Количественный анализ альтернативных пре мРНК сплайсинга в разделах мозга мыши, с помощью РНК в Situ гибридизация Assay

Xuan Guo; Yiqing Zhao; Hieu Nguyen; Tonghua Liu; Zhenghe Wang; Hua Lou

doi:10.3791/57889

Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Количественный анализ альтернативных пре мРНК сплайсинга в разделах мозга мыши, с помощью РНК в Situ гибридизация Assay

8.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/57889

⸱

26 августа 2018 г.

Xuan Guo¹^,² , Yiqing Zhao¹^,³ , Hieu Nguyen¹ , Tonghua Liu² , Zhenghe Wang¹^,³ , Hua Lou¹^,³^,⁴

¹Department of Genetics and Genome Sciences, Case Western Reserve University, ²Department of Endocrinology, Dongfang Hospital of Beijing University of Chinese Medicine, ³Case Comprehensive Cancer Center, Case Western Reserve University, ⁴Center for RNA Science and Therapeutics, Case Western Reserve University

В этой статье

Краткое содержание

Описан в situ гибридизация (ISH) протокол, использующий короткий антисмысловых олигонуклеотидов для выявления альтернативных пре мРНК сплайсинга модели в разделах мозга мыши.

Аннотация

Альтернативного сплайсинга (AS) происходит в более чем 90% генов человека. Выражения в качестве альтернативы сращивания экзона часто регулируется в моде определенного типа клеток. КАК выражение, что шаблоны обычно анализируются RT-PCR и РНК seq с использованием образцов РНК изолированы от популяция клеток. В situ экспертиза как выражение шаблоны для определенной биологической структуры может осуществляться путем РНК в situ гибридизация (ISH) с помощью конкретных Эксон зондов. Однако этого конкретного использования иш был ограниченным, поскольку альтернативные экзонов, как правило, слишком короткий для разработки конкретных Эксон зонды. В настоящем докладе использование BaseScope, недавно разработанная технология, которая использует короткие антисмысловых олигонуклеотидов в РНК-иш, описанных для анализа как выражение шаблоны в разделах мозга мыши. Экзона 23a нейрофиброматоз типа 1 (Nf1) используется в качестве примера для иллюстрации, что короткие Экзон экзона Джанкшен зонды exhibit надежные гибридизации сигналы с высокой точностью в РНК ISH анализа на участках мозга мыши. Что еще более важно сигналы обнаружены датчиками включения и пропуск конкретных Эксон может использоваться надежно рассчитать процент сращивания в значениях Nf1 экзона 23a выражения в различных анатомических областях мозга мыши. Экспериментальный протокол и метод расчета для анализа представлены. Результаты показывают, что BaseScope предоставляет новый мощный инструмент для оценки в качестве выражений шаблонов в situ.

Введение

Альтернативного сплайсинга (AS)-это общий процесс, который происходит во время созревания пре мРНК. В этом процессе экзона дифференциально могут быть включены в зрелой мРНК. Таким образом через AS, один ген может генерировать много мРНК код для различных белковых продуктов. Предполагается, что 92 – 94% генов человека проходят альтернативного сплайсинга¹^,². Аномальные альтернативного сплайсинга шаблоны в результате генетических мутаций были связаны с большое количество заболеваний, в том числе боковой амиотрофический склероз, Миотоническая Дистрофия и рак³^,^4<....