Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

В естественных условиях Микродиализом метод для сбора крупных внеклеточных белков от мозга межклеточной жидкости с высокой молекулярный вес отсечения зонды

14.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/57869

⸱

26 сентября 2018 г.

1Department of Neuropathology, Graduate School of Medicine, University of Tokyo

В этой статье

Краткое содержание

В естественных условиях микродиализом позволило коллекции молекул присутствует в межклеточной жидкости мозга (ISF) от бодрствования, свободно поведение животных. Чтобы проанализировать относительно больших молекул в СВБ, текущей статьи специально посвящен микродиализом протокол, с помощью зондов с высокой молекулярной массой, отрезать мембраны.

Аннотация

В естественных условиях микродиализом является мощным средством для сбора ISF awake, свободно себя животных, основанную на принципе диализа. В то время как микродиализом является установленным методом, который меры относительно малых молекул, включая аминокислоты или нейротрансмиттеров, он был недавно использован также оценить динамику больших молекул в СВБ, с использованием зондов с высокой молекулярной массой, отрезать мембраны. При использовании таких зондов, микродиализом должен быть запущен в режиме push-pull чтобы избежать давления, накопленных внутри зондов. Эта статья содержит пошаговые протоколов, включая стереотаксической хирургии и как настроить микродиализом линии для сбора белки от ИФС. Во время микродиализом препараты могут администрироваться системно или путем прямого вливания в СВБ. Обратный микродиализом является методика сразу влить соединений в СВБ. Включение наркотиков в буфере перфузии микродиализом позволяет им диффундируют в СВБ через датчики одновременно собирая ИФС. Путем измерения тау-белка в качестве примера, автор показывает, как изменяются уровни его на стимулирование активности нейронов путем обратного микродиализом picrotoxin. Преимущества и ограничения микродиализом описаны наряду с расширенной приложений, объединяя другие методы в естественных условиях .

Введение

МСФ состоит из 15-20% от объема всего мозга и предлагает микроокружения важна для передачи сигнала, субстрат транспорта и отходов Распродажа1. Таким образом способность собирать ISF от живых животных будет предоставлять больше последствия для различных биологических процессов, а также механизм заболевания. В естественных условиях микродиализом является одним из немногих методов, что образец и количественно внеклеточного молекул из СВБ от бодрствования, свободно перемещающихся животных и тем самым служит полезным инструментом в неврологии исследований поле2,3. В этом методе, микродиализом зонды с полупроницаемой мембраны вставляются в головном мозге и увлажненную с буфером перфузии на сравнительно медленный поток (0.1-5 мкл/мин). Во время этой перфузии внеклеточная молекул в СВБ пассивно диффундируют в зонд по градиенту концентрации и собирать в диализате. Хотя эта статья фокусируется на метод выборки ISF в головном мозге, принцип и метод может применяться для других органов соответствующие изменения при необходимости.

Микродиализом был впервые применен в начале 1960-х и с тех пор то он был широко использован для сбора мелких молекул, включая аминокислоты или нейротрансмиттеров в мозге. Однако недавние коммерческой доступности микродиализом зондов с высокой молекулярной массой, отрезать мембраны (100 кДа-3 MDa) расширила его применение к сравнительно крупных белков в МФС также4,5,6 ,7. Исследования, используя эти зонды привела к поиску что белки как Тау или α-synuclein, которые давно считались исключительной цитоплазматических присутствуют также физиологически в СВБ4,5,8.

Одна из трудностей, с использованием зондов микродиализом с большими отрезать мембраны (обычно более 1000 кДа) является, что они более чувствительны к ультрафильтрации потери жидкости из-за внутреннего давления, накопленных в зондов. Микродиализом зонды, используемый здесь имеют уникальную структуру, чтобы избежать этой проблемы. Давление будет не создана из-за этой структуры, таким образом микродиализом с этих датчиков должны эксплуатироваться в режиме «push-pull» с помощью шприцевый насос для perfuse зонды (= push) и ролик/Перистальтический насос для сбора диализате приходить от розетки зонд (= по запросу) 9 (хотя он должен толкать и тянуть насосы, из-за давления, отмена вентиляционные отверстия в зонды, система технически только управляется тянуть насос). Эта статья начинается с Стереотаксическая операция имплантации канюля руководство и описывает, как настроить микродиализом линии для того, чтобы собирать ISF через микродиализом зонды с 1000 кДа отсечения мембраны.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все исследования на животных были рассмотрены и одобрены институциональный уход животных и использование Комитета от высшей школы медицины в университете Токио.

1. предварительно хирургическая процедура

  1. Перед началом операции, протрите все с 70% этанол поддерживать стерильные условия. Рекомендуется использовать тепловые поддержки с помощью грелку.
  2. Анестезировать мышей внутрибрюшинной инъекцией хлораль гидрат (400 мг/кг). Подтвердите анестезии, выполняя щепотку мыс. Рекомендуется использовать Мелоксикам SR на индукции и бупренорфина после восстановления ставку для по крайней мере 24 часа.
  3. Бритье волос с клипер хирургического. Исправьте мыши на мышь и новорожденных крыс адаптер с помощью баров ухо и нос зажим.
    Примечание: Очень важно, чтобы убедиться, что мышь голова крепится на данном этапе и не двигаться бок о бок.
  4. Примените мазь ветеринар на глаза, чтобы предотвратить сухость под наркозом.

2. Стереотаксическая операции по имплантации канюля руководство

  1. Установите мышь и новорожденных крыс адаптер на стереотаксического аппарата. Sagittally сделайте надрез на коже над черепа с помощью скальпеля.　Протрите крови и соединительной ткани на черепа с помощью влажным ватным тампоном.
  2. Определения координат для мозга региона интерес с помощью мозга Атлас. Перед началом измерений, убедитесь, что срединная прямо так что сверло может быть перемещены A-P и остаются на срединной шовный материал все время.
    Примечание: Эта статья использует координаты (A / P: -3,1 мм, M/L:-2,5 мм, D/V:-1,2 мм, 12 градусов) для задней гиппокампа.
  3. Уровней черепом A-P
    1. Прикрепите сверлом на манипулятор стереотаксической рамы. Опустите упражнение до тех пор, пока он осторожно трогает лямбда и записывать его вентральной координат. Повторите эту процедуру для bregma.
      Примечание: Когда череп выравнивается, вертикальное измерение bregma равен лямбда. Если нет, отрегулируйте высоту нос зажим соответственно. После того, как получает выровняли черепа, запишите передняя/задняя, боковая координат bregma.
  4. Уровней черепом слева направо
    1. Переместить дрель от bregma координаты (A / P: -3,1 мм, M/L: + 2.0 мм), Нижняя дрель с черепом и записывать вертикальная координата. Затем повторите эту процедуру для координаты (A / P: -3,1 мм, M/L:-2,0 мм).
      Примечание: Если выравнивается черепа, эти вертикальные измерения двух равноудаленных точек от средней линии равны. Если нет, то настроить высоту панели уха.
  5. Просверлите отверстие Берр тщательно на цели координации (A / P: -3,1 мм, M/L:-2,5 мм) имплантировать руководство канюли. Если диаметр отверстия заусенцев не достаточно большой, для имплантации канюля руководство, развернуть еще один отверстие, что совпадает с первым. Развернуть еще один отверстие на правой (контралатеральную сторону) теменной кости и вставьте костный винт, который помогает обеспечить стоматологического цемента в 1.10 (см. Рисунок 1B).
  6. Вырезать кусок круговой замок с обратной стороны крышки пластиковых пробирок 1.5 мл с лезвием бритвы и сделать '' Корона ''. Эта Корона используется для предотвращения распространения в коже стоматологического цемента. Поместите его на черепе, так что Берр отверстия в действии 2,5 остаться в пределах круга (см. Рисунок 1).
  7. Настроить сборку стереотаксического, поставив руководство канюля на короткие руки стереотаксического адаптер и закрепите его с помощью накидную гайку. Установите более руку стереотаксического адаптер на зажим электрода. Приложите его на манипуляторе стереотаксического аппарата (см. Рисунок 1A).
  8. Вращайте D-V stereotax Ассамблеи на манипулятора на 12 градусов (см. Рисунок 1B). Переместите руководство канюля Берр отверстия, сделанные в 1.6. Медленно Вставьте канюлю руководство в мозг, опустив ее в 1,2 мм.
    Примечание: Угол зонд для гиппокампа; другие регионы могут потребовать другие углы или не угол на всех. Консультироваться мозга Атлас для точных координат. Сухие поверхности черепа, потому что если не будет придерживаться не цемента и цемента колпачок может стать выбили
  9. Добавьте стоматологического цемента в головку, чтобы полностью покрыть металлической части руководство канюлю и костный винт достаточно, чтобы защитить их. Применить дополнительные стоматологического цемента, если есть часть черепа подвергаются.
  10. Подождите до тех пор, пока полностью высох стоматологического цемента (~ 12-20 мин). Удалите адаптер стереотаксического из зажим электрода. Снимите колпачковую гайку и заменить стереотаксического адаптер с зондом Макетные и затяните колпачковую гайку.
  11. Отпустите кнопку мыши от стереотаксического аппарата и домовая мышь только в индивидуальной клетке.
    Примечание: Мышь не следует оставлять без присмотра до тех пор, пока он сознание достаточно для поддержания грудной recumbency. Проверьте мышь ежедневно до дня микродиализом. Мышь получает НПВП как carprofen если она, как представляется, в боли. Ждать 2 недели необходим для исследования сна бодрствования так мыши habituates в новой среде10, но другие виды исследований могут потребовать более короткие периоды восстановления (например, 1-2 дня).

3. микродиализом установки

  1. Проверка качества зондов: заполнить одноразовые 1 мл шприца с дистиллированной waterand подключить его к розетке (короче порт) зонд, с помощью byton трубки. Обложка вентиляционные отверстия с пальцами и отпустите поршень шприца осторожно, чтобы наполнить водой зонд. Убедитесь, что вода появляется от зонда входе и нет никаких утечек на поверхности мембраны микродиализом.
    1. Активация зондов: погружать мембраны датчика в этаноле (70-100%) на две секунды. Затем влить дистиллированной воды в зонд снова с помощью шприца снова.
  2. Подготовка перфузии буфера: избежание сцепления молекул-мишеней для трубопроводов, добавьте BSA путем разбавления раствора БСА 30% до 4% с искусственным CSF (1,3 мм CaCl2, 1,2 мм MgSO4, 3 мм KCl, 0,4 мм х2PO4, 25 мм NaHCO3 , 122-мм NaCl, рН = 7.35), который близко соответствует концентрации электролита в спинномозговой жидкости, непосредственно перед использованием. Фильтр перфузии буфера через шприц фильтр с размером пор 0,1 мкм.
    Примечание: 4% BSA улучшает восстановление для наклеивания белков, но может серьезно ограничить доставку соединений, особенно для соединений, которые имеют высокие BSA-привязки. Это одно из преимуществ использования низкой концентрации BSA (например 0,15%) в некоторых случаях3. Обратите внимание, что BSA можно очень легко агрегировать когда взволнованный вихря или перемешать пластиной. Эти агрегаты могут засорить поры мембраны или зондов. Соблюдайте осторожность при подготовке BSA решение ограничить этот агрегат
  3. Подготовить две отдельные линии на входе и выходе (см. рис. 1 c) и соединить обе линии с иглой соединения. Заполнить одноразовые 3 мл шприц, заполнены с буфером перфузии и подключить его с конца впускного трубопровода с помощью туп конца иглы. Заполните всю труб с буфером перфузии, запустив шприцевой насос.
  4. Остановить шприцевый насос и замените иглу связи между магистрали на входе и выходе линии и активированного микродиализом зонд из шага 3.3 (см. рис. 1 c). Перед этой замены Положите накидную гайку на зонд.
  5. Смонтируйте ролик трубку в выходе трубопровода на Роликовый насос. Запустите шприцевый насос в 10 мкл/мин и затем Роликовый насос на несколько медленнее скорость потока (9,5-9,8 мкл/мин). Убедитесь в том удалить все пузырьки воздуха всей трубы, которые могут повлиять восстановление, когда они войти зонд.
  6. Анестезировать мышь от шага 1.12 таким же образом, как в шаге 1.2. Поместите мышь воротник вокруг его шеи. Снимите колпачковую гайку и Макетные зонд и медленно вставьте микродиализом зонд из 3.4 через канюлю руководство и затяните колпачковую гайку.
  7. Место мыши в клетке подключен к свободной перемещение системы и троса мышь с воротником. Держите работает шприцевый насос и Роликовый насос темпами указанного потока в шаге 3.5 для по крайней мере 1 час.
    Примечание: Для достижения ISF коллекции от бодрствования животных, эта статья использует систему-перемещение, где сама клетка реагирует животного движения держать трубки от скручивания. Кроме того Жидкие вертлюги доступны из различных компаний могут использоваться.
  8. Валик насоса сначала остановить, а затем шприцевой насос. Установите требуемый расход. Запустите насос 20% быстрее, чем Роликовый насос шприц.
    Примечание: К примеру, если вы работаете в 1 мкл/мин, работают шприцевый насос на 1.2 мкл/мин скорость оптимального потока должны определяться опытным путем для каждой молекулы.
  9. Сбор образцов ISF: место свободный конец трубки розетки на сборщике охлажденных дроби.
    Примечание: Объем соответствующего образца варьируется в зависимости от анализов, используемых для анализа.
  10. После завершения этого эксперимента удалите зонд. (Анестезировать мыши при необходимости).  Обработайте восстановления мыши так же, как шаг 2.11. Анализ собранных ИФС методами ВЭЖХ или ELISA.
  11. Мыть весь трубопровод после микродиализом, подключите входе и выходе трубопроводов снова, заменив зонд с подключением иглы и запустить слабым раствором хлорки всей трубы и затем промойте его водой. Сухие и сохранить его для повторного использования.
    Примечание: Другие виды трубопроводов являются приемлемыми, однако, BSA в перфузии буфера может засорить трубы малого диаметра, таким образом эти трубки считаются одноразового использования. Трубы могут быть изношены или забиты после многократного использования, поэтому убедитесь, что скорость потока последовательно каждый раз перед использованием.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Для стимулирования или подавляют активность нейронов в обратном микродиализом11,12,13, picrotoxin, антагонист рецепторов ГАМКA или Тетродотоксин, были использованы блокатор канала Na+ . Было показано, что релиз Тау стимулируется увеличением активности нейронов13,14. В соответствии с этими предыдущие замечания, когда ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Микродиализом с высокой молекулярной массой, отрезать мембраны должна управляться режим push-pull, таким образом очень важно, что скорость потока является точной и постоянной. Неточность в скорости потока может быть причиной воздушного пузыря поколения и непоследовательность в концентрации образца. Если поток является несовместимым, проверьте все соединения на герметичность. Если проблема сохраняется, может потребоваться повторно начать с новых датчиков и трубопроводов.

Microdilaysis зонды неп...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Автор не имеет ничего, чтобы раскрыть.

Благодарности

Эта работа была поддержана '' целевые субсидии для проведения научных исследований в инновационных областях (старение мозга белка и деменция Control)(15H01552) от МПКСНТ и субсидий для молодых ученых (B) (16K 20969). Автор благодарит д-р Дэвид м. Хольцмана и д-р Джон р. Cirrito за технические советы в ходе разработки этого метода.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Univentor 820 МикропробоотборникUniventor8303002Охлаждаемый коллектор фракций
Шприцевой насосKD ScientificKDS-101
Роликовый насосEicom микродиализERP-10
Raturn Автономная системаBASiMD-1409Свободно движущаяся система
Комплект для двух видов клетокBASiCX-1600
Микродиализный зонд AtmosLM (длина стержня 8 мм, длина мембраны 2 мм)Микродиализный зондPEP-8-02Длина стержня для зонда, направляющего, думного зонда и стереотаксического адаптера должна быть идентичной.
Проводник для микродиализа (длина стержня 8 мм)МикродиализныйPEG-8
для микродиализа Eicom (длина стержня 8 мм)МикродиализныйEicom PED-8
BASiMD-1310
Super bond C& B комплектSunmedicalDental Cement
Stereotaxic Instrument для мелких животных с цифровым дисплеем КонсольKopfModel 940Стереотаксический аппарат
Адаптер для мыши и неонатальной крысыStoelting51625
Стандартные ушные планки и резиновые наконечники для мыши StereotaxicStoelting51648
Раствор альбумина из бычьей сывороткиSigmaA7284-50ML30% раствор BSA
трубка FEP (70 см)Eicom микродиализJF-10-70Внутренний объем = 0,5 &; Л/см
Тефлоновая трубка (50 см)Eicom микродиализJT-10-50Внутренний объем = 0,08 &; Л/см
ТрубкаByton Eicom микродиализJB-30
Intramedic luer stab адаптер 23GBD427565Игла с тупым концом
Роликовая трубкаEicom микродиализRT-5SВнутренний объем = 4 & микро;
L Колпачковая гайкаEicom микродиализAC-5
0,25 мл микроцентрифужная пробирка с колпачкомQSP503-QТрубки для сборщика фракций
Sterotaxic адаптер (длина вала 8 мм)Eicom микродиализPESG-8
Соединительная иглаEicom микродиализRTJ
Ошейник для мышиного животногоBASiMD-1365
Высокоскоростной роторный микромоторFOREDOMK.1070Дрель
ПикротоксинSigmaP1675
Отвертка для шурупов для костных шурупов
Скальпель
Ватный тампон
Хирургическая машинка для стрижки
щуп винт

Ссылки

  1. Lei, Y., Han, H., Yuan, F., Javeed, A., Zhao, Y. The brain interstitial system: Anatomy, modeling, in vivo measurement, and applications. Progress in Neurobiology. 157, 230-246 (2017).
  2. Kushikata, T., Hirota, K. Neuropeptide microdialysis in free-moving animals. Methods in Molecular Biology. 789, 261-269 (2011).
  3. Cirrito, J. R., et al. In vivo assessment of brain interstitial fluid with microdialysis reveals plaque-associated changes in amyloid-beta metabolism and half-life. The Journal of Neuroscience. 23 (26), 8844-8853 (2003).
  4. Emmanouilidou, E., et al. Assessment of α-synuclein secretion in mouse and human brain parenchyma. PLoS One. 6 (7), 1-9 (2011).
  5. Yamada, K., et al. In vivo microdialysis reveals age-dependent decrease of brain interstitial fluid tau levels in P301S human tau transgenic mice. The Journal of Neuroscience. 31 (37), 13110-13117 (2011).
  6. Ulrich, J. D., et al. In vivo measurement of apolipoprotein E from the brain interstitial fluid using microdialysis. Molecular Neurodegeneration. 8 (1), 13(2013).
  7. Emmanouilidou, E., et al. GABA transmission via ATP-dependent K+ channels regulates α-synuclein secretion in mouse striatum. Brain. 139 (3), 871-890 (2016).
  8. Takeda, S., et al. Seed-competent high-molecular-weight tau species accumulates in the cerebrospinal fluid of Alzheimer's disease mouse model and human patients. Annals of Neurology. 80 (3), 355-367 (2016).
  9. Yamada, K. In vivo Microdialysis of brain interstitial fluid for the determination of extracellular tau levels. Methods in Molecular Biology. 1523, 285-296 (2017).
  10. Kang, J. -E., et al. Amyloid-β dynamics are regulated by orexin and the sleep-wake cycle. Science. 326 (November), 1005-1008 (2009).
  11. Cirrito, J. R., et al. Synaptic activity regulates interstitial fluid amyloid-beta levels in vivo. Neuron. 48 (6), 913-922 (2005).
  12. Bero, A. W., et al. Neuronal activity regulates the regional vulnerability to amyloid-β deposition. Nature Neuroscience. 14 (6), 750-756 (2011).
  13. Yamada, K., et al. Neuronal activity regulates extracellular tau in vivo. Journal of Experimental Medicine. 211 (3), 387-393 (2014).
  14. Pooler, A. M., Phillips, E. C., Lau, D. H. W., Noble, W., Hanger, D. P. Physiological release of endogenous tau is stimulated by neuronal activity. EMBO Reports. 14 (4), 389-394 (2013).
  15. Castellano, J. M., et al. Human apoE isoforms differentially regulate brain amyloid-β peptide clearance. Science Translational Medicine. 3 (89), 89ra57(2011).
  16. Yamada, K., et al. Analysis of in vivo turnover of tau in a mouse model of tauopathy. Molecular Neurodegeneration. 10 (1), 55(2015).
  17. Taylor, H., et al. Investigating local and long-range neuronal network dynamics by simultaneous optogenetics, reverse microdialysis and silicon probe recordings in vivo. Journal of Neuroscience Methods. 235, 83-91 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Режим push-pullстереотаксическая операцияанализ тау-белкаобратный микродиализинфузия пикротоксинарегистрация ЭЭГоптогенетика
В естественных условиях Микродиализом метод для сбора крупных внеклеточных белков от мозга межклеточной жидкости с высокой молекулярный вес отсечения зонды
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.