Методическая статья

Изоляция, расширение и адипогенном индукции CD34 + CD31 + эндотелиальных клеток от человека сальниковый и подкожной жировой ткани

DOI:

10.3791/57804

⸱

17 июля 2018 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiological Sciences, Eastern Virginia Medical School

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Дифференциация белых и бежевых адипоцитов из жировой ткани сосудистой прародителями медведи потенциал повышения метаболизма ожирения. Мы описываем протоколы для CD34 + CD31 + эндотелиальных клеток изоляции из человеческого жира и последующих в vitro расширения и дифференцировку в белом и бежевом адипоцитов. Обсуждаются несколько нисходящие приложения.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ожирение сопровождается обширной реконструкции жировой ткани главным образом через Адипоцит гипертрофия. Экстремальные Адипоцит роста приводит к плохой ответ на инсулин, местные гипоксии и воспаления. Стимулируя дифференциация функциональных белый адипоцитов из прародителей, радикальные гипертрофия Адипоцит населения могут быть предотвращены, и, следовательно, метаболически здоровье жировой ткани могут быть улучшены наряду с сокращением воспаление. Кроме того стимулируя дифференциация бежевый/коричневый адипоциты, расходование энергии всего тела может быть увеличена, что приводит к потере веса. Этот подход может предотвратить развитие ожирения сопутствующие заболевания, такие как тип 2 диабет и сердечно-сосудистых заболеваний.

Этот документ описывает изоляции, расширение и дифференциации белых и бежевых адипоцитов из подмножества жировых тканях человека эндотелиальных клеток, которые совместно Экспресс CD31 и CD34 маркеров. Метод является относительно дешевым и не является трудоемким. Она требует доступа к человека жировой ткани и подкожные депо подходит для выборки. Для этого протокола, свежие жировой ткани образцов из morbidly ожирением предметы [индекс массы тела (ИМТ) > 35] собраны во время процедур бариатрической хирургии. Использование последовательных immunoseparation стромальные сосудистой фракции, достаточно клетки производятся из всего лишь 2-3 g жира. Эти клетки могут быть расширены в культуре в течение 10-14 дней, может быть криоконсервированных и сохраняют свои свойства адипогенном с пассированый до прохождения 5-6. Клетки обрабатываются в течение 14 дней с адипогенном коктейль, используя сочетание человеческого инсулина и PPARγ агонист Росиглитазон.

Эта методология может использоваться для получения доказательство концепции экспериментов на молекулярные механизмы, которые управляют адипогенном ответы в жировых клетках эндотелия, или для скрининга новых лекарств, которые могут повысить адипогенном ответ направлена либо на белый или бежевый/коричневый Адипоцит дифференциации. С помощью небольших подкожной биопсий, эта методология может использоваться для экрана-ответчик предметам для клинических испытаний, направленных на стимулирование бежевый/коричневый и белый адипоциты для лечения ожирения и сопутствующие заболевания.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Последние данные показывают, что в мышей и людей, подмножество ячеек, проживающих в сосудистую жировой ткани могут быть продифференцированы в белый или бежевый/коричневый адипоцитов1,2,3. Фенотип таких клеток является предметом споров, с подтверждающей эндотелиальных клеток, гладкие мышцы/перицит или спектр промежуточных фенотипов4,5,6,7. Область разработки этой методологии было проверить адипогенном потенциал CD34 + CD31 + эндотелиальных клеток, изолированных от различных жировых отложений из тучных людей. Другие исследования в литературе сосредоточены на адипогенном потенциал всего стромальные сосудистой дроби или известных Адипоцит прародителями2,8,9. Поскольку в настоящее время существующих технологий можно ориентировать конкретно эндотелиальные клетки жировой ткани для доставки наркотиков10, понимание потенциал таких клеток пройти адипогенном индукции к белый или бежевый адипоцитов имеет важное значение для будущее целевой терапии.

Различные группы сообщили сочетание CD31 и CD34 маркеры как суррогаты изолировать эндотелиальных клеток от жировых тканях человека11,12,13. Как правило изоляция выполняется с использованием двух последовательных шагов и положительный выбор с помощью магнитной бусины. В настоящем докладе была использована immunoseparation с помощью CD34 + магнитные шарики в сочетании с CD31 пластиковые бусины. Мы нашли этот метод превосходит последовательный магнитные immunoseparation в отношении сохранения типичных булыжником эндотелиальной морфологии. Кроме того мы были способны генерировать достаточно клеток, необходимых для расширения и адипогенном индукции, начиная от всего лишь 1 – 2 g жира. Небольшой пример биопсии подкожного жира достаточно производить необходимое количество клеток для нисходящие приложения. Этот аспект является потенциально важным, особенно, если этот метод будет использоваться для скрининга для оперативности адипогенном индукции в человеке.

В отличие от других систем, в литературе о, этот метод использует только два ингредиенты для индукции адипогенном CD34 + CD31 + клеток: агонист PPARγ — Росиглитазон — и человеческого инсулина. Важно отметить, что количество инсулина используются попадает в диапазон нормальный/высокий циркулирующих post-absorptive инсулина в людях14. Степень реагирования на инсулин клетки в пробирке, измеряется Akt фосфорилирование, не коррелирует с их способность реагировать на индукции коктейль. Интересно, что используя этот индукции коктейль и экспериментальных условиях, смесь белый и бежевый/коричневый клетки были получены как определяется размер и количество внутриклеточной липидного капель и проявление молекулярных маркеров. Этот простой и экономически индукции протокол наряду с количественной оценки фенотипа клетки ответчика (белый и бежевый) позволяет для скрининга агентов, которые потенциально могут изменить баланс дифференцированных бежевый : белый адипоцитов.

Этот метод также предоставляет поступательного подхода для понимания основных механизмов adipogenesis сосудистого эндотелия прародителей в жировых тканях человека. Используя эту технику конкретных изоляции/дифференциация, следователи могут допросить различных путей, ответственный за adipogenesis в подмножестве сосудистой эндотелиальных клеток от различных жировых отложений в худой и тучных людей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Организационного комитета Правления обзор Восточной Вирджинии медицинской школы одобрил исследований и сбора образцах адипозных тканей человека, используемые в исследовании. Обоснованное письменное согласие была собрана из пациентов.

1. Подготовка буферов, средств массовой информации и инструментов

  1. Подготовить раствор Krebs Ringer Bicarbonate-Buffered (KRBBS): 135 мм натрия хлорида, 5 мм хлорид калия, магния сульфата 1 мм, 0,4 мм калия фосфат двухосновной, 5,5 мм глюкозы, 1 мм аденозина, 0,01% антибиотик/противогрибковое микс (50 мкг/мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина, 30 мкг/мл гентамицина, амфотерицин 15 нг/мл) и 10 мм HEPES (рН = 7,4). Этот раствор готовят свежий каждый раз для сбора ткани и пищеварение.
  2. Приготовить свежие коллагеназы раствор: 1 мг/мл коллагеназы, тип 1, в KRBSS; Сделайте 3 мл/г жира. Предварительно теплой коллагеназы решение при 37 ° C на водяной бане до ткани пищеварение.
  3. Подготовить CD34 ячейки изоляции буфера: 2% плода бычьим сывороточным (ФБС) и 1 мм ЭДТА в стерильных фосфат амортизированное saline (PBS).
  4. Подготовить Adipogenesis СМИ: В среде DMEM/F12, 5% FBS, 50 мкг/мл пенициллина/стрептомицина, 1,25 мкл/мл человеческого инсулина (5 мкг/мл или 144 му/мл) и 0,36 мкл/мл Росиглитазон 2,8 мм (1 мкм).
  5. Подготовьте O красный нефти (Оро) Стоковый раствор 0,3% (вес/объем), растворяя 0,3 г в 100 мл изопропанола Оро.

2. жировой стромальные сосудистой фракция изоляции

Примечание: Исследование включало кросс-секционное когортное morbidly ожирением тип 2 диабетом (T2D) и не диабетиков предметов, в возрасте 18 – 65 лет, проходят бариатрической хирургии в Sentara метаболических и центр хирургии потери веса (Sentara медицинская группа, Норфолк, VA). Критерии исключения включали аутоиммунных заболеваний, включая сахарный диабет типа 1, условия, требующие хронический иммуносупрессивной терапии, противовоспалительные препараты, thiazolinendiones, активный табака, хронических или острых инфекций или история злокачественности лечение в течение последних 12 месяцев. T2D был определен как поста глюкозы плазмы 126 мг/дл или более, глюкозы, 200 мг/дл или больше после того, как тест толерантности к глюкозе 2 h или использование антидиабетических препаратов.

  1. Соберите человека сальниковый (ом) и подкожной жировой клетчатки (SC) (AT) от человеческих субъектов, переживает бариатрической хирургии.
  2. Держите ом и SC AT в отдельных флаконах, содержащих Хэнка буфер солевой раствор с 50 мкг/мл пенициллина/стрептомицина при комнатной температуре сразу же после извлечения тканей.
  3. Тщательно очистить и удалить разделы фиброзных и прижигание ткани с помощью 70% этанол обработанных тампонами ножницы и щипчики, когда образец прибывает в лаборатории после извлечения тканей.
  4. Весят жировой ткани и разделов аликвоты ИТ в 5 g (или меньше) для переваривания коллагеназы.
  5. Мелко фарш 5 g AT в 5 мл коллагеназы раствора во флаконе мерцания при комнатной температуре, используя две пары ножниц.
  6. Добавьте дополнительные 10 мл раствора коллагеназы фарш из ткани для всего 15 мл.
  7. Дайджест образцы за 1 ч, при 37 ° C, на водяной бане с непрерывной тряски.
  8. Отрежьте кончик от 20 мл шприц сделать тупой конец.
  9. Вырезать квадрат 9 х 9 см от 250 мкм сетки и вставьте его на полпути в 50 мл Конические трубки с помощью шприца тупой конец.
  10. Полейте образцы в 20 мл шприц тупой конец и процеживают через 250 мкм нейлоновая сетка в 50 мл Конические трубки отделить адипоциты и стромальных клеток сосудистой от непереваренных ткани.
    Примечание: Не используйте более чем 5 g на за 50 мл Конические трубки, как сетка будет получить забиты из-за избыточного фиброзных непереваренных материала.
  11. Промыть сцинтилляционные флакон с 10 мл KRBBS и полить его через фильтр для сбора остаточной клетки.
  12. Инкубируйте отфильтрованных проб для 5 мин при комнатной температуре.
    Примечание: Этот шаг имеет важное значение для адипоцитов плавать в верхней части трубки и некоторые из стромальных клеток сосудистой поселиться в нижней части трубки.
  13. Используйте 20 мл шприц и 20 G x 6 в дозирования иглой, чтобы удалить слой стромы сосудистой дроби и передаче его на чистую 50 мл Конические трубки.
  14. Добавить 10 мл KRBBS и позволяют образцы сидеть на скамейке за 5 мин, при комнатной температуре.
  15. Повторите шаги 2.12 – 2.14 дважды.
    Примечание: Эти шаги будет гарантировать, что нет никакого загрязнения стромальных клеток сосудистой с плавающей адипоцитов.
  16. Держите стромальные сосудистой дроби от обоих складов на льду для дальнейшей обработки, как описано ниже.
    Примечание: Не оставляйте клетки на льду для более чем 1 h, как это может иметь влияние на жизнеспособность клеток. Адипоцитов может быть флэш замороженные в жидком азоте для длительного хранения или свежие для экспериментов.

3. изоляция эндотелиальных клеток жировой ткани

  1. Спиновые стромальные сосудистой фракций (СФДВ) в 500 x g за 5 мин, при 4 ° C.
  2. Удаление примеров из центрифуги и тщательно слейте супернатант; Держите гранулы, содержащие клетки СФДВ.
  3. Нежно ресуспензируйте клетки окатышей в 5 мл ФСБ.
    Примечание: Если в несколько аликвоты (см. шаг 2.4) было обработано более чем 5 g в депо, объединения клеток окатышей.
  4. Спиновые образцов 500 x g за 5 мин, при 4 ° C.
  5. Удалить супернатант, Ресуспензируйте клеток в 1 мл PBS и подсчитать количество ячеек.
    Примечание: Здесь, счетчик автоматически клеток был использован для подсчета клеток. Жизнеспособность клеток был получен путем смешивания 12 мкл суспензии клеток с 12 мкл раствора акридин оранжевый/пропидий йодидом (AO/PI) (см. Таблицу материалы). Среднее количество клеток на грамм на для каждого склада: (a) ом депо: 1.69 x 105 ± 4,51 x 104; (b) SC депо: 1,24 x 105 ± 6.45 x 104. Жизнеспособность клеток от обоих депо было > 90%.
  6. Пеллет образцы на 500 x g за 5 мин, при 4 ° C.
    Примечание: Выбор протокола CD34 иммуномагнитная (см. Таблицу материалы) был адаптирован для шагов 3.7 – 3,15.
  7. Ресуспензируйте гранулы в 100 мкл буфера CD34 изоляции.
    Примечание: Общая клеток требуют следующие тома ресуспендирования: (a) < ячейки 2 x 10-7 : Ресуспензируйте гранулы в 100 мкл; (b) 2 x 10 – 5 x 1088 клеток: Ресуспензируйте гранулы в 1 мл. В шагах 3,9-3.16, были сокращены объемы реагентов, используемых для < ячейки 2 x 10-7 .
  8. 10 мкл CD34 коктейль и Проинкубируйте образцы для 15 мин, при комнатной температуре.
  9. 5 мкл магнитной бусины и Проинкубируйте образцы для 10 мин при комнатной температуре.
  10. Добавить 2,5 мл буфера CD34 изоляции для каждой пробы и образцы в магнит, за 5 мин, при комнатной температуре.
  11. Инвертировать магнитом для 5 s, чтобы слить изоляции буфера.
  12. Удаление образцов из магнита и повторите шаги 4 x 3.10 и 3.11.
  13. Снять трубку из магнита и добавить 2 мл CD34 изоляции буфера.
  14. Пелле клетки на 500 x g за 5 мин, при 4 ° C.
  15. Ресуспензируйте гранулы клеток в 1 мл CD34 изоляции буфера и подсчитать количество ячеек.
    Примечание: Здесь, это среднее количество клеток на грамм на: (a) ом депо: 4,75 x 104 ± 3,36 x 104; (b) SC депо: 1,06 х 104 ± 9,53 x 103. Пластиковые immunobead CD31 протокол был адаптирован для шагов 3.16 – 3,34 (см. Таблицу материалы).
  16. Пелле клетки на 500 x g 5 мин и Ресуспензируйте гранулы в 250 мкл буфера B и 250 мкл буфера мытья.
  17. Тщательно Ресуспензируйте CD31 бусы, vortexing трубки.
  18. 20 мкл CD31 бусы.
    Примечание: Из-за общей клетки подсчитывает > 1 x 106, объем было уменьшено по данным производителя ввода.
  19. Инкубируйте образца с качания на 30 мин, при комнатной температуре.
  20. Прикрепите ситечко для стерильных 50 мл Конические трубки.
    Примечание: Большее открытие ситечко должны быть на вершине.
  21. До разделения клеток добавьте 1 mL мыть буфера, чтобы сбалансировать ситечко. Примените смесь, сформировавшейся под шаг 3.16 ситечко.
  22. Промойте ситечко с 5 мл буфера мытья в круговом движении за общим объемом 20 мл. Подключите разъем для стерильных 50 мл Конические трубки и закрыть luer-lock.
  23. Подключите фильтр к разъему. Добавьте 1 mL мыть буфера вдоль стены ситечко. Добавьте 1 mL активированного буфера D вдоль стены ситечко. Вихревой мягко образца и проинкубируйте втечение 10 мин при комнатной температуре.
  24. Добавьте 1 mL мыть буфера. Отдельные клетки из бисера, закупорить вверх и вниз 10 x.
    Примечание: Избегайте создания пузырьков воздуха.
  25. Откройте luer-lock и позволяют отдельные клетки впадают в 50 мл Конические трубки. Мыть сито 10 x с 1 мл буфера мыть каждый раз.
  26. Удалить соединитель и сетчатый фильтр и Центрифугуйте образцы на 300 x g за 10 мин., на 4 ° C. Ресуспензируйте Пелле клеток в 2 мл полной ЭГМ-2 СМИ для культуры.
    Примечание: Среднее количество клеток на грамм на на данный момент это: (a) ом депо: 5,92 x 103 ± 4,27 x 103; (b) SC депо: 4.12 x 103 ± 2,1 x 103. Жизнеспособность клеток от обоих депо было свыше 90%.

4. индукция Adipogenesis в изолированных эндотелиальных клеток

  1. Рост клеток в 6-хорошо лечить культуры ткани пластины с полным ЭГМ-2 СМИ в 37 ° C, 5% CO2 инкубатора. Замените носитель каждые 3 – 4 дня до 80 – 90% слияния ячеек.
    Примечание: Удвоение населения составляет 2 – 3 дня.
  2. Разверните клетки путем покрытия их на чашки Петри 100 мм и разбить ячейки 1:3 раз. На этой стадии клетки находятся на проход 2.
  3. Счетчик клеток с использованием автоматической клеток противостоять (см. Таблицу материалы).
  4. Семя приблизительно 100 – 200 000 клеток в 6-ну пластины, обеспечение повторяющиеся скважин для каждого депо и культуры их в полный ЭГМ-2 СМИ за 2 дня.
  5. Аспирационная от любого средства роста и заменить его с 2 мл DMEM/F12 с 5% FBS и 50 мкг/мл пенициллина/стрептомицина для управления клетки и заменить его с 2 мл Adipogenesis СМИ (см. шаг 1.4) для лечения клеток.
  6. Инкубировать клетки при 37 ° C в увлажненные 5% CO2 инкубатора для 13 дней, заменив соответствующих средств массовой информации каждые 3 до 4 дней.
    Примечание: Клетки начинают накапливаться липиды после 4 дней лечения.
  7. Проведение Оро и Нил красное окрашивание согласно опубликованным методы15–17.
  8. Чтобы изолировать клетки для извлечения РНК, удалить медиафайл из 6-ну индукционных плит и мыть его с 1 мл стерильного PBS.
  9. 350 мкл раствора тиоцианат фенол хлороформ guanidium (см. Таблицу материалы) для каждой хорошо и проинкубируйте его при комнатной температуре за 5 – 10 мин.
  10. Скрип клетки от пластину с помощью скребка клетки и передать клетки пробки microcentrifuge 1,5 мл.
    Примечание: Образцы можно хранить в морозильной камере-80 ° C для извлечение RNA и дальнейшей обработки на более поздний срок.
  11. Извлечение mRNA из примеров с использованием адаптированных РНК добыча протокола (см. Таблицу материалы).
  12. Выполнять в реальном времени полимеразной цепной реакции (ПЦР) для оценки экспрессии генов, используя следующие датчики: адипонектина, UCP-1 и CIDEA (см. Таблицу материалы).
    Примечание: Здесь, RT-PCR были проведены процедуры с использованием следующих стандартный протокол: денатурация (95 ° C; 15 s), отжига и расширение (60 ° C; 1 мин) 40 циклов. Образцы, которые выразили генов с значения CT > 35 были рассмотрены обнаружить.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Наш протокол направлен на обеспечение в vitro подход для определения адипогенном потенциал CD34 + CD31 + сосудистой клетки из разных депо жировых тканях человека. Упрощенная схема схема изображена на рисунке 1A. Первый шаг, используя положительный выбор CD34 выражая клеток приводит к > 95% CD34 + клеток в населенности свежевыделенных клеток (рис. 1A). Важно отметить, что этот маркер теряется после того, как клетки кул...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В центре внимания настоящего документа – обеспечить методологию для изоляции, расширения и адипогенном индукции CD34 + CD31 + эндотелиальных клеток от висцеральных и подкожные депо жировых тканях человека.

Методологии были зарегистрированы для изоляции эндотелиальных клеток из различных сосудов кровати грызунов или людей, которые связаны главным образом методы с использованием антител CD31 дневно помечены или в сочетании с магнитной бусины18,

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы хотели бы отметить Бекки Маркес, клинических координатором в центре Sentara лечение ожирения, для ее помощи с процессом скрининг и согласие пациента. Это исследование было поддержано R15HL114062 АНКА D. Dobrian.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии

Large Equipment

Кабинет биобезопасности

Nuaire

nu-425-400

Инкубатор для клеточных культур

Thermo-Fisher Scientific

800 DH

Водяная баня

Forma Scientific

2568

Reciprocal Shaker

RT-PCR Machine

BIO-RAD

CFX96-C1000

Electrophoresis Box

BIO-RAD

< 		p>Mini PROTEAN 3 Cell

Transblot Box

BIO-RAD

Mini Trans-Blot Cell

<
p>Electrophoresion Power Supply

BIO-RAD

PowerPac Basic

ELISA Reader

Molecular Devices

SpectraMax M5

Blot Reader

LI-COR

Odyssey

Near Infrared

Рефрижераторная центрифуга

Eppendorf

< 		p>5810 R

Tabletop Centrifuge

Eppendorf

MiniSpin Plus

Fluorescent Microscope

Olympus

BX50

Inverted Microscope

Nikon

TMS

KRBSS Buffer

HEPES

< 		p>Research Products International

H75030

<>Натрия бикарбонат < >Сигма-Олдрич <>792519
<р>Кальция хлорида дигидрат <>Сигма-Олдрич <р>С7902
Калийфосфат моноосновный <р>Сигма-Олдрич <>Р5655
<>Сульфат магния <>Сигма-Олдрич < >М2643
<>Натрия хлорид <>Сигма-Олдрич <>746398
<>Моногидрат фосфата натрия <>Сигма-Олдрич <>С9638
<>калия хлорид <>Сигма-Олдрич <>П93333
<>Глюкоза <>Акрос Органикс <>410950010
<>Аденозин <>Акрос Органикс <>164040250
<> бычья сыворотка альбумин <>GE Здравоохранение Био-Науки <>SH30574.02
<>ппенициллин/стрептомицин <>Thermo-Fisher Scientific <>15070063
<><стронг>Тканальное пищеварение <
р>20 мл шприца <>Глобал Медикал <> 67-2020
<>Нейлоновая сетка, 250 &м; м <>Сефар <>03-250/50
<>Иглы для пипеток <>Поппер <>7934 <>
Тонкие ножницы <> Инструменты для тонкой науки <>14058-11
тканевые щипцы <> Джордж Тиманн & Co

160-20

Collagenaza, тип I

Worthington Biochemical

LS004196

Чашки Петри, 100 мм

США Scientific

5666-4160

TC Treated

Eppendorf Tubes, 1,5 мл

<>США Scientific <>1615-5500
<>конические пробирки, 15 мл <>Nest Scientific <>601052
<>конические пробирки, 50 мл <>Nalgene <>3119-0050
<>сцинтилляционные флаконы <>Кимбл <с>74505-20 <>тканевые кости
<><с> изоляция клеток<>
<>челлометр <>нэкселом < >Авто 2000
<>с Слай<ки на > <>Неexcelom

CHT4-SD100-002

Cellometer Viability Stain

Nexcelom

< 		p>CS2-0106-5mL

Acridine Orange/Propridine идий Йод

<>анти-CD34 магнитные шарики <>Технологии стволовых клеток <>18056 <>Кит
<> EasySep Magnet

StemCell Technologies

18000

Anti-CD31 Пластиковые шарики

pluriSelect США

19-03100-10

pluriSelect 10x Wash Buffer

pluriSelect США

60-00080-10

<
p>pluriSelect Соединительное кольцо< >

pluriSelect США

41-50000-03

<
p>pluriSelect Detach Buffer

pluriSelect США

60-00046-12

<
pluriSelect Incubation Buffer

pluriSelect США

< 		p>60-00060-12

pluriSelect S-клеточный фильтр

pluriSelect США

43-50030-03

<
p>Cell Culture

6-луночные планшеты

США Scientific

CC7682-7506

TC Treated

4- хорошо камерные слайды

<>Corning Life Sciences <>354559 <>пс фибронектиновым покрытием
<>4-луночные горки <>Thermo-Fisher Scientific <р>154526ПК <р> непокрытое стекло
<> жировые микрососудистые эндотелиальные эндотелиальные клетки человека (HAMVEC)

Sciencell Research Laboratories

7200

Primary Cell Line

Endothelial Cell Media (ECM)

ScienCell Research Laboratories

1001

Complete Kit

DMEM/F12 Basal Media

Thermo-Fisher Scientific

<>11320082
<>Фетальная сыворотка крупного рогатого скота (ФБС) <>Роки Маунтин Биологи < >ФБС-ББТ <
Инсулин < >Лилли <>У-100 <>Хумалог
<>Росиглитазон < >Сигма-Олдрич

R2408

<
p>Cell Analysis

Oil Red O Dye

Sigma-Aldrich

O0625

Приготовлено в изопропаноле

96 луночных планшетах

США Scientific

1837-9600

<>96 луночные ПЦР-планшеты <>Genesee Scientific <>24-300
<>РНК Экстракция <>Zymo Research <>р2072 <>Кит <
> синтез кДНК <>БИО-РАД

1708841

Supermix

JumpStart PCR Polymeraza

Sigma-Aldrich

D9307-250UN

Hot start, with PCR Buffer N

Magnesium Chloride Solution

Sigma-Aldrich

M8787-5ML

3 мМ конечная в реакции ПЦР

<>дНТП <>Промега < >У1515 <
Такман АдипоQ < >Thermo-Fisher Scientific <>Hs00605917_m1
<>Такман CIDEA <>Thermo-Fisher Scientific <>Hs00154455_m1
<>ТакМан РПЛ27 <>Термо-Фишер Научный < >Hs03044961_g1
<>Такман UCP1 <>Термо-Фишер Научный <>Hs00222453_m1
<>ВСА Анализ <>Сигма-Олдрич <>QPBCA-1KT <>Кит
<>бис-акриламид <>БИО-РАД <>1610146 <>40% стоковый раствор<>
<>аммония персульфат <>БИО-РАД <>1610700
ТЕМЕД <>БИО-РАД < >1610800
<>Трис <>Сигма-Олдрич <>Т1503
<>глицин <>БИО-РАД < >1610718
<> додекал сульфата натрия < >сигма-Олдрич <>Л3771 <
пЭДТА ЭДТА <>Фишер Сайн <>С311С311-100
<>бромфенол синий <>Сигма-Олдрич <>В8026 <>
Блот-мембрана < >ЭМД Миллипор <>IPFL00010
<>метанол <>Фишер Сайентификал <>А452-СК4
Одиссея Блокирующий буфер, трис <>ЛИ-КОР <>927-50000 <
p>Anti-AKT антитело

Cell Signaling Technology

2920S

Mouse monoclonal

Anti-pAKT антитело

Cell Signaling Technology

9271S

< 		p>Rabbit polyclonal

Anti-UCP1 антитело

Abcam

 <5p>ab10983

Rabbit polyclonal

Anti-Mouse IgG антитела

LI-COR

926-68070

Goat Polyclonal, IRDye 680RD

Anti-Rabbit IgG антитела

LI-COR

926-32211

< 		p >2Козий поликлональный, IRDye 800CW
<>антикроличьи антитела IgG <>джексон ImmunoResearch <>111-025-003 <> козий поликлональный, TRITC

Phosphate Buffer Salt Salt

Thermo-Fisher Scientific

10010049

37% раствор формальдегида

Electron Microscopy Sciences

15686

4% раствор для фиксации клеток

Нормальная козья сыворотка

Vector Laboratories

S-1000

10% блокирующий раствор

Triton X-100

Sigma-Aldrich

X-100

0,1% раствор для пермеабилизации

DAPI

< 		p>Thermo-Fisher Scientific

D1306

Calcein AM

Thermo-Fisher Scientific

p65-0853-39

Cell fluorescent visualization

Matrix Basement Membrane Matrix

Corning Life Sciences

356231

Фактор роста снижен

DiI меченый ацетилированный ЛПНП

<>Термо-Фишер Научный <>л3484
<> <> p>>> <>>ЭДТА пЭДТА пСигма-Олдрич/пЛ3771/ <>

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tang, W., et al. White fat progenitor cells reside in the adipose vasculature. Science. 322 (5901), 583-586 (2008).
  2. Lee, Y. H., Petkova, A. P., Granneman, J. G. Identification of an adipogenic niche for adipose tissue remodeling and restoration. Cell Metabolism. 18 (3), 355-367 (2013).
  3. Min, S. Y., et al. Human 'brite/beige' adipocytes develop from capillary networks, and their implantation improves metabolic homeostasis in mice. Nature Medicine. 22 (3), 312-318 (2016).
  4. Gupta, R. K., et al. Zfp423 expression identifies committed preadipocytes and localizes to adipose endothelial and perivascular cells. Cell Metabolism. 15 (2), 230-239 (2012).
  5. Tran, K. V., et al. The vascular endothelium of the adipose tissue gives rise to both white and brown fat cells. Cell Metabolism. 15 (2), 222-229 (2012).
  6. Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
  7. Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).
  8. Macotela, Y., et al. Intrinsic differences in adipocyte precursor cells from different white fat depots. Diabetes. 61 (7), 1691-1699 (2012).
  9. Lee, Y. H., Petkova, A. P., Mottillo, E. P., Granneman, J. G. In vivo identification of bipotential adipocyte progenitors recruited by beta3-adrenoceptor activation and high-fat feeding. Cell Metabolism. 15 (4), 480-491 (2012).
  10. Xue, Y., Xu, X., Zhang, X. Q., Farokhzad, O. C., Langer, R. Preventing diet-induced obesity in mice by adipose tissue transformation and angiogenesis using targeted nanoparticles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (20), 5552-5557 (2016).
  11. Villaret, A., et al. Adipose tissue endothelial cells from obese human subjects: differences among depots in angiogenic, metabolic, and inflammatory gene expression and cellular senescence. Diabetes. 59 (11), 2755-2763 (2010).
  12. Miranville, A., et al. Improvement of postnatal neovascularization by human adipose tissue-derived stem cells. Circulation. 110 (3), 349-355 (2004).
  13. Sengenes, C., Lolmede, K., Zakaroff-Girard, A., Busse, R., Bouloumie, A. Preadipocytes in the human subcutaneous adipose tissue display distinct features from the adult mesenchymal and hematopoietic stem cells. Journal of Cellular Physiology. 205 (1), 114-122 (2005).
  14. Moller, D. E., Flier, J. S. Insulin resistance--mechanisms, syndromes, and implications. The New England Journal of Medicine. 325 (13), 938-948 (1991).
  15. Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284 (5411), 143-147 (1999).
  16. Novikoff, A. B., Novikoff, P. M., Rosen, O. M., Rubin, C. S. Organelle relationships in cultured 3T3-L1 preadipocytes. The Journal of Cell Biology. 87 (1), 180-196 (1980).
  17. Satish, L., et al. Expression analysis of human adipose-derived stem cells during in vitro differentiation to an adipocyte lineage. BMC Medical Genomics. 8 (41), (2015).
  18. Gimbrone, M. A., Cotran, R. S., Folkman, J. Human vascular endothelial cells in culture. Growth and DNA synthesis. The Journal of Cell Biology. 60 (3), 673-684 (1974).
  19. Burridge, K. A., Friedman, M. H. Environment and vascular bed origin influence differences in endothelial transcriptional profiles of coronary and iliac arteries. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 299 (3), H837-H846 (2010).
  20. Paruchuri, S., et al. Human pulmonary valve progenitor cells exhibit endothelial/mesenchymal plasticity in response to vascular endothelial growth factor-A and transforming growth factor-beta2. Circulation Research. 99 (8), 861-869 (2006).
  21. Hewett, P. W., Murray, J. C. Human microvessel endothelial cells: isolation, culture and characterization. In Vitro Cellular & Development Biology. 29 (11), 823-830 (1993).
  22. Hewett, P. W., Murray, J. C. Human lung microvessel endothelial cells: isolation, culture, and characterization. Microvascular Research. 46 (1), 89-102 (1993).
  23. Hewett, P. W., Murray, J. C., Price, E. A., Watts, M. E., Woodcock, M. Isolation and characterization of microvessel endothelial cells from human mammary adipose tissue. In Vitro Cellular & Development Biology. 29 (4), 325-331 (1993).
  24. Xiao, L., McCann, J. V., Dudley, A. C. Isolation and culture expansion of tumor-specific endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (105), e53072(2015).
  25. Berry, R., Rodeheffer, M. S., Rosen, C. J., Horowitz, M. C. Adipose tissue residing progenitors (adipocyte lineage progenitors and adipose derived stem cells (ADSC). Current Molecular Biology Reports. 1 (3), 101-109 (2015).
  26. Zhou, L., et al. In vitro evaluation of endothelial progenitor cells from adipose tissue as potential angiogenic cell sources for bladder angiogenesis. PLoS One. 10 (2), e0117644(2015).
  27. Curat, C. A., et al. From blood monocytes to adipose tissue-resident macrophages: induction of diapedesis by human mature adipocytes. Diabetes. 53 (5), 1285-1292 (2004).
  28. Sidney, L. E., Branch, M. J., Dunphy, S. E., Dua, H. S., Hopkinson, A. Concise review: evidence for CD34 as a common marker for diverse progenitors. Stem Cells. 32 (6), 1380-1389 (2014).
  29. Traktuev, D. O., et al. A population of multipotent CD34-positive adipose stromal cells share pericyte and mesenchymal surface markers, reside in a periendothelial location, and stabilize endothelial networks. Circulation Research. 102 (1), 77-85 (2008).
  30. Frontini, A., Giordano, A., Cinti, S. Endothelial cells of adipose tissues: a niche of adipogenesis. Cell Cycle. 11 (15), 2765-2766 (2012).
  31. Sengenes, C., Miranville, A., Lolmede, K., Curat, C. A., Bouloumie, A. The role of endothelial cells in inflamed adipose tissue. Journal of Internal Medicine. 262 (4), 415-421 (2007).
  32. Ong, W. K., et al. Identification of specific cell-surface markers of adipose-derived stem cells from subcutaneous and visceral fat depots. Stem Cell Reports. 2 (2), 171-179 (2014).
  33. Ong, W. K., Sugii, S. Adipose-derived stem cells: fatty potentials for therapy. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45 (6), 1083-1086 (2013).
  34. Tchkonia, T., et al. Abundance of two human preadipocyte subtypes with distinct capacities for replication, adipogenesis, and apoptosis varies among fat depots. American Journal of Physiology-Endocrinoloy and Metabolism. 288 (1), E267-E277 (2005).
  35. van de Vyver, M., Andrag, E., Cockburn, I. L., Ferris, W. F. Thiazolidinedione-induced lipid droplet formation during osteogenic differentiation. Journal of Endocrinology. 223 (2), 119-132 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Oil Red OEGM2

Похожие статьи