Методическая статья

Определение Hsp33 в редокс регулируемых Chaperone активность и сопоставления конформационные изменения на Hsp33 с использованием водорода дейтерия обмен масс-спектрометрия

DOI:

10.3791/57806

⸱

7 июня 2018 г.

 ,  ,  , 
1Department of Biological Chemistry, The Alexander Silberman Institute of Life Sciences, Safra Campus Givat Ram, The Hebrew University of Jerusalem

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Один из самых сложных условиях стресса, которые организмов столкнуться во время их жизни предполагает накопление окислителей. Во время окислительного стресса клетки сильно полагаться на молекулярных сопровождающим. Здесь мы представляем методы, используемые для расследования редокс регулируемых анти агрегационной активности, а также мониторирование структурные изменения, регулирующие функции сопровождения, с помощью HDX-МС.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Живые организмы должны регулярно справляться с колебаниями среды в течение их жизненного цикла, включая изменения температуры, рН, накопление реактивнооксигенных видов, и многое другое. Эти колебания могут привести к широко белка разворачивается, агрегации и смерть клетки. Таким образом клетки развивались динамичной и стресс конкретных сеть молекулярной сопровождающих, которые поддерживают «здоровой» протеома в условиях стресса. ATP-независимые сопровождающих представляют собой один из основных класса молекулярной сопровождающих, которые служат в качестве первой линии обороны молекул, защита против агрегации белков в зависимости от стресса. Одна особенность, которую эти сопровождающих имеют в общем является их способность использовать структурные пластичности для их активации стресс конкретных, признание и выпуска смятых клиента.

В этой статье мы ориентируемся на функциональный и структурный анализ одной такой неразрывно неупорядоченных сопровождающий, бактериальных редокс регулируется Hsp33, который защищает белки против агрегации во время окислительного стресса. Здесь мы представляем набор инструментов различных методов для изучения редокс регулируемых сопровождения деятельности, а также для картирования конформационные изменения шаперонов, лежащие в основе его деятельности. В частности, мы описываем процесс, который включает в себя подготовку полностью уменьшается и полностью окисляется белков, следуют анализ сопровождающий анти агрегационной активности в пробирке с помощью светорассеивающего, сосредоточив внимание на степень анти агрегационной активности и его кинетики. Чтобы преодолеть частые промахи, накопленных в ходе статистических анализов, мы описывают использование Kfits, Роман графический инструмент, который позволяет легко обрабатывать кинетическими измерениями. Этот инструмент легко может применяться к другим типам Кинетические измерения для удаления промахов и установка кинетических параметров. Чтобы сопоставить функции с структуры белков, мы описывают установки и процесса структурной масс-спектрометрии техники, водорода дейтерия обмен масс-спектрометрии, что позволяет отображение конформационные изменения на сопровождающий и субстрат в ходе различных этапов деятельности Hsp33. Та же методология может применяться для других взаимодействий протеин протеина и белка лиганд.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Клетки часто сталкиваются накопление реактивнооксигенных видов (ров) производится как побочные продукты дыхания1,2, белков и липидов окисления3,4и дополнительные процессы5, 6,7. Несмотря на РОСИ благотворную роль в различных биологических процессах, таких как сотовые сигнализации8,9 и иммунный ответ10дисбаланс между производством рос и его детоксикации может произойти, ведущих к окислительным подчеркнуть7. Биологической цели ROS являются белки, липиды и нуклеиновые кислоты, окисления, которые влияют на их структуру и функции. Таким образом накопление сотовой окислителей тесно связан с разнообразных патологий, включая рак9,11, воспаление12,13и старения14, 15и были найдены в наступление и прогрессии нейродегенеративных расстройств, таких как Альцгеймера, Паркинсона и ALS болезнь16,17,18.

Недавно синтезированных и зрелые белки очень чувствительны к окислению ввиду потенциально опасные изменения их боковых цепей, которые формируют протеин структуры и функции19,20. Таким образом Оксидативный стресс обычно приводит к инактивации широко белка, сворачиванию и агрегирования, в конечном итоге приводит к смерти клетки. Один из элегантных сотовой стратегии, чтобы справиться с потенциальным ущербом окисление белков является использовать редокс зависимых сопровождающих, которые препятствуют широко белка агрегации, вместо формирования стабильные комплексы с клиента смятых протеинов21 ,,22-23. Эти первой линии обороны сопровождающих быстро активируются по участкам окисления (обычно на остатков цистеина), который преобразует их в мощный анти агрегирование молекул24. Так как Оксидативный стресс приводит в угнетение дыхания и уменьшается в клеточных уровни ATP25, каноническое АТФ зависимые сопровождающих являются менее эффективными при окислительном стрессе условий25,26 ,27. Таким образом, редокс активации АТФ независимые сопровождающих играют жизненно важную роль в поддержании гомеостаза белка после накопления окислителей в бактерий и эукариот (например, Hsp3328 и29 Рида в бактерии, Get330 в peroxiredoxins31 в клетках эукариот: у дрожжей). Деятельность этих сопровождающих сильно зависит от реверсивные конформационные структурных изменений, вызванных участкам окисления, что раскрывает гидрофобные регионы вовлеченных в признании клиента смятых протеинов.

Исследование механизма борьбы с агрегации и принципы, регулирующие признание клиента белков, сопровождающих не легко из-за динамичного и разнообразного характера шаперонов субстрат взаимодействия32,33, 34,35,,3637. Однако, стресс регулируется сопровождающим имеют возможность для продвижения нашего понимания анти статистическую функцию из-за их способность: 1) получить две различные формы сопровождающий, активно (например, окисляется) и неактивных (например, сокращены), с введения или удаления состояния стресса, легко переключаться между ними (например, окислителя и восстановителя), 2) имеют широкий спектр субстратов, 3) образуют весьма стабильные комплексы с клиента белков, которые могут быть оценены различные структурные методологии и 4) сосредоточиться исключительно на признания субстрата и релиз, посредничестве редокс зависимых конформационные изменения, как большинство из этих сопровождающих не хватает складной возможности.

Здесь мы анализируем бактериальных редокс регулируемых сопровождающий Hsp33 в борьбе с агрегационной активности, жизненно важным компонентом системы бактериальной обороны против окисления индуцированного белка агрегации28. При уменьшении Hsp33 это плотно сложенный цинка связывающий белок с без сопровождения деятельности; Однако когда подвергается окислительному стрессу, Hsp33 проходит обширные конформационные изменения, которые предоставляют его субстрат привязки регионов38,39. После окисления иона цинка, который сильно привязан к четыре высоко сохранены хвоща остатков домена C-терминала — выпустила40. Это приводит к образованию двумя дисульфидными облигаций, разворачивается домен C-терминала и дестабилизации соседних компоновщика региона41. C-терминала и компоновщик регионы являются очень гибкими и определяются как частично или внутренне неупорядоченным. По возвращении в не стрессовых условиях которым стало сокращение и шаперонов возвращается в свой родной сложенном состоянии с не анти агрегационной активности. Складывая шаперонов приводит к дальнейшей разворачивается и дестабилизации белка присоединенного клиента, который вызывает его передачи канонической сопровождения системы, DnaK/J, складывая38. Анализ сайтов взаимодействия Hsp33 и предполагает, что Hsp33 использует оба его заряженных неупорядоченных регионов, а также гидрофобные регионов на компоновщик и N-концевой домен для захвата денатурации белков клиента и предотвратить их агрегации38, 42. в сложенном состоянии, эти регионы являются скрытыми сложенном компоновщик и домен C-терминала. Интересно, что компоновщик региона служит привратник Hsp33 в сложенном и неактивные государства, «зондирования» складной статус его рядом C-терминала домен34. Когда дестабилизирована мутагенеза, (либо Точечная мутация или полной последовательности возмущений), Hsp33 преобразуется в конститутивно активных сопровождающий независимо окислительно-восстановительного состояния его редокс чувствительных к которым43.

Здесь представлены протоколы позволяют мониторинг Hsp33 в редокс зависимых сопровождения деятельности, а также картирование конформационные изменения после активации и привязка клиента белков. Эта методология может быть адаптирована для исследования других шаперонов клиент признание моделей, а также не сопровождающий белок белковых взаимодействий. Кроме того мы представляем протоколы для подготовки полностью восстановленного и окисленного сопровождающих, которые могут использоваться в исследованиях других белков редокс переключатель, чтобы выявить потенциальную роль окисление белков на активность белка.

В частности, мы описывают процедуру мониторинга сопровождения деятельности в пробирке и определить его субстратная специфичность под различные типы агрегации белков (химически и термически индуцированной) рассеяния света (LS) измеряется с помощью fluorospectrometer44. В ходе статистической обработки рассеяние света на 360 Нм увеличивается быстро из-за увеличения мутность. Таким образом в зависимости от времени на этой длине волны может контролироваться агрегации. LS — это быстрый и чувствительных метод для тестирования агрегации белков и, таким образом, анти агрегационной активности белка интерес с помощью наномолярных концентрациях, позволяя характеристику белков связанных с агрегации кинетических параметров при различных условий. Кроме того протокол LS, описанный здесь не требуют дорогостоящей аппаратуры и может быть легко устанавливается в любой лаборатории.

Тем не менее это довольно сложной задачей для получения «чистой» кинетических кривых и получения белка кинетических параметров от таких светорассеянию эксперименты, из-за шума и большое количество промахов, порожденных пузырьки воздуха и крупных агрегатов. Чтобы преодолеть это препятствие, мы представляем новый графический инструмент, Kfits45, используется для снижения уровня шума в разных Кинетические измерения, специально приспособлены для белка агрегации кинетических данных. Это программное обеспечение обеспечивает предварительные кинетические параметры для ранней оценки результатов и позволяет пользователю «чистых» больших объемов данных быстро не затрагивая его кинетические свойства. Kfits , реализованных в Python и доступны в открытым исходным кодом на 45.

Один из сложных вопросов в области относится сопоставление сайтов взаимодействия между их клиент белков и сопровождающих и понимания, как сопровождающим признать широкий спектр смятых субстратов. Этот вопрос далее осложняется, когда изучение высокодинамичные белковых комплексов, которые неразрывно связаны неупорядоченных сопровождающих и подверженных агрегации субстратов. К счастью структурные масс-спектрометрии значительно продвинулась в течение последнего десятилетия и успешно оказывает полезные подходы и инструменты для анализа структурных пластичности и карта остатков занимающихся белка признание46, 47 , 48 , 49. здесь, мы представляем один такой техники водород дейтерий обмен масс-спектрометрии (HDX-МС)-которая позволяет отображение остаточного уровня изменения в структурной конформации белка модификации или белка/лигандом привязки35, 50,51,52,53,54,55. HDX-MS использует непрерывного обмена водороды позвоночника от дейтерия, уровень которой зависит от химической среды, доступность, и ковалентных и ковалентные связи56. HDX-MS отслеживает эти обменные процессы, с помощью транс растворителя, часто тяжелой воды (D2O) и позволяет измерения, основанные на изменении молекулярной массой после водорода дейтерия обмена. Замедление темпов обмена водорода дейтерия может привести от водороды участвующих в водородных связей или, просто, от их пространственной помех, который показывает локальных изменений в структуре57. Изменения на Связывание лиганда или столб-поступательные изменения также могут привести к различия в среде водорода с помощью привязки, что привело к различиям в водорода дейтерия обмен (HDX) ставки46,53.

Мы применили эту технологию к 1) карта Hsp33 регионов, которые быстро разворачиваться после окисления, приводит к активации Hsp33 и 2) определить потенциальные привязки интерфейс Hsp33 с его полнометражный смятых субстрата, цитрат синтазы (CS)38.

Методы, описанные в этой рукописи могут применяться к исследованию редокс зависимые функции белков в пробирке, определение анти агрегационной активности и роль структурных изменений (если таковые имеются) в функции протеина. Эти методики могут быть легко адаптированы различных биологических систем и применяется в лабораторных условиях.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка полностью уменьшается и полностью окисляется белков

  1. Подготовка полностью снижение белка
    Примечание: Здесь мы описываем сокращение цинка содержащих белков и использование ZnCl2 решения для восстановления состояния Zn инкорпорейтид, снижение белка. ZnCl2 раствора можно заменить или удалены. Обратите внимание, что время и температуру процесса сокращения зависит стабильность белков и функции и таким образом конкретные за белка.
    1. Оттепель образец протеина на льду и спина его до удаления агрегатов. Проинкубируйте образцы для по крайней мере 1.5 ч при 37 ° C с 5 мм DTT и 20 мкм ZnCl2 (до 70% от концентрации протеина).
      Примечание: Температура на этот шаг зависит от белков и следует скорректировать для стабильности белка.
    2. Удаление DTT, с использованием опреснительной столбцов.
      Примечание: Существуют различные обессоливания доступных столбцов. Протокол ниже описывается процедура, с помощью конкретных опреснительной столбцов (см. Таблицу материалы). Перед использованием других опреснительной столбцов, мы рекомендуем, изучив их эффективность удаления и белка восстановления DTT, поскольку некоторые опреснительной столбцы могут частично поглощать протеина интереса.
      1. Сбалансировать столбце с буфером калия фосфат (КПИ) (40 мм, pH 7.5), полностью заполнив столбец с буфером и позволяя капать из буфера. Повторите этот процесс 2 x.
      2. Удалите фильтр белый диск в столбце, слегка прижав его вниз с помощью пинцета и удаление его; Это легче удалить в то время как столбец заполняется с буфером ключевого показателя эффективности. Пополняйте столбец с КПИ буфера и центрифуги на 1000 x g на 3 мин.
      3. Перевести столбец в чистую пробирку, медленно добавить образец протеина в середине столбце и центрифуги на 1000 x g на 2 мин. DTT-свободный белок в настоящее время поток через.
    3. Проверить его концентрация (например, использовать УФ-Вид спектрометр) и измерить его поглощения в 280 Нм. Рассчитайте концентрацию белка, используя закон пива.
    4. Распространите половину образцы протеина в аликвоты. Инкубируйте аликвоты в анаэробных условиях (например, с помощью анаэробные камеры) для 20 минут для полного удаления кислорода. Уплотнение трубы с пластиковой пленкой и хранить образцы в-20 ° C или -80 ° C, в зависимости от белка.
      Примечание: Вместо анаэробные камеры, трубы может также быть прошит с аргоном для удаления кислорода.
  2. Подготовка полностью окисляется белка
    Примечание: Рекомендуется подготовить образцы окисленных протеина от полностью снижение белков (описанные ранее). Это позволит уменьшить гетерогенность в степени окисления по которым. Это позволяет использовать различные окислительных реагентов; Здесь мы сосредоточены на перекись водорода (H2O2).
    Предостережение: Избегайте чрезмерного окисления как это может привести к нежелательным внутримолекулярной дисульфидными облигаций и необратимого окисления различных аминокислот, в том числе цистеин, метионин, тирозин и другие.
    1. Для оставшихся образца белка добавить 5 мм H2O2 (свеже разбавленный) и Инкубируйте 3 ч при температуре 40 ° C при встряхивании.
      Примечание: Температура на этот шаг зависит от белков и следует скорректировать для стабильности белка.
    2. Сбалансировать столбец с КПИ буфера (40 мм, pH 7.5), полностью заполнив столбец с буфером и позволяя капать из буфера. Повторите этот процесс 2 x.
    3. Удалите фильтр белый диск в столбце, слегка прижав его вниз с помощью пинцета и удаление его; Это легче удалить в то время как столбец заполняется с буфером ключевого показателя эффективности.
    4. Пополняйте столбец с КПИ буфера и центрифуги на 1000 x g на 3 мин.
    5. Перевести столбец в чистую пробирку, добавить образец окисленных протеина медленно к середине столбце и центрифуги на 1000 x g на 2 мин; окисленный белок в настоящее время поток через.
    6. Проверка концентрации белка как шаг 1.2.5, разделить на аликвоты окисленных белки и хранить их в-20 ° C или ° C-80, белок зависимых.

2. светорассеянию агрегации Assay

Примечание: Все концентрации в этот assay шаперонов - и субстрат определенной и должен быть откалиброван. Все буферы должны быть 0,22 мкм фильтрации, как это очень важно, что буферы свободны от каких-либо частиц или пузырьков воздуха и кюветы чистой и свободной от пыли. Это очень важно использовать мешалку в кварцевые кюветы. Проверьте мешалкой различных размеров и форм, с тем чтобы обеспечить эффективное смешивание всего решения без нежелательных воздушных пузырей. Кроме того имеются различные flouorospectrometers в лабораториях и на объектах. Здесь конкретных fluorospectrometer (см. Таблицу материалы) был использован. Различные инструменты имеют разнообразные чувствительность, измерение скорости и сборники параметры. Таким образом точные измерения параметров (например, выбросов и возбуждения пропускной способности, чувствительность и другие) должны быть оптимизированы с помощью известных подверженных агрегации белков и его соответствующие условия. Рекомендуется использование цитрата синтазы (CS) и/или Люцифераза как первоначальный субстратов в наномолярных концентрациях.

  1. Химические агрегации пробирного
    1. Подготовить денатурированного субстрата инкубирования 12 мкм CS на ночь в 40 мм HEPES (рН 7,5) и 4,5 М GdnCl. С целью сохранения рН, растворяют GdnCl в 40 мм HEPES (рН 7,5).
    2. Откройте программное обеспечение fluorospectrometer и перейти на курс измерение времени. Задание параметров: температура: 25 ° C; Λет: 360; Ет пропускной способности: 5 Нм; Λex: 360; Ex пропускной способности: 2,5 Нм; и интервал данных: 0.5 s.
    3. Подготовка образца, добавив 1 600 мкл 40 мм HEPES кварцевые кюветы. Вставьте держатель образца кювет и позволяют достичь желаемой температуры образца.
    4. Установите перемешивании до 600 об/мин и начать измерения до создания базового плана. Продолжайте перемешивание для всего измерения.
    5. Для измерения CS агрегирования в отсутствие сопровождающий, на 120 s в измерении, добавьте (аккуратно, но быстро) 10 мкл денатурированного CS (конечная концентрация 75 Нм). Продолжения измерений для 1200 s.
    6. Чтобы измерить CS агрегации в присутствии Hsp33, в 60 s в измерении, добавить Hsp33 (конечная концентрация 300 Нм). После дополнительных 60 сек, 10 мкл денатурированного CS (конечная концентрация 75 Нм). Продолжения измерений для 1200 s.
      Примечание: При добавлении субстрат или сопровождающий, во избежание вставки пузырей, используйте пипетки 10-мкл.
  2. Тепловой агрегат пробирного
    Примечание: Температура для assay тепловой агрегат зависит стабильность белков и следует скорректировать для каждого белка самостоятельно.
    1. Откройте программное обеспечение fluorospectrometer и перейти на курс измерение времени. Установите параметры следующим образом: температура: 43 ° C; Λет: 360; Пропускная способность выбросов: 5 Нм; Λex: 360; Пропускная способность возбуждения: 2,5 Нм; и интервал данных: 0.5 s.
    2. Подготовка образца, добавив 1 600 мкл подогретым 40 мм HEPES кварцевые кюветы. Вставьте держатель образца кювет и пусть образца достигает 43 ° C.
    3. Установите перемешивании до 600 об/мин и начать измерения до создания базового плана. Продолжайте перемешивание для всего измерения.
    4. Для измерения CS агрегирования в отсутствие сопровождающий, на 120 s в измерении, осторожно добавить CS (конечная концентрация 125 Нм) и продолжать измерения 1200 s.
    5. Чтобы измерить CS агрегации в присутствии Hsp33, в 60 s в измерении, добавить Hsp33 (конечная концентрация 600 Нм). После дополнительных 60 s, добавьте CS (конечная концентрация 125 Нм). Продолжения измерений для 1200 s.
      Примечание: При добавлении субстрат или сопровождающий, Избегайте вставки пузырей.
  3. Удаление шума и анализ данных по Kfits
    Примечание: Kfits доступен на использование Kfits ранее был описан в Rimon и др. 45
    1. Загрузите файл данных.
      Примечание: Это необработанные результаты измерения рассеяния света в текстовом формате запятыми или знаками табуляции.
    2. Чтобы удалить любой шум, выберите параметры анализа. Использование автоматического лучшая модель (рекомендуется), Марк шум является всегда выше сигнала флага.
    3. Вручную удалите очевидные промахи, используя зеленый и красный регулируемый линии; Этот шаг будет отфильтровать шум выше зеленой и красной чертой.
    4. Задайте базовый и форму кривой. После применения шумового порога, скачайте обработанные данные.

3. водорода дейтерия обмен масс-спектрометрия

  1. Подготовка буферов и образцы протеина (Hsp33 и Hsp33-CS комплекс)
    1. Развести образцы протеина до конечной концентрации 1 мг/мл в буфере 25 мм трис-HCl при pH 7.5 и передавать их на 1,5 мл флаконах.
    2. Подготовка белка субстрат сложных проб путем инкубации Hsp33 с CS в соотношении вилл на 43 ° C.
      1. Добавьте CS поэтапный образом во избежание каких-либо быстрое агрегации и плодотворную привязку между Hsp33 и термически развернулось CS.
      2. Используйте по крайней мере четыре шага (то есть, каждый раз добавить четверть окончательного объема) и Проинкубируйте образцы для 15 мин после каждого добавления, чтобы позволить CS защиты Hsp33.
    3. Удалите любые агрегатов с помощью центрифугирования 30 мин на 16000 x g при 4 ° C.
      Примечание: Новые комплексы белка субстрат должен быть готов свежий. Добавление подложки следует постепенно; в противном случае произойдет агрегации. Температуры, субстрат и субстрат концентрации белков специфики.
    4. Подготовьте буфер H (25 мм трис-HCl, рН 7,5), который служит в качестве deuteration управления, и буфер D (25 мм трис-DCl, pH 7.09), который является буфером deuteration. Также готовить свежие тушения буфера (150 мм TCEP, 3 M GdnCl, 0.1% муравьиной кислоты).
      Примечание: Тушения буфера должны быть оптимизированы для протеина интереса для того чтобы получить его максимальной последовательности покрытия после переваривания пепсина.
    5. Перевести все буферы и образцы в пузырьки и поместите их в надлежащей лотков. Держите буферы H и D при 25 ° C (лоток 25 ° C); с другой стороны провести образцов и тушения буфера на 0 - 2 ° C (поддон 0 ° C). Поместите образцы в 150 мкл стеклянными вставками (см. Таблицу материалы) во-первых, а затем перевести их на флаконах.
  2. Подготовка документа
    Примечание: Масс-спектрометр поставляется с двумя сопровождающих программное обеспечение программы: один управляет насосы, и другой управляет масс-спектрометр (см. Таблицу материалов). Следующие шаги будут описаны с помощью этих двух программ.
    1. Вручную Включите все холодильные агрегаты. После того, как все системы охлаждения достигают их целевой температуры, вручную перейдите на загрузку насосы и высокой производительности жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
      Примечание: В нашем случае, они состоят из двух ванны охлаждения и охлаждения ящик (который содержит ловушки и аналитические колонки). Один блок охлаждения охлаждает лоток при 0 ° C, а другой держит поднос при 25 ° C; Температура охлаждения коробки составляет 1-2 ° C.
    2. Открытое программное обеспечение, которое управляет как насосы, а также программное обеспечение, которое управляет масс-спектрометр; Убедитесь, что MS находится в режиме ожидания.
    3. Отключите ВЭЖХ выпускной клапан от MS источника и мыть системы сначала раствором «тройной очистки» (1% муравьиной кислоты, Ацетонитрил 33%, 33% изопропиловый спирт, 33% метанола), а затем с буфером B (80% ацетонитриле, 0.1% муравьиной кислоты) и наконец с буфера (0,1% Муравьиная кислота, pH 2,25), а затем вставить столбец пепсин в системе. При изменении буферов, убедитесь, что для удаления обоих насосов перед продолжением.
    4. Убедитесь, что скорость потока для обоих насосов составляет 0,1 мл/мин и давлением является стабильной.
    5. После промывки системы с устойчивый поток и постоянное давление, вставьте источник MS ВЭЖХ розетки и включите MS.
  3. Масс-спектрометр параметры
    1. Установите пептид ионизации для ионизации электроспрей (ESI) на 175 ° C, оболочка потока газа на 17, aux свечения газа на 2 и напряжение спрей на 4.5 кв (дополнительный рис. 1).
    2. Настройка параметров следующим образом для не транс образцов.
      1. Установите параметры: развертки m/z 300-1500; Резолюция до 70 000 человек; Цель управления автоматическая регулировка усиления (AGC) до 106; и максимальное время впрыска (ИТ) на 100 мс.
        Примечание: 5 самых интенсивных ионов с государствами заряда между + 2 и + 6 (интенсивности их выше, чем 1.3 x 104) и динамического окна 30 будут изолированы.
      2. Выполните фрагментации ионов, высок энергия Столкновительное диссоциации (HCD) в ячейке нескольких столкновение с нормализованной столкновения энергии (Лазурный берег NCE) равен 28. Обнаружить фрагмент ионов тандем MS с разрешением 35000, AGC целевого показателя 105, максимум на 60 ms и изоляции окна 2.0 m/z.
    3. Для транс образцов используют MS1 только с более высоким разрешением 140 000 и иначе аналогичными параметрами.
  4. Запуск эксперимента
    1. Установка лотков следующим образом.
      1. Место буфера H и D в лоток 25 ° C, затем поместить образцы и тушения буфера в трее 0 ° C.
      2. X место Пустые флаконы, совпадают в обоих лотков, где X = количество выборок x количество точек времени.
        Примечание: В трее 25 ° C, Пустые флаконы служить реакция флаконов, и в трее 0 ° C, они служат в качестве закалочной флаконов.
      3. Каждый из пустой флакон содержит пустой стакан вставки; отменить и заменить сказал вставки между экспериментов.
        Примечание: Для того чтобы запустить эксперимент HDX в наиболее эффективных и наименее трудоемкий способ, программное обеспечение, которое позволяет образцов одновременно выполнять был использован (дополнительный рисунок 2). Следующие шаги будут описаны с помощью этого программного обеспечения.
    2. Открытое программное обеспечение. Настройка параметров программы для выполнения следующих действий.
      1. Проинкубируйте каждый образец (5 мкл) с 45 мкл буфера D на несколько минут, в зависимости от выбранных точек времени (например, 1, 3, 18, 40 и 100 мин) при 25 ° C. Инкубируйте в не транс образца с 45 мкл буфера H вместо.
      2. Сразу же после инкубации смешать 50 мкл транс белка в 50 мкл ледяной тушения буфера и внедрить их в столбец иммобилизованных пепсин (20 мм в длину, 2,0 мм в диаметре).
      3. Элюировать любой пептиды из столбца пепсин в столбце предварительной промывкой буфера A 6 мин со скоростью 50 мкл/мин держать буфер A в поле охлаждения при 0 ° C.
      4. Элюировать пептиды из предварительно столбец в столбец аналитической C18 (C18 столбец, 130 Å, 1.7 мкм, 2.1 мм x 50 мм, держал при 0 ° C) и разделить их, применяя линейный градиент Ацетонитрил минимум 100 мкл/Run Ацетонитрил градиент, используя Ацетонитрил 100% качестве буфера B : 7 мин на 2%, 7 мин на 10-30%, 2,5 мин 30-90%, 1,5 мин на 90%, быстрое градиента за 1 мин на 90-8% и наконец сбалансировать столбце для 4 мин на 2%.
    3. Создание последовательности (см. дополнительный Рисунок 2): введите все моменты времени, образец имена и места в лотках, а также буфер имен и расположения.
      Примечание: Программное обеспечение позволяет выравнивание всех различных времени в программу, которая запускается несколько образцов, одновременно, эффективно уменьшается время работы.
  5. Анализ данных
    Примечание: Мы работаем с несколькими программами в процессе анализа данных, включая Протеома открыватель и MaxQuant (свободное программное обеспечение) для идентификации пептида и анализа последовательности покрытия, а также HDX верстак, свободное программное обеспечение, которое позволяет анализ дейтерия включения в белках и сравнение HDX ставок между разными наборами экспериментов. Следующие шаги будут описаны с помощью этих программ.
    1. Анализировать пептид освещение образца, запустив non транс контрольные образцы через программное обеспечение (дополнительный рис. 3). Настройка программного обеспечения, используя следующие параметры.
      1. Используйте метод Sequest HT с No фермента (неопределенная) расщеплять. Поиск для пептидов аминокислот 4-144 с массового толерантности 7 ppm и 0,5 Да для ионов и фрагмент прекурсоров. Разрешить для окисления динамической метионина.
      2. Создайте базу данных для белка, через которую программное обеспечение может определить охват пептида. Экспорт выявленных пептидов в текстовом формате.
    2. Анализировать транс результаты с использованием свободного программного обеспечения верстак HDX58.
      1. Откройте редактор белка и определить белок, вставляя файл покрытия последовательности и пептида протеина.
      2. Далее откройте редактор установки экспериментировать мастера и введите всех запрошенных материалов.
        Примечание: Программа требует количество выборок, число пунктов времени, количество реплицирует, значение пэ-аша буферов и температура.
      3. Наконец ввод параметров, касающихся масс-спектрометр используется, после чего программа генерирует список обнаруженных пептиды.
        Примечание: Программное обеспечение обнаруживает «HDX» пептиды, проверяет изотоп кластеры и демонстрирует четкой визуализации deuteration в образцах.
  6. Представление данных
    1. Ярлык в регионах с дифференцированными deuteration поглощения на структуре с помощью PyMol программного обеспечения или любого другого программного обеспечения визуализации.
    2. Ввести уровни поглощения дейтерий вместо значения B-фактор.
      Примечание: Основной учебник можно найти на https://pymolwiki.org/index.php/Practical_Pymol_for_Beginners.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Представлены два метода позволяют следовать кинетическая активности и динамики белковых взаимодействий между сопровождающий и его субстрата. Кроме того уменьшение окисления протокол позволяет подготовку полностью уменьшается и полностью окисляется сопровождающий, давая более глубокое понимание механизма активации окислительно зависимых неупорядоченных сопровождающим.

Во-первых мы использовали рассеяние света с целью изучения зав...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой статье мы предоставили протоколы для анализа деятельности сопровождающий редокс зависимых и характеристика структурных изменений после привязки клиента белка. Они являются взаимодополняющими методологии для определения потенциальных шаперонов субстрат комплексов и анализировать потенциальные взаимодействия сайтов.

Здесь мы применили эти протоколы для описания комплекса между редокс регулируемых шаперонов Hsp33 с изученной сопровождающий подложки CS. Мы представили два различных типов бе...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы благодарны Meytal Радзински за ее полезные обсуждения и критических чтении этой статьи и Патрик Гриффин и членов его лаборатории для их неограниченной помощи при установлении HDX анализ платформы. Авторы благодарны немецко-Израиль фонд (I-2332-1149.9/2012), двусторонней научный фонд (2015056), Мари Кюри интеграции Грант (618806), научный фонд Израиля (1765/13 и 2629/16) и человека пограничной науки Программа (CDA00064/2014) за их финансовую поддержку.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<сильно>Химикаты, Реагенты
Ацетонитрил ВЭЖХ плюсSigma Aldrich34998-2,5Lрастворитель
Муравьиная кислота Optima LC/MSFisher ChemicalsA117-50добавка растворителя
Изопропиловый спирт, ВЭЖХ классаFisher ChemicalsP750717растворитель
МетанолFisher ChemicalsA456-212растворитель
Трис(гидроксиметил)аминометанSigma Aldrich252859буфер
Трифторуксусная кислотаSigma Aldrich76-05-1растворитель
Вода для ВЭЖХSigma Aldrich270733-2.5L-Mрастворитель
ZnCl2, хлорид цинкаMerckB0755416 308реагент
DTTgoldbio27565-41-9восстановитель
PD мини-ловушка G-25 колонки GE здравоохранениеGE здравоохранение GE здравоохранение29-9180-07колонна для обессоливания
фосфат калияБиохимическая корпорация США20274буфер
перекись водорода 30%MerckK46809910526окислитель
цитратсинтазасигма олдричC3260субстрат
HEPES бескислотныйсигма олдрич7365-45-9буфер
Gndclсигма олдричG3272-500Gденатурант
раствор хлорида дейтериясигма олдрич543047-10Gбуфер
оксид дейтерия 99%сигма олдрич151882-100Gрастворитель
TCEPбиомир42000058-2восстановитель
Микро-вставка 150 мкл с внутренней оправкой и Полимерные ножки, 29 * 5 ммla-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific
1,5 мл Прозрачный флакон с короткой резьбой 9 мм резьба, 11,6 * 32 ммLa-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific
кварцевая кюветаHellma 101-QS
strong>Instruments
Jasco FP-8500 ФлуороспектрометрJasco
Термомиксер ComfortEppendorf13058/0
Heraeus Megafuge 16R, настольныйЦентрифугаThermo Scientific
pH-метр, PB-11 sartoriusSartorius13119/0
AffiPro Иммобилизованная колонка из пепсина (длина 20 мм, диаметр 2,0 мм).AffiPro
Waters (ACQUITY UPLC BEH C18 VanGuard 130 Å, 1,7 мкм, 2,1 ммx5 мм)Аналитическая
C18 (ACQUITY UPLC Peptide BEH c18 Column, 130 Å, 1,7 мкм, 2,1 ммx50 мм)
Виниловая анаэробная камера с дверцей AirlockCOY
Q-exactive-orbitrap масс-спектрометрThermo-Fischer Научная
PAL система LHX - роботизированная система для работы с HDX образцамиPAL системаhttps://www.palsystem.com/index.php?id=840
Dionex Ultimate 3000, XRS насосThermo Scientific
Dionex AXP-MS вспомогательный насосThermo Scientific
Software, программные инструменты, база данных поиска
Kfits: Данные агрегации посадкиhttp://kfits.reichmannlab.com/fitter/
программное обеспечение Xcalibur от Thermo Scientifichttps://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30487
интерфейсе Q Exactive серии MS Tune (Tune)https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/WS-MS-Q-Exactive-Calibration-Maintenance-iQuan2016-EN.pdf
Программное обеспечение Chronos (Axel Semrau)http://www.axel-semrau.de/en/Software/Software+Solutions/Chronos-p-966.html
программное обеспечение Proteome Discoverer V1.4https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30795
программное обеспечение HDXhttp://hdx.florida.scripps.edu/hdx_workbench/Home.html
<Предварительная колонка колонка Waters

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wong, H. S., Dighe, P. A., Mezera, V., Monternier, P. A., Brand, M. D. Production of superoxide and hydrogen peroxide from specific mitochondrial sites under different bioenergetic conditions. Journal of Biological Chemistry. 292 (41), 16804-16809 (2017).
  2. Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochemical Journal. 417 (1), 1-13 (2009).
  3. Walker, C. L., Pomatto, L. C. D., Tripathi, D. N., Davies, K. J. A. Redox regulation of homeostasis and proteostasis in peroxisomes. Physiological Reviews. 98 (1), 89-115 (2018).
  4. Hohn, A., Konig, J., Jung, T. Metabolic syndrome, redox state, and the proteasomal system. Antioxidants & Redox Signaling. 25 (16), 902-917 (2016).
  5. Holmstrom, K. M., Finkel, T. Cellular mechanisms and physiological consequences of redox-dependent signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (6), 411-421 (2014).
  6. Halliwell, B., Gutteridge, J. M. C. Free radicals in biology and medicine. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2007).
  7. He, L., et al. Antioxidants maintain cellular redox homeostasis by elimination of reactive oxygen species. Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 44 (2), 532-553 (2017).
  8. Bae, Y. S., Oh, H., Rhee, S. G., Yoo, Y. D. Regulation of reactive oxygen species generation in cell signaling. Molecules and Cells. 32 (6), 491-509 (2011).
  9. Giles, G. I. The redox regulation of thiol dependent signaling pathways in cancer. Current Pharmaceutical Design. 12 (34), 4427-4443 (2006).
  10. Qiao, J., et al. Regulation of platelet activation and thrombus formation by reactive oxygen species. Redox Biology. 14, 126-130 (2018).
  11. Milkovic, L., Siems, W., Siems, R., Zarkovic, N. Oxidative stress and antioxidants in carcinogenesis and integrative therapy of cancer. Current Pharmaceutical Design. 20 (42), 6529-6542 (2014).
  12. Duecker, R., et al. Oxidative stress-driven pulmonary inflammation and fibrosis in a mouse model of human ataxia-telangiectasia. Redox Biology. 14, 645-655 (2018).
  13. Winterbourn, C. C., Kettle, A. J. Redox reactions and microbial killing in the neutrophil phagosome. Antioxidants & Redox Signaling. 18 (6), 642-660 (2013).
  14. Jones, D. P. Redox theory of aging. Redox Biology. 5, 71-79 (2015).
  15. Labunskyy, V. M., Gladyshev, V. N. Role of reactive oxygen species-mediated signaling in aging. Antioxidants & Redox Signaling. 19 (12), 1362-1372 (2013).
  16. Kurian, P., Obisesan, T. O., Craddock, T. J. A. Oxidative species-induced excitonic transport in tubulin aromatic networks: potential implications for neurodegenerative disease. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 175, 109-124 (2017).
  17. Marinelli, P., et al. A single cysteine post-translational oxidation suffices to compromise globular proteins kinetic stability and promote amyloid formation. Redox Biology. 14, 566-575 (2018).
  18. Bozzo, F., Mirra, A., Carrì, M. T. Oxidative stress and mitochondrial damage in the pathogenesis of ALS: new perspectives. Neuroscience Letters. 636, 3-8 (2017).
  19. Lo Conte, M., Carroll, K. S. The redox biochemistry of protein sulfenylation and sulfinylation. Journal of Biological Chemistry. 288 (37), 26480-26488 (2013).
  20. Reichmann, D., Jakob, U. The roles of conditional disorder in redox proteins. Current Opinion in Structural Biology. 23 (3), 436-442 (2013).
  21. Suss, O., Reichmann, D. Protein plasticity underlines activation and function of ATP-independent chaperones. Frontiers in Molecular Biosciences. 2, 43(2015).
  22. Voth, W., Jakob, U. Stress-activated chaperones: a first line of defense. Trends in Biochemical Sciences. 42 (11), 899-913 (2017).
  23. Segal, N., Shapira, M. HSP33 in eukaryotes - an evolutionary tale of a chaperone adapted to photosynthetic organisms. The Plant Journal. 82 (5), 850-860 (2015).
  24. Dahl, J. U., Gray, M. J., Jakob, U. Protein quality control under oxidative stress conditions. Journal of Molecular Biology. 427 (7), 1549-1563 (2015).
  25. Winter, J., Linke, K., Jatzek, A., Jakob, U. Severe oxidative stress causes inactivation of DnaK and activation of the redox-regulated chaperone Hsp33. Molecular Cell. 17 (3), 381-392 (2005).
  26. Wang, J., Sevier, C. S. Formation and reversibility of BiP protein cysteine oxidation facilitate cell survival during and post oxidative stress. Journal of Biological Chemistry. 291 (14), 7541-7557 (2016).
  27. Zhang, H., et al. Glutathionylation of the bacterial Hsp70 chaperone DnaK provides a link between oxidative stress and the heat shock response. Journal of Biological Chemistry. 291 (13), 6967-6981 (2016).
  28. Jakob, U., Muse, W., Eser, M., Bardwell, J. C. Chaperone activity with a redox switch. Cell. 96 (3), 341-352 (1999).
  29. Muller, A., et al. Activation of RidA chaperone function by N-chlorination. Nature Communications. 5, 5804(2014).
  30. Voth, W., et al. The protein targeting factor Get3 functions as ATP-independent chaperone under oxidative stress conditions. Molecular Cell. 56 (1), 116-127 (2014).
  31. Moon, J. C., et al. Oxidative stress-dependent structural and functional switching of a human 2-Cys peroxiredoxin isotype II that enhances HeLa cell resistance to H2O2-induced cell death. Journal of Biological Chemistry. 280 (31), 28775-28784 (2005).
  32. Wright, M. A., et al. Biophysical approaches for the study of interactions between molecular chaperones and protein aggregates. Chemical Communications. 51 (51), 14425-14434 (2015).
  33. Haslbeck, M., Vierling, E. A first line of stress defense: small heat shock proteins and their function in protein homeostasis. Journal of Molecular BIology. 427 (7), 1537-1548 (2015).
  34. Rimon, O., et al. A role of metastable regions and their connectivity in the inactivation of a redox-regulated chaperone and its inter-chaperone crosstalk. Antioxidants & Redox Signaling. 27 (15), 1252-1267 (2017).
  35. Daturpalli, S., Kniess, R. A., Lee, C. T., Mayer, M. P. Large rotation of the N-terminal domain of Hsp90 is important for interaction with some but not all client proteins. Journal of Molecular Biology. 429 (9), 1406-1423 (2017).
  36. Rist, W., Graf, C., Bukau, B., Mayer, M. P. Amide hydrogen exchange reveals conformational changes in hsp70 chaperones important for allosteric regulation. Journal of Biological Chemistry. 281 (24), 16493-16501 (2006).
  37. Koldewey, P., Horowitz, S., Bardwell, J. C. A. Chaperone-client interactions: non-specificity engenders multifunctionality. Journal of Biological Chemistry. 292 (29), 12010-12017 (2017).
  38. Reichmann, D., et al. Order out of disorder: working cycle of an intrinsically unfolded chaperone. Cell. 148 (5), 947-957 (2012).
  39. Winter, J., Ilbert, M., Graf, P. C., Ozcelik, D., Jakob, U. Bleach activates a redox-regulated chaperone by oxidative protein unfolding. Cell. 135 (4), 691-701 (2008).
  40. Jakob, U., Eser, M., Bardwell, J. C. Redox switch of Hsp33 has a novel zinc-binding motif. Journal of Biological Chemistry. 275 (49), 38302-38310 (2000).
  41. Ilbert, M., et al. The redox-switch domain of Hsp33 functions as dual stress sensor. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (6), 556-563 (2007).
  42. Groitl, B., et al. Protein unfolding as a switch from self-recognition to high-affinity client binding. Nature Communications. 7, 10357(2016).
  43. Cremers, C. M., Reichmann, D., Hausmann, J., Ilbert, M., Jakob, U. Unfolding of metastable linker region is at the core of Hsp33 activation as a redox-regulated chaperone. Journal of Biological Chemistry. 285 (15), 11243-11251 (2010).
  44. Kumar, A., Mishra, S., Khan, E. Emerging methods for structural analysis of protein aggregation. Protein & Peptide Letters. 24 (4), 331-339 (2017).
  45. Rimon, O., Reichmann, D. Kfits: a software framework for fitting and cleaning outliers in kinetic measurements. Bioinformatics. 34 (1), 129-130 (2018).
  46. Percy, A. J., Rey, M., Burns, K. M., Schriemer, D. C. Probing protein interactions with hydrogen/deuterium exchange and mass spectrometry - a review. Analytica Chimica Acta. 721, 7-21 (2012).
  47. Sinz, A. Divide and conquer: cleavable cross-linkers to study protein conformation and protein-protein interactions. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (1), 33-44 (2017).
  48. Sinz, A., Arlt, C., Chorev, D., Sharon, M. Chemical cross-linking and native mass spectrometry: a fruitful combination for structural biology. Protein Science. 24 (8), 1193-1209 (2015).
  49. Schmidt, C., Beilsten-Edmands, V., Robinson, C. V. Insights into eukaryotic translation initiation from mass spectrometry of macromolecular protein assemblies. Journal of Molecular Biology. 428, 2 Pt A 344-356 (2016).
  50. Marciano, D. P., Dharmarajan, V., Griffin, P. R. HDX-MS guided drug discovery: small molecules and biopharmaceuticals. Current Opinion in Structural Biology. 28, 105-111 (2014).
  51. Mistarz, U. H., Brown, J. M., Haselmann, K. F., Rand, K. D. Probing the binding interfaces of protein complexes using gas-phase H/D exchange mass spectrometry. Structure. 24 (2), 310-318 (2016).
  52. Harrison, R. A., Engen, J. R. Conformational insight into multi-protein signaling assemblies by hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry. Current Opinion in Structural Biology. 41, 187-193 (2016).
  53. Brown, K. A., Wilson, D. J. Bottom-up hydrogen deuterium exchange mass spectrometry: data analysis and interpretation. Analyst. 142 (16), 2874-2886 (2017).
  54. Vadas, O., Jenkins, M. L., Dornan, G. L., Burke, J. E. Using hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry to examine protein-membrane interactions. Methods in Enzymology. 583, 143-172 (2017).
  55. Zanphorlin, L. M., et al. Heat shock protein 90 kDa (Hsp90) has a second functional interaction site with the mitochondrial import receptor Tom70. Journal of Biological Chemistry. 291 (36), 18620-18631 (2016).
  56. Hvidt, A., Nielsen, S. O. Hydrogen exchange in proteins. Advances in Protein Chemistry. 21, 287-386 (1966).
  57. Roberts, V. A., Pique, M. E., Hsu, S., Li, S. Combining H/D exchange mass spectrometry and computational docking to derive the structure of protein-protein complexes. Biochemistry. 56 (48), 6329-6342 (2017).
  58. Pascal, B. D., et al. HDX Workbench: software for the analysis of H/D exchange MS data. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 23 (9), 1512-1521 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Hsp33Kfits

Похожие статьи