes, K. T., Uetz, P. Benchmarking yeast two-hybrid systems using the interactions of bacterial motility proteins. Proteomics. 9 (23), 5296-5302 (2009).
  11. James, P., Halladay, J., Craig, E. A. Genomic libraries and a host strain designed for highly efficient two-hybrid selection in yeast. Genetics. 144 (4), 1425-1436 (1996).
  12. Barbas, C. F. 3rd, Burton, D. R., Scott, J. K., Silverman, G. J. Quantitation of DNA and RNA. CSH Protoc. 2007, pdb ip47(2007).
  13. Sambrook, J., Russell, D. W. SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis of Proteins. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (4), (2006).
  14. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  15. Alegria-Schaffer, A. Western blotting using chemiluminescent substrates. Methods in Enzymology. 541, 251-259 (2014).
  16. Plank, J. Practical application of Phenol/Chloroform extraction. , Available from: http://bitesizebio.com/3651/practical-application-of-phenolchloroform-extraction/ (2018).
  17. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. (62), (2012).
  18. Harper, J. W., Adami, G. R., Wei, N., Keyomarsi, K., Elledge, S. J. The p21 Cdk-interacting protein Cip1 is a potent inhibitor of G1 cyclin-dependent kinases. Cell. 75 (4), 805-816 (1993).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

DEEPN
Экран 2-гибрид дрожжи в пакете для сравнения взаимодействий протеина
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.