Методическая статья

Co Иммунопреципитация Assay с использованием эндогенного ядерных белков из клетки культивировали в гипоксических условиях

17.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/57836

⸱

2 августа 2018 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Lee Kong Chian School of Medicine, Nanyang Technological University, 2Singapore Eye Research Institute (SERI), Singapore General Hospital, 3The Rolf Luft Research Center for Diabetes and Endocrinology, Karolinska Institutet, Karolinska University Hospital, 4Cancer and Stem Cell Biology Program, Duke-NUS Medical School, 5Department of Cell and Molecular Biology, Karolinska Institutet

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы описываем co иммунопреципитация протокол изучать белок белковых взаимодействий между эндогенного ядерных белков в гипоксических условиях. Этот метод подходит для демонстрации взаимодействия факторов транскрипции и transcriptional совместно регуляторы на гипоксии.

Аннотация

Низкой кислорода (гипоксии) вызывают различные меры адаптационного реагирования с гипоксией индуцибельной фактор 1 (HIF-1) комплекс, действуя в качестве главного регулятора. HIF-1 состоит из кислорода регулируется α субъединица гетеродимерная (HIF-1α) и конститутивно выразил β-субъединица (HIF-1β) также известен как арил углеводородов рецептор ядерной вступают (ARNT), регулирующие генов, участвующих в различных процессах, включая ангиогенеза , эритропоэза и гликолиз. Идентификация HIF-1 взаимодействуя протеины является ключом к пониманию гипоксии, сигнальный путь. Помимо регулирования HIF-1α стабильности гипоксия также вызывает ядерной транслокации многих факторов транскрипции, включая HIF-1α и ARNT. В частности большинство нынешних методов, используемых для изучения таких взаимодействий протеин протеина (ИЦП) основаны на системах, где уровни белка искусственно увеличить через гиперэкспрессия белка. Гиперэкспрессия белка часто приводит к не физиологические результаты, вытекающие из временных и пространственных артефактов. Здесь мы описываем модифицированных co иммунопреципитация протокола после лечения гипоксии с использованием эндогенного ядерных белков и как доказательство концепции, чтобы показать взаимодействие между HIF-1α и ARNT. В этом протоколе гипоксических клетки были собраны в гипоксических условиях и Дульбекко физиологический Phosphate-Buffered (DPBS) мыть буфер был также предварительно уравновешенной гипоксические условия перед использованием смягчения последствий деградации белка или комплекс белков диссоциация во время реоксигенацию. Кроме того ядерная фракций впоследствии были извлечены сконцентрироваться и стабилизировать эндогенного ядерных белков и избежать возможных ложных результатов, часто видели во время гиперэкспрессия белка. Этот протокол может использоваться для демонстрации эндогенных и родной взаимодействия факторов транскрипции и transcriptional совместно регуляторы в гипоксических условиях.

Введение

Гипоксия происходит, когда недостаточно кислорода поступает в клетки и ткани тела. Она играет важную роль в различных физиологических и патологических процессах дифференцировки стволовых клеток, воспаление и рака1,2. Гипоксия индуцибельной факторов (HIFs) функции гетеродимерами состоит из кислорода регулируется α-субъединицы и конститутивно выраженной β-субъединица также известен как ARNT3. К настоящему времени было выявлено три изоформ субблоков HIF-α (HIF-1α, HIF-2α и HIF-3α) и три HIF-β-субъединиц (ARNT/HIF-1β, ARNT2 и ARNT3). HIF-1α и ARNT повсеместно выражается, тогда как HIF-2α, HIF-3α, ARNT2 и ARNT3 имеют более ограниченный выражение модели4. Комплекс белков HIF-1 является ключевым регулятором ответ гипоксии. В гипоксических условиях HIF-1α стабилизируется, затем translocates в ядро и последнего с ARNT5. Впоследствии этот комплекс связывается с конкретным нуклеотидов, известный как гипоксия реагировать элементов (HREs) и регулирует выражение генов-мишеней участвует в различных процессах, включая ангиогенеза, эритропоэза и гликолиз6. Помимо этого «канонической» ответ, гипоксия сигнальный путь также известен уровень помех с несколькими клеточный ответ, сигнальные пути как вырезка и ядерного фактора Каппа B (NF-κB)7,8,9.

Определение Роман HIF-1 взаимодействуя протеины имеет важное значение для лучшего понимания гипоксии, сигнальный путь. В отличие от ARNT, которая нечувствительна к уровень кислорода и конститутивно выраженной, уровни белка HIF-1α плотно регулируется клеточного кислорода. В normoxia (21% кислорода) HIF-1α белки являются быстро деградированных10,11. Короткий период полураспада HIF-1α на normoxia представляет конкретные технические проблемы для обнаружения белка от выдержек клетки, а также для идентификации HIF-1α-взаимодействия белков. Кроме того несколько факторов транскрипции, в том числе HIF-1 комплекса перемещают в ядре при гипоксических условий12,,1314. Большинство нынешних методов, используемых для исследования PPI выполняются с использованием не физиологические гиперэкспрессия белков. Сообщается, что такие гиперэкспрессия белка причиной различных клеточных дефекты через несколько механизмов, включая перегрузки ресурсов, нейтро дисбаланс, неразборчивый взаимодействия и пути модуляции15,16. С точки зрения исследований PPI гиперэкспрессия белка может привести к ложный положительный, или даже ложные отрицательный, результаты в зависимости от свойства белков и функции гиперэкспрессия белка. Таким образом нынешние методы PPI исследований должны быть изменены для того, чтобы выявить физиологически соответствующих ИЦП в гипоксических условиях. Ранее мы продемонстрировали взаимодействие между HIF-1 и Ets семьи транскрипционный фактор GA-связывающий белок (GABP) в гипоксических P19 клеток, что способствует ответ промоутер Hes1 гипоксии17. Здесь мы описываем co иммунопреципитация протокол для изучения ИЦП между эндогенного ядерных белков в гипоксических условиях. Взаимодействие между HIF-1α и ARNT показано как доказательство концепции. Этот протокол предназначен для демонстрации взаимодействия факторов транскрипции и transcriptional совместно регуляторы в гипоксических условиях, включая, но не ограничиваясь идентификации HIF-1 взаимодействуя белками.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Этот протокол раздел, который использует человеческих эмбриональных почек 293A (HEK293A) клеток, s соответствует руководящим принципам Комитета по этике исследований человеческого в Nanyang технологический университет, Сингапур.

1. индукция гипоксии в HEK293A клетках

  1. Подготовить четыре блюда 10 см и семян 3 – 5 x 10-6 HEK293A клетки за блюдо в 10 мл Дульбекко изменение орла среднего (DMEM, 4,5 г/Л глюкозы) дополнены 10% плода бычьим сывороточным (ФБС), 2 мм L-глютамином, пируват натрия 110 мг/Л, 100 ед/мл пенициллин и 100 мг / Мл стрептомицина. Культура клетки в 37 ° C, 5% CO2 инкубатора.
    Примечание: Заполнение ячейки должны осуществляться в биологической безопасности кабинета (BSC). С 70% этанол следует протереть поверхности всех материалов, чтобы быть помещены в BSC.
  2. 24 ч после посева, когда клетки достигли 80 – 90% confluency, положить два блюда в subchamber гипоксии в инкубатор бардачком (см. Таблицу материалы) с 1% O2 и 5% CO2 при 37 ° C и держать два других блюд в normoxia (21% O 2, 5% CO2 при 37 ° C) для 4 ч. использовать один набор нормоксические и гипоксии клетки для оценки лечения гипоксии на западной помарке и использовать другой набор ячеек для co иммунопреципитация экспериментов.
    Примечание: Уровни кислорода могут быть установлены в 0 – 5% и продолжительность лечения гипоксии может изменяться в зависимости от типа клеток и изучить цели.

2. вся ячейка и ядерной добыча

Примечание: См. таблицу 1 для получения информации о буферы, используемые в настоящем Протоколе.

  1. Урожай клетки normoxia управления.
    1. Извлеките носитель культуры путем аспирации и промойте клетки с 10 мл DPBS (рН 7,0-7,2) с помощью пипетки 10 мл.
      Примечание: Не прикасайтесь к монослою клеток с пипеткой. Во время стирки, аккуратно Пипетка DPBS вниз по стене плиты культуры клеток во избежание потери клеток.
    2. Пипетка 5 мл ледяной DPBS в пластину и циклюют клетки с поверхности пластины в ледяной PBS с скребок ячейки.
    3. Передача суспензию клеток в 15 мл конические трубы и держать на льду.
  2. Урожай клетки культивировали в гипоксических условиях.
    1. Предварительно сбалансировать DPBS гипоксических условий, поместив открытая 100 эксперимент стекла реагентов мл заполнены с DPBS в subchamber гипоксии (1% O2 и 5% CO2 при 37 ° C) за 24 часа заранее.
    2. Примерно 1 час до уборки лечение гипоксии клетки, поместите лед окно, содержащее льда в камеру обработки бардачком, который сбалансирован для 1% O2 и 5% CO2. Передача флакон, содержащий предварительно уравновешенной гипоксическая DPBS от гипоксии subchamber в камеру обработки и поместите его на льду.
    3. 4 h после лечения гипоксии, передачи клетки от гипоксии subchamber в камеру обработки, которая была предварительно уравновешенной 1% O2 и 5% CO2.
    4. Извлеките носитель культуры путем аспирации и промойте клетки один раз с 10 мл ледяной предварительно уравновешенной гипоксическая DPBS с 10 мл Пипетка.
    5. Добавьте 5 мл ледяной предварительно уравновешенной DPBS с 5 мл Пипетка и выбить клетки, соскоб с скребок ячейки.
    6. Наклона пластины культуры клеток и собирать отдельные клетки, с помощью пипетки 10 мл. Перевести суспензию клеток в DPBS на 15 мл конические трубы и держать на льду.
    7. Откройте дверь между обработки и буфера палаты бардачком, оба из которых были предварительно уравновешенной 1% O2 и 5% CO2. Передача 15 мл конические трубы на льду, содержащих лечение гипоксии клетки от обработки камеры в камеру буфера. Откройте дверь в камеру буфера и полностью удалить ячейки с бардачком.
  3. Пелле как нормоксические клетки от 2.1 и гипоксии клетки от 2.2 центрифугированием на 1000 x g 5 мин при 4 ° C.
  4. Подготовьте клеточных экстрактов.
    1. Ресуспензируйте клетки окатышей в 500 мкл буфера lysis ледяной радио иммунопреципитации пробирного (RIPA), содержащий 50 мм Trisaminomethane гидрохлорид (Tris-HCl) рН 8,0, 150 мм хлорид натрия (NaCl), 1% tergitol тип NP-40 (NP-40), 0,5% Дезоксихолат натрия, и 0,1% лаурилсульфат натрия (SDS), дополнены 1 x коктейль ингибитор протеазы (см. Таблицу материалы), закупорить гранулы ячейку вверх и вниз несколько раз.
    2. Передача lysates клетки в новой microcentrifuge 1.5 мл пробирок и держать на льду на 30 мин с случайные vortexing.
    3. Центрифуга lysates клетки на 13 000 x g 10 мин при 4 ° C.
    4. Собирать супернатанта, аликвота 50 мкл супернатант в 1,5 мл microcentrifuge трубы и хранить при температуре-80 ° C.
  5. Подготовить ядерной выдержки, с использованием ядерных добыча комплект (см. таблицу материалы).
    1. Нежно ресуспензируйте клетки окатышей в 500 мкл NL буфера lysis дополнен с 1 x ингибитор протеазы коктейль и 0,1 М Дитиотреитол (DTT), закупорить гранулы ячейку вверх и вниз несколько раз.
    2. 25 мкл моющего раствора NP суспензию клеток и вихревые для 10 s на максимальной скорости.
    3. Центрифуга на 10000 x g 5 мин при 4 ° C.
    4. Супернатант (цитоплазматических экстракты), аликвота 50 мкл супернатант в 1,5 мл microcentrifuge трубы, собирать и хранить при температуре-80 ° C.
    5. Ресуспензируйте гранулы, содержащие клеточных ядер в 500 мкл буфера lysis NL, дополнен с 1 x ингибитор протеазы коктейль и 0,1 М DTT vortexing для 5 s на максимальной скорости.
    6. Центрифуга на 10000 x g 5 минут при температуре 4 ° C и сохранить ядерный Пелле.
    7. Ресуспензируйте ядерной Пелле в 50 мкл извлечения буфер NX1 дополнен с 1 x ингибитор протеазы коктейль закупорить Пелле вверх и вниз несколько раз.
    8. Инкубируйте 30 минут на льду, vortexing для 10 s каждые 5 минут на максимальной скорости.
    9. Центрифуга на 12000 x g 10 мин при 4 ° C.
  6. Опреснения ядерной экстрактов.
    1. Соберите супернатант от шага 2.5.9 и передаче в устройства мини-диализа с максимальный объем 100 мкл на единицу.
    2. Крышка устройства мини-диализа и поместите их в устройство флотации.
    3. Поставьте устройство флотации в стакан, содержащий 500 мл буфера предварительно охлажденные диализа (20 мм трис-HCl рН 7,4, 20% глицерина, 100 мм хлористый калий (KCl), 0,2 мм Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), 0,2 мм phenylmethylsulfonyl фторид (PMSF) и 0,5 мм DTT) и Инкубируйте 30 мин при температуре 4 ° C с мягким перемешиванием.
      Предупреждение: PMSF опасных. Избегайте прямого контакта с кожей или вдыхания.
    4. Сбор образцов от угла мини диализа устройств и передачи в новые трубы microcentrifuge 1,5 мл.
    5. Центрифуга на 12000 x g 10 мин при 4 ° C, аликвота 25 мкл каждого супернатант в 1,5 мл microcentrifuge трубку и хранить при температуре-80 ° C.

3. Оценка лечения гипоксии, обнаружение выражения протеина и внутриклеточных локализации HIF-1α

  1. Определите концентрацию белка всей ячейки или ядерных/цитоплазматических экстрактов, используя Гонав assay bicinchoninic кислоты (BCA) белка пробирного комплекта согласно инструкции производителя18.
  2. Разбавить lysates клетки в 1 буфер образца x Laemmli, содержащих 5% 2-меркаптоэтанол и варить при 95 ° C за 5 мин.
    Предостережение: Не прикасайтесь к поверхности Отопление блока, так как это может вызвать ожоги.
  3. Отделить белки, электрофорез геля полиакриламида сульфата натрия Додециловый (SDS-PAGE).
    1. Загрузите равных количеств белка (25 мкг) в каждую лунку градиента гелях SDS-PAGE сборный (4 – 20%), наряду с 3 мкл маркер молекулярного веса.
    2. Побегите гель в управлении буфер, содержащий 2,5 мм трис, 19.2 мм глицин, 0,01% SDS, PH8.3 на 30 мин в 200 V.
  4. Передать нитроцеллюлозные мембранные белки от геля.
    1. Соберите передачи сэндвич (Бумага фильтровальная бумага гель мембраны фильтр) с гелем на стороне анода и мембраны на стороне катода кассеты.
    2. Установите кассету в передачи бак заполнен буфер передачи, содержащий 2,5 мм trisaminomethane (Tris), 19.2 мм глицин и 20% метанола.
      Предупреждение: Метанол легковоспламеняющихся и должны храниться внутри Легковоспламеняющиеся жидкость хранения кабинета.
    3. Осуществлять передачи для 1 h 100 V в холодной комнате.
  5. Блокировать пятно в 10 мл блокирующий буфер, содержащий 50 мм трис-Cl (рН 7,6), 150 мм NaCl, 0.1 анимации 20 и 5% обезжиренное молоко за 1 ч при комнатной температуре на шейкер.
  6. Инкубировать блот с анти HIF-1α антитела (1/500 разрежения) в тот же блокирующий буфер на ночь при 4 ° C.
  7. Промойте пятно 3 раза за 5 мин каждый раз с 50 мл TBS-T.
  8. Инкубировать блот с пероксидазой хрена (ПХ)-конъюгированных вторичное антитело (1/1000 разрежения) в 10 мл TBS-T содержащие 5% обезжиренное сухое молоко, за 1 ч при комнатной температуре.
  9. Промойте пятно 3 раза за 5 мин каждый раз с 50 мл TBS-T.
  10. Смесь 500 мкл каждого расширения chemilumescent (ЭСЛ) реагента A и B в пробки microcentrifuge 1,5 мл и вихревой кратко.
  11. Применить ECL субстрата к пятно и инкубировать в течение 1 мин при комнатной температуре.
  12. Захват хемилюминесцентный сигналов с помощью зарядовой (связью ПЗС) системы на основе камеры.
    1. Слейте излишки ECL субстрата, прикоснувшись край мембраны с папиросной бумаги и мембраны в лист протектор.
    2. Поместите мембраны образца поддон CCD камеры-на основе изображений системы.
    3. Запуск программного обеспечения для обработки изображений (см. Таблицу материалы) и захвата изображения со следующими параметрами: файл → новый протокол → → на один канал протокола установки → гель изображений (приложение: Панджаб; Область изображения: Био-Rad готов лари; Imaging экспозиции: Программное обеспечение будет автоматически оптимизировать время экспозиции для интенсивных полос) → запустить протокол
      Примечание: Время экспозиции можно вручную задать для достижения оптимального изображения.

4. иммунопреципитации и обнаружение белков Immunoprecipitated

  1. Вымойте 50 мкл протеина A/G sepharose бусины в 500 мкл буфера TBS в 1,5 мл microcentrifuge трубы и Пелле бисер центрифугированием в 3000 x g на 2 мин при 4 ° C.
  2. Отменить супернатант и Ресуспензируйте бисер в 100 мкл буфера TBS.
  3. 2 мкл антител моноклональных анти ARNT мыши (1,4 мг/мл) или мыши иммуноглобулина G (IgG) (1,4 мг/мл), который был подготовлен воссоздания мыши IgG 0,7 мг в 500 мкл буфера TBS.
  4. Место 1,5 мл microcentrifuge пробирки, содержащие бусины в ротатор трубки и проинкубируйте втечение 2 ч 10 об/мин в холодной комнате.
    Примечание: Осторожно обрабатывать трубы и держать суспензии, содержащей бусины в нижней части трубки.
  5. Пелле бисер центрифугированием в 3000 x g на 2 мин при температуре 4 ° C и отбросить supernatants.
  6. Разбавьте 200 мкг ядерных белков lysate полученные в шаге 2.6.5 в 800 мкл буфера IP, состоящий из 50 мм трис-HCl (рН 7,4), 180 мм NaCl, 20% глицерина, ингибитор протеазы NP-40 и 1 x 0,2% коктейль. Инкубировать lysate антител в сочетании бисером, полученного на шаге 4.5 на ночь при 4 ° C.
  7. Пелле бисер центрифугированием в 3000 x g на 2 мин при температуре 4 ° C, отменить supernatants и мыть бисер 3 раза с 1 мл ледяной TBS, содержащие 0,2% NP-40.
  8. Отварите бусины в буфер образца Лэмли 50 мкл на 95 ° C за 5 мин.
  9. Центрифуга бусы на 10000 x g 5 минут при температуре 4 ° C, собирать супернатанта и отбросить бисер.
    Примечание: Супернатант может храниться при температуре 4 ° C на короткий срок или от-20 ° C в долгосрочной перспективе.
  10. Обнаружить присутствие HIF-1α от белковых комплексов immunoprecipitated, Западная помарка, как описано в шаге 3,3 года.
    Примечание: Белка количественной оценки не требуется для этого шага. Загрузить полный объем (50 мкл) в надосадке каждого образца в каждой скважине градиента гелях SDS-PAGE сборный (4 – 20%)

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Чтобы оценить клеточный ответ к гипоксии, выражение были рассмотрены уровни и внутриклеточных локализации компонентов комплексного лечения следующих гипоксии HIF-1. HEK293A клетки были культивировали в гипоксических условиях для 4 h или храниться в normoxia как элементы управления. HIF-1α и ARNT белка уровнях были рассмотрены в целом ячейке или ядерных/цитоплазматических извлекает западную помарку. Как ожидается, Общая HIF-1α уровни были upregulated, гипоксия, тогда как уровни ARNT в цело...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Комплекс HIF-1-главный регулятор клеточного кислорода гомеостаза и регулирует множество генов, участвующих в различных клеточных адаптационного реагирования к гипоксии. Определение Роман HIF-1 взаимодействуя протеины имеет важное значение для понимания гипоксических сигнала. Co Иммунопреципитация эксперименты обычно используются для исследования ИЦП для разграничения сотовой сигнальных путей. Однако гиперэкспрессия белка до сих пор широко используется, и это может привести к экспериментальных артефактов. Кроме того HIF-1...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют отсутствие конфликта интересов.

Благодарности

Мы благодарим доцент Sin Tiong Онг за использование рабочей станции гипоксии. Эта работа была поддержана следующее: Сингапур министерства образования, МО 1T1-02/04 и MOE2015-T2-2-087 (чтобы ю.а.), ли Конг Чиан школа медицины, Наньянг технологический университет начальный Грант M4230003 (P.O.B.), Шведский исследовательский совет, Фонд семьи Эрлинг Перссон, Фонд Ново Нордиск, Stichting аф Йокников фонд, Шведской ассоциацией диабета, страховая компания скандия, Диабет исследований и оздоровительный фонд, Фонд причала фон Канцов, Программа стратегических исследований в диабета на Каролинского института, ERC ERC-2013-AdG 338936-Betalmage и Фонд Рауля Валленберга Алиса и кнут.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Material
1,0 м Трис-HCl буфер, pH 7,4 1st BASE1415
Белок A/G Сефарозные шарикиAbcamab193262
Натуральный белок IgGAbcamab198772
EDTABio-Rad1610729
2x Laemmli Буфер для образцовBio-Rad1610737
2-меркаптоэтанолBio-Rad1610710
нитроцеллюлозой Мембрана    Bio-Rad1620112
блокатор блоттингаBio-Rad1706404обезжиренное сухое молоко для западных блоттинговых применений
10x Трис Буферизованный Солевой Раствор (TBS)Bio-Rad1706435
10% Твин 20Био-Рад1610781
10x Трис/Глицин/SDSBio-Rad1610732
10x Трис/Глицин Буфер Bio-RAD1610771
Precision Plus Protein Dual Color StandardsBio-RAD1610374
Anti-rabbit IgG, HRP-связанные антителаCell Signaling7074
Anti-mouse IgG, HRP-связанные антитела Клеточная сигнализация7076
Реагент SignalFire ECLКлеточная сигнализация6883
Фосфатно-солевой буфер ДульбеккоCorning21-030-CV
Фенилметилсульфонилфторид (PMSF)Merck Millipore52332
ARNT/HIF-1 бета-антитела Novus BiologicalsNB100-124 Концентрация: 1,4 мг/мл
HIF-1 alpha AntibodyNovus BiologicalsNB100-479Концентрация: 1,0 мг/мл
YY1 АнтителоNovus BiologicalsNBP1-46218Концентрация: 0,2 мг/мл
Qproteome Nuclear Protein KitQiagen37582Лизисный буфер NL и экстракционный буфер NX1 представлены в наборе
GAPDH AntibodySanta Cruzsc-47724Концентрация: 0,2 мг/мл
Глицерин (≥ 99%)SigmaG5516
Хлорид калияSigmaP9541
RIPA буферSigmaR0278
Хлорид натрия (NaCl)Sigma71376
NP-40Sigma127087-87-0
Dulbecco' s модифицированный Eagle' s среда (DMEM, 4,5 г/л глюкозы)Thermo Fisher Scientific11995065
Дитиотреитол (DTT)Thermo Fisher ScientificR0861
Фетальная бычья сывороткаThermo Fisher Scientific10270106
HEK293A клеточная линияThermo Fisher ScientificR70507
Метанол Thermo Fisher Scientific67-56-1
Пенициллин-стрептомицинThermo Fisher Scientific15140122
таблетки ингибитора протеазы для пирса Thermo Fisher Scientific88660
Набор для анализа белка BCA PierceThermo Fisher Scientific23225
QSP Наконечник для загрузки геля Thermo Fisher ScientificQSP#010-R204-Q-PK1-200 мкл
<сильно>оборудование/инструмент
толстая фильтровальная бумага, предварительно нарезанная, 7,5 x 10 смBio-Rad1703932
Mini-PROTEAN  Вертикальная электрофорезная ячейка Tetra для мини сборных гелей с мини-транс-блот  Модуль и базовый блок питания PowerPacBio-Rad1658034
4– 15% Mini-PROTEAN TGX Сборные протеиновые гелиBio-Rad4561083
система ChemiDoc XRS+Bio-Rad1708265
перчаткиBioSpherixI-Glove
Synergy HTX Многорежимный считыватель микропланшетов BioTekBTS1LFTA
Costar 5 мл Полоска Серологическая пипеткаCorning4487
Costar 10 мл Полоска Серологическая пипеткаCorning4488
Costar 25 мл Полоска Серологическая пипеткаCorning4251
Corning 96-луночная прозрачная нижняя черная полистирольная микропластинаCorning3631
15 мл Высокая Clarity PP конические центрифужные трубкиCorning352095
скребок с мелкими ячейкамиCorning3010
Gilson  Pipetman L 4 пипетки в комплекте GilsonF167370P2, P20, P200, P1000 и аксессуары
1,5 мл Полипропиленовые микроцентрифужные пробиркиGreiner Bio-One 
PIPETBOY ACU 2 ПипетторINTEGRA Biosciences155 000 
Шкафы для хранения легковоспламеняющихся жидкостей JustriteManufacturing Co.896000
Вихревой смесительLabnetS0200
CO2-инкубаторNuAireNU-5820
Орбитальные шейкерыStuartSSL1
Вращатель трубок SB3StuartSB3
MicroCL 21R МикроцентрифугаThermo Fisher Scientific75002470
Sorvall ST 16 ЦентрифугаThermo Чашки
(100 мм)Thermo Fisher Scientific150350
Slide-A-Lyzer MINI Устройство для диализаThermo Fisher Scientific6958010K MWCO, 0,1 мл
Поплавковые буи для 0,1 мл Slide-A-Lyzer MINI Устройства для диализаThermo FisherScientific 69588
LSE Цифровые обогреватели для сухих ваннThermo Fisher Scientific1168H25
Thermo Scientific  Шкафы биобезопасности серии 1300 A2 класса II, типа A2Thermo Fisher Scientific13-261-308
Software
Image Lab программное обеспечениеBio-Rad1709691
мыши 616201 для культуры тканей Fisher Scientific 75004240

Ссылки

  1. Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factors in physiology and medicine. Cell. 148 (3), 399-408 (2012).
  2. Bartels, K., Grenz, A., Eltzschig, H. K. Hypoxia and inflammation are two sides of the same coin. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (46), 18351-18352 (2013).
  3. Jiang, B. H., Rue, E., Wang, G. L., Roe, R., Semenza, G. L. Dimerization, DNA binding, and transactivation properties of hypoxia-inducible factor 1. J Biol Chem. 271 (30), 17771-17778 (1996).
  4. Semenza, G. L. HIF-1: mediator of physiological and pathophysiological responses to hypoxia. J Appl Physiol. 88 (4), 1474-1480 (2000).
  5. Kallio, P. J., et al. Signal transduction in hypoxic cells: Inducible nuclear translocation and recruitment of the CBP/p300 coactivator by the hypoxia-inducible factor-1alpha. EMBO J. 17 (22), 6573-6586 (1998).
  6. Ke, Q., Costa, M. Hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1). Mol Pharmacol. 70 (5), 1469-1480 (2006).
  7. Gustafsson, M. V., et al. Hypoxia requires notch signaling to maintain the undifferentiated cell state. Dev Cell. 9 (5), 617-628 (2005).
  8. Zheng, X., et al. Interaction with factor inhibiting HIF-1 defines an additional mode of cross-coupling between the Notch and hypoxia signaling pathways. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (9), 3368-3373 (2008).
  9. D'Ignazio, L., Bandarra, D., Rocha, S. NF-kappaB and HIF crosstalk in immune responses. FEBS J. 283 (3), 413-424 (2016).
  10. Wang, G. L., Jiang, B. H., Rue, E. A., Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factor 1 is a basic-helix-loop-helix-PAS heterodimer regulated by cellular O2 tension. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (12), 5510-5514 (1995).
  11. Zheng, X., et al. Cell-type-specific regulation of degradation of hypoxia-inducible factor 1 alpha: Role of subcellular compartmentalization. Mol Cell Biol. 26 (12), 4628-4641 (2006).
  12. Depping, R., et al. Nuclear translocation of hypoxia-inducible factors (HIFs): involvement of the classical importin alpha/beta pathway. Biochim Biophys Acta. 1783 (3), 394-404 (2008).
  13. Wei, H., et al. Hypoxia induces oncogene yes-associated protein 1 nuclear translocation to promote pancreatic ductal adenocarcinoma invasion via epithelial-mesenchymal transition. Tumour Biol. 39 (5), (2017).
  14. Chang, H. Y., et al. Hypoxia promotes nuclear translocation and transcriptional function in the oncogenic tyrosine kinase RON. Cancer Res. 74 (16), 4549-4562 (2014).
  15. Moriya, H. Quantitative nature of overexpression experiments. Mol Biol Cell. 26 (22), 3932-3939 (2015).
  16. Prelich, G. Gene overexpression: Uses, mechanisms, and interpretation. Genetics. 190 (3), 841-854 (2012).
  17. Zheng, X., et al. A Notch-independent mechanism contributes to the induction of Hes1 gene expression in response to hypoxia in P19 cells. Exp Cell Res. 358 (2), 129-139 (2017).
  18. Farris, M. H., Ford, K. A., Doyle, R. C. Qualitative and quantitative assays for detection and characterization of protein antimicrobials. J Vis Exp. (110), e53819(2016).
  19. Chilov, D., et al. Induction and nuclear translocation of hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1): heterodimerization with ARNT is not necessary for nuclear accumulation of HIF-1alpha. J Cell Sci. 112 (Pt 8), 1203-1212 (1999).
  20. Yin, S., et al. Arylsulfonamide KCN1 inhibits in vivo glioma growth and interferes with HIF signaling by disrupting HIF-1alpha interaction with cofactors p300/CBP. Clin Cancer Res. 18 (24), 6623-6633 (2012).
  21. Holmquist-Mengelbier, L., et al. Recruitment of HIF-1alpha and HIF-2alpha to common target genes is differentially regulated in neuroblastoma: HIF-2alpha promotes an aggressive phenotype. Cancer Cell. 10 (5), 413-423 (2006).
  22. Koh, M. Y., Powis, G. Passing the baton: The HIF switch. Trends Biochem Sci. 37 (9), 364-372 (2012).
  23. Dumetz, A. C., Snellinger-O'brien, A. M., Kaler, E. W., Lenhoff, A. M. Patterns of protein protein interactions in salt solutions and implications for protein crystallization. Protein Sci. 16 (9), 1867-1877 (2007).
  24. Graven, K. K., Troxler, R. F., Kornfeld, H., Panchenko, M. V., Farber, H. W. Regulation of endothelial cell glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase expression by hypoxia. J Biol Chem. 269 (39), 24446-24453 (1994).
  25. Caradec, J., et al. Desperate house genes': The dramatic example of hypoxia. Br J Cancer. 102 (6), 1037-1043 (2010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

HIF 1ARNTAG

Похожие статьи