Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Серьезный ожог в свином модели для оценки клинических Туалетная

9.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/57942

⸱

6 ноября 2018 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Graduate Institute of Medical Sciences, National Defense Medical Center, 2Department and Graduate Institute of Biology and Anatomy, National Defense Medical Center, 3Department of Gerontological Health Care, National Taipei University of Nursing and Health Sciences, 4Division of Rheumatology/Immunology/Allergy, Department of Internal Medicine, Tri-Service General Hospital, National Defense Medical Center, 5Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Tri-Service General Hospital, 6Department of Nursing, Yuanpei University, 7Department of Physiology and Biophysics; Graduate Institute of Physiology, National Defense Medical Center, 8Division of Urology, Department of Surgery, Tri-Service General Hospital, National Defense Medical Center

В этой статье

Краткое содержание

Для тесно имитировать режим ожогов требует взаимодействия клинического наблюдения и исследования на животных моделях. В этом исследовании свиной модель серьезный ожог был создан для оценки экспериментальных одеваться в физиологических и патофизиологические параметры.

Аннотация

Заживление процесс динамического ремонта и наиболее сложный биологический процесс в жизни человека. В ответ на записать травмы изменения в биологических путей ослабить воспаление ответ, что приводит к замедленного заживления ран. Нарушение заживления ран часто возникает у пациентов с сахарным диабетом, ведущих к неблагоприятные исходы, такие как ампутации. Следовательно перевязочные материалы, имеющие положительный эффект в продвижении сжечь рану ремонта необходимы. Однако исследования на рану лечения ожогов ограничены из-за отсутствия надлежащего животных моделей. Наши предыдущие исследования продемонстрировали ранозаживляющим производительности в крыса и свиной моделей с использованием минимально инвазивной хирургической техники. Это исследование призвана продемонстрировать свиной модель серьезный ожог, который устраняет спад раневой и более тесно приближается человека процессы формирования новых тканей и эпителизация. Этот протокол предоставляет подробные процедуры для создания последовательного ожоговых ран и изучения ранозаживляющим производительности при лечении экспериментальной Туалетная в модели свиней. Шесть ожоговых ран создавались симметрично на тыльной поверхности, которые были покрыты клинических соус состоит из четырех слоев: внутренний слой контактной экспериментальных материалов, внутренний промежуточный слой водонепроницаемой пленки, внешний промежуточного слоя Марли, и наружный слой лейкопластырь. После завершения экспериментов были рассмотрены закрытия РАН, раневой области и оценка масштаба Ванкувер шрам. Образцы кожи, резецируется от каждого животного после жертвоприношения гистологически были подготовлены и витражи, с использованием гематоксилином и эозином. Была рассмотрена также антибактериальная активность каждого Туалетная в контексте заживление ран. Применения клинических повязки на раны, в свином модель имитирует биологические процессы человека ранозаживляющее отношении процессы эпителизации, пролиферации и ангиогенеза. Таким образом эта модель свиной предоставляет метод легко учиться, экономически эффективные и надежные оценить эффект клинической подкормок в серьезный ожог.

Введение

Ожог инициирует воспалительного процесса и индуцирует комплекс патологических эффектов, которые влияют многочисленные тела функции сразу же после аварии, что приводит к негативное воздействие на качество жизни пациентов. Нарушение заживления ран вызывает значительные заболеваемости и смертности среди больных с сахарным диабетом1,2. Большинство пациентов с ожоговыми травмами испытывать боль во время сжечь рану хирургическая, который известен как процесс мучительной несмотря на использование мощных опиоидных анальгетиков3.

В отличие от других млекопитающих свиньи поделиться несколько анатомические и физиологические характеристики с людей относительно процесса эпителизации, пролиферации и ангиогенез. Это делает свиного потенциально лучшей моделью для некоторых процедур и исследований, и они часто используются в последующих исследованиях, которые показали многообещающие результаты в мышей. Эти особенности привели к более широкое использование свиней как основных видов в доклинических испытаний. Недавно наблюдается быстрый рост в биомедицинских исследований с уважением к сердечно-сосудистой, мочеполовой, Покровная и пищеварительной систем4,5,6. Это исследование призвана продемонстрировать свиной модель серьезный ожог, что устраняет сужение раны и обеспечивает подобие человека рану процессы заживления и формирования новой ткани. Шесть ожоговых ран были созданы симметрично на спинке, три на каждой стороне позвоночника свиней. Далее anexperimental Туалетная был рассмотрен в свином модель серьезный ожог, который может быть адаптирован для репликации человеческих заживление ран (рис. 1). Раны были покрыты клинических соус, который состоит из четырех слоев: внутренний контактный слой экспериментальных материалов, внутренний промежуточный слой водонепроницаемой пленки, внешний промежуточным слоем марли и наружный слой лейкопластырь. Гидроизоляционные пленки держит рану среды влажным при бактериальной инфекции и позволяя газов пронизывают повязки. Промежуточный слой Марли был применен на фильмы, водонепроницаемый и обеспеченные наружный слой лейкопластырь. После завершения экспериментов были рассмотрены закрытия РАН, раневой области и оценка масштаба шрам Ванкувер (VSS). Образцы кожи, резецируется от каждого животного после жертвоприношения гистологически были подготовлены и витражи с помощью гематоксилином и эозином (он) окрашивания. В этой модели была рассмотрена также антибактериальная активность каждого Туалетная в контексте заживление ран. Наши предыдущие исследования показал заживление производительность в крыса и свиной модели с использованием минимально инвазивной хирургической техники7. Поскольку существует шесть сжечь раны на тыльной поверхности в пределах каждой свиньи, каждой экспериментальной Туалетная был испытаны и оценены во всех позициях, чтобы свести к минимуму предвзятость, относящиеся к раневой процесс заживления в разных точках на спинке свиней. Таким образом обеспечивает новый подход для оценки клинических повязки и способствует развитию Роман лечения ожога свиной модель серьезный ожог, в настоящем исследовании. Это исследование обеспечивает ключевыми инструментами раскрыть патофизиологии заживление ожога.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Процедуры с участием животных субъектов были утверждены Комитетом по уход животных на национальной обороны медицинский центр, Тайвань (R.O.C). Это исследование было проведено в лабораторных животных центр в медицинском центре национальной обороны. Свиней весом от 20 до 25 кг был успешно инструментированный используя этот протокол.

1. Адаптация животных для человека обработки

  1. После прибытия в объекте дом животные в одиночку, но пусть они взаимодействуют друг с другом.
  2. Обеспечивают животных ad libitum доступ к продовольствию и воде.
  3. Акклиматизироваться свиной человека обработки и транспортировки из животных фонда для экспериментальной лаборатории путем обработки животных по крайней мере один раз в день в течение одной недели.
  4. Быстрая животное для по крайней мере за 12 часов до операции для предотвращения тошноты, рвоты и стремление желудка жидкостей.

2. седации

  1. Перед созданием ожоговой раны седативное животных через внутривенные инъекции с Zoletil 50 (25 мг/кг).

3. интубация и вентиляции

  1. Поместите животное на таблице или тележки в грудины позицию.
  2. Откройте рот животного с устной разбрасывателя.
  3. В случае недостаточного отдыха челюсти или присутствие глотания рефлексы, которые препятствуют интубации, маска свиней с изофлюрановая побудить седативный эффект.
  4. Контролировать артериальное давление, пульс и температура тела монитором физиологических сигналов во время операции для предотвращения возможных осложнений.

4. анестезия

  1. Стимулировать и поддерживать анестезии; предпочтительно анестезировать животных через внутримышечной инъекции tiletamine и zolazepam (25 мг / кг + 25 мг / кг).
  2. Интубировать животное с эндотрахеальной трубки, когда вызревают расслабление мышц, характеризуется потерей тонуса челюсти и глазной, было отмечено.
  3. Сохранить все свиньи в состоянии анестезии при настройке испарителем 0,5 – 2,5% (v/v) изофлюрановая до конца операции.
  4. Изучите глубины анестезии, тестирование рефлексы боль с щепоткой ног задних ног до операции. При необходимости добавьте дополнительные анестезии или подождите несколько минут. Проверьте боль рефлексы регулярно в течение операции.

5. Стерилизация хирургического сайта

  1. Бритье и протереть кожу животного над площадью примерно 25 см шириной от позвоночника к подмышечной впадине на обеих сторонах.
  2. Скраб увлажненной коже скрабом повидон йод (75 мг/мл) для примерно 5 мин.
  3. Удаление повидон йод мыло из кожи с помощью влажной стерильной сетки.
  4. Стерилизуйте кожу лосьон повидон йод (100 мг/мл).
  5. Обложка животное с стерильные хирургические шторы для снижения бактериального передачи и последующего загрязнения хирургической сайта.

6. записать создание раны

  1. Используйте хирургические маркером для обозначения в центре шести ожоговых ран симметрично на спинку свиньи. Убедитесь, что расстояние между каждой записи раны по крайней мере больше, чем радиус раны (рис. 1A).
  2. Заполните модифицированных паяльник с 50 мл глицерина и вставьте его для мониторинга температуры электронный термометр. Горячий Утюг обладает плоской области около 9 см2 (рис. 1B).
  3. Тепла железа до 137 — 139 ° C с плитой (рис. 1 c).
  4. Создание шести единообразных ожоговых ран, поставив Утюг на выделенной области без применения каких-либо сил на 30 секунд (рис. 1 c).
  5. Вымойте ожоговых ран с 0,9% физиологического раствора (рис. 1 d).
  6. Измерение размеров раны и записать рану микрофотография (Рисунок 1E).

7. Подготовка повязки

  1. Обложка каждого раны с внутренней контактного слоя четырехслойные клинических Туалетная через непосредственный контакт. Для этого слоя используйте CAPS-содержащих Туалетная или альтернативных материалов (Рисунок 1F).
  2. Примените гидроизоляционные пленки на клинических Туалетная служить барьер против проникновения бактерий (Рисунок 1F).
  3. Обложка каждого раны с марлей (толщиной 0,5 см) и исправить с бумажной ленты в качестве среднего слоя Туалетная (рис. 1 g).
  4. Закрепите марлю с наружный слой лейкопластырь. Продлить этот слой для туловища, чтобы избежать перемещения повязки (рис. 1 H-1J).

8. после гореть, уход и измерения

  1. Придать свиней с бупренорфин (0,1 мг/кг, IM) для управления боли за каждые 8-12 ч, начиная до восстановления от наркоза, на одну неделю для уменьшения потенциальных боли.
  2. Разрешить свободный доступ свиньи кормить и поить.
  3. Изменить клинических перевязки каждые 2 дня для первых 10 дней, а затем изучить два раза в неделю в течение 6-недельный.
  4. Чистота и измерить раны до повторного применения клинических повязки. Администрировать анестезии во время Туалетная изменения.
  5. Записать рану Микрофотография для сравнения заживления раны ставки каждые 2 дня для первых 10 дней, а затем изучить два раза в неделю в течение 6-недельный.
  6. Вычислить эпителизация раневой или сокращение как процент от исходного размера раны согласно ранее описанных метод. Таким образом, двойное слепое был проведен анализ закрытия раны.
  7. Измерения с помощью VSS, которая состоит из четырех переменных шрам ожога: кровоснабжения, высота (толщина), уступчивость и пигментации на дни после ожога 0, 7, 21 и 42. Каждая переменная имеет четырех до шести возможных баллов. Общая оценка колеблется от 0 до 14, согласно которой отражает счетом 0 нормальной кожи.

9. бактериальный рост эксперименты после ожогов тканей

  1. Тампоном рану для антибактериальной тестирования на дни после ожога 0, 7, 21 и 42.
  2. Поместите тампон в 100 мл 0,9% стерильный физиологический раствор и аккуратно Вортекс для достижения однородной подвеска.
  3. Серийно разбавлять (10−1– 10−5) огневки и тарелка 100 мкл каждого разведения в селективной и неселективных СМИ, соответственно.
  4. Инкубируйте все разведений в аэробных условиях при 37 ° C 24-72 часов.
  5. Пластина тройные аликвоты 10 мкл от всех разведениях на крови агар пластину с 5% овец крови изолировать аэробных грамположительных организмов.
  6. Инкубировать образец путем распространения или заливки образца равномерно на поверхности агара пластины на ночь для определения числа образующих колонии единиц (CFUs).
  7. Читайте пластины после ночи инкубации. Инвертировать плита агара крови овец и делят дно тарелки на четыре равных квадрантах, используя маркер и малых правителя.
  8. Место пластину на стадии микроскопом диссекции и подсчета колоний на каждой табличке. По определению колонии должен иметь как минимум 300 кое для перечисления.
  9. Граф бактериальных колоний в каждом из трех реплицирует. Вычислить среднее значение трех реплицирует. Определите кое на пластину, умножив среднее значение коэффициента окончательного растворения.

10. эвтаназии и фиксация ткани

  1. Внутривенно вводить передозировки раствора Натрий Пентобарбитал эвтаназии (80-120 мг/кг).
  2. Комплектно выполняют иссечение сжечь ткани раны включить основной мускулатуры и окружающие разматывать ткани.
  3. Исправьте тканей с нейтральным буферизации формалина 10%.
    1. Смешайте 10 мл формальдегида (37%) в 90 мл раствора фосфатного буфера (PBS) и хранить в 4 ° C.
    2. Передача тканей фиксатором и вихрем контейнер, чтобы убедиться, что все ткани полностью погружен в фиксатором. Объем фиксатор должен быть 30 раз превышает объем тканей.
    3. Исправьте тканей на ночь при 4 ° c.
  4. Обезвоживания тканей с этанолом и вставлять парафиновые блоки. Выполните следующие действия на 4 ° c на шейкер.
    1. Мыть дважды с PBS на 30 минут.
    2. Обезвоживает тканей с 70% этанола за 8 часов, 80% этанола на ночь, этанол 95% за 8 часов, а затем в 100% этанола на ночь.
    3. Инкубируйте тканей в 100% этанола еще 8 часов.
    4. Инкубируйте тканей в три изменения ксилол каждый 30 минут.
    5. Заменить ксилол воском свежий расплавленный (52 ° C) и Инкубируйте на 52 ° C в духовку на 1 час.
    6. Замените свежий воск воск и Инкубируйте на 52 ° C в духовке 3 часа и затем заменить еще раз и Инкубируйте на 52 ° C на ночь.
    7. Инкубируйте тканей с двумя больше изменений воска каждый 1 час, а затем внедрить ткани и хранить при 4 ° C.
  5. Вырезать и выведение парафин врезанных секции с он и визуализировать через световой микроскоп с 100× увеличения.
    1. Создайте разделы парафина, используя микротом роторный.
    2. DEWAX секции с тремя изменениями ксилол каждый на 3 минуты.
    3. Увлажняет тканей с 100%, 95%, 80% и 70% этанола на 3 минуты, а затем погрузить в дистиллированной воде.
    4. Пятно с применением окрасок гематоксилин на 10 минут, а затем промыть в проточной водой.
    5. Дифференцировать с 0.1% соляной кислоты этанола на 5 минут и промыть в водопроводной воде.
    6. Пятно с 0,5% эозина за 1 минуту.
    7. Обезвоживания тканей с 70%, 80%, 95% и 100% этанола за 2 минуты.
    8. Очистить, окраски с ксилол и сухой в зонта.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Сжечь продолжительностью 30 секунд горячим утюгом в результате раны, которые были круглые с четкой разницы и равномерно бледно с оправой, эритемы (рис. 1 d). В рамках каждого животного насчитывалось шесть ожоговых ран на спинку. Расположение ожоговых ран была изображена на рисунке 1 K. Ожоговых ран были полностью покрыты ШАПКИ содержащих Туалетная и используется для оценки глубины рубцов на дни после ожога 0, 7, 21 и 42 и эпители...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Настоящее исследование создана модель свиной серьезный ожог и рассмотрены модели с помощью ШАПКИ содержащих заправкой. Наши результаты показывают, что эта модель свиней может использоваться для мониторинга клинических характеристик экспериментальной перевязочные материалы, в том числе антибактериальные свойства. Заживления ран ставка, закрытие раны и антибактериальную активность также были проанализированы с помощью VSS, H & E окрашивание и антибактериальное действие теста. Использование животных сжечь моделей была разра...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Это исследование было поддержано грант от Tri-служба больницы; Медицинский центр национальной обороны, Тайвань (TSGH-C107-042); Министерство науки и технологии, Тайвань (большинство 106-2314-B-016-014); и национальной обороны медицинский центр (МАБ-106-055; MAB-106-010; MAB-107-064).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<сильный>седативный эффект:
кетаминMerial2528 ESP10 мл флакон
АзаперонКитай химический и фармацевтический47W406100 мл флакон
Атропин Восточная химическая работаIN120802флакон 1 мл
<сильный>Анестетик:
Тилетамин+ЗолазепамVirbacBC915 мл флакон
ИзофлуранБакстераN002A225100 мл флакон 100 мл
><Хирургия:
Машинка для стрижки волосMoser--
Повидон йодный скрабраствор Ever starHA1612024 л бочка
Модифицированное железо---0,9
% физиологический растворCHI SHENGKC130500 мл флакон
МарляКитайский центр хирургических перевязокMO1590008010 x 10 см
CAPSCoreLeader Biotech Co., Ltd, Тайбэй, Тайвань-
-Бумага лента3MNDC-8333-1530-012,5 см x 9,1м
Водостойкая пленка3MNDC-8333-1600-4010 см x 10 м
Лейкопластырь МолодойхимическийBH142601510 см x 10 м
Dissection:
Пара стандартных острых/тупых прямых ножниц (14 см)Инструменты ShinetecST-S114-
Холстед-Москит (12,5 см)Инструменты ShinetecST-H012-Ручка
(# 4)Инструменты ShinetecST-H004-Хирургическое
лезвие(#21)ИнструментыShinetec ST-B021-
<прочные>После фиксации и Хранение:
50 мл пластиковая центрифужная пробирка Falcon352070-10
% нейтральный буферизованный формалинLeica3800604EG-
Bacterial Growth Experiments 
Кровяная агаровая пластина (БАП) (ТСА с 5% овечьей крови) CMP-90мм Моно

Ссылки

  1. Sen, C. K., et al. Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair Regeneration. 17, 763-771 (2009).
  2. Sen, C. K. Wound healing essentials: let there be oxygen. Wound Repair Regeneration. 17, 1-18 (2009).
  3. Verhaegen, P. D., et al. Differences in collagen architecture between keloid, hypertrophic scar, normotrophic scar, and normal skin: an objective histopathological analysis. Wound Repair Regeneration. 17, 649-656 (2009).
  4. Experimental Surgery and Physiology: Induced Animal Models of Human Disease. Swindle, M. M., Adams, R. J. , Williams and Wilkins. Baltimore. (1988).
  5. Swindle, M. M., Smith, A. C. Swine as Models in Biomedical Research. , Iowa State University Press. Ames. (1992).
  6. Advances in Swine in Biomedical Research. Vols 1-2. Tumbleson, M. E., Schook, L. B. , Plenum Press. New York. (1996).
  7. Wang, C. H., et al. Enhanced wound-healing performance of a phyto-polysaccharide-enriched dressing - a preclinical small and large animal study. International Wound Journal. 14, 1359-1369 (2017).
  8. Rowan, M. P., Cancio, L. C., Elster, E. A., Burmeister, D. M., Rose, L. F., Natesan, S., Chan, R. K., Christy, R. J., Chung, K. K. Burn wound healing and treatment: review and advancements. Journal of Critical Care. 19, 243(2015).
  9. Wong, V. W., Sorkin, M., Glotzbach, J. P., Longaker, M. T., Gurtner, G. C. Surgical approaches to create murine models of human wound healing. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 969618, 8(2011).
  10. Gaines, C., Poranki, D., Du, W., Clark, R. A., Van Dyke, M. Development of a porcine deep partial thickness burn model. Burns. 39, 311-319 (2013).
  11. Gnyawali, S. C., Barki, K. G., Mathew-Steiner, S. S., Dixith, S., Vanzant, D., Kim, J., Dickerson, J. L., Datta, S., Powell, H., Roy, S., Bergdall, V., Sen, C. K. High-resolution harmonics ultrasound imaging for non-invasive characterization of wound healing in a pre-clinical swine model. PLoS One. 10 (3), e0122327(2015).
  12. Eaglstein, W. H., Mertz, P. M. New methods for assessing epidermal wound healing: the effects of triamcinolone acetonide and polyethelene film occlusion. Journal of Investigative Dermatology. 71, 332-384 (1978).
  13. Swindle, M. M., Smith, A. C. Comparative anatomy and physiology of the pig. Scandinavian Journal of Laboratory Animal Sciences. 25, 1-10 (1998).
  14. Swindle, M. M. Swine in the Laboratory: Surgery, Anesthesia, Imaging and Experimental Techniques. , 2nd ed, CRC Press. Boca Raton. (2007).
  15. Mertz, P. M., et al. IL-1 as a potent inducer of wound re-epithelization. Progress in Clinical and Biological Research. 365, 473-480 (1991).
  16. Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. Wound repair and regeneration: mechanisms, signaling, and translation. Science Translation Medicine. 6, 265-266 (2014).
  17. Aryza, M. J., Baryza, G. A. The Vancouver Scar Scale: an administration tool and its interrater reliability. The Journal of Burn & Rehabilitation. 16, 535-538 (1995).
  18. Bystrom, A., Claesson, R., Sundqvist, G. The antibacterial effect of camphorated paramonochlorophenol, camphorated phenol and calcium hydroxide in the treatment of infected root canals. Endodontics & Dental Traumatology. 1, 170-175 (1985).
  19. Reig, A., Tejerina, C., Codina, J., Hidalgo, J., Mirabet, V. Application of a new cicatrization dressing in treating second-degree burns and donor sites. Annals of Burn and Fire Disasters. 4, 174(1991).
  20. Hindy, A. Comparative study between sodium carboxymethyl-cellulose silver, moist exposed burn ointment, and saline-soaked dressing for treatment of facial burns. Annals of Burn and Fire Disasters. 22, 131-137 (2009).
  21. Galiano, R. D., et al. Topical vascular endothelial growth factor accelerates diabetic wound healing through increased angiogenesis and by mobilizing and recruiting bone marrow-derived cells. The American Journal of Pathology. 164, 1935-1947 (2004).
  22. Thangarajah, H., et al. The molecular basis for impaired hypoxia-induced VEGF expression in diabetic tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 13505-13510 (2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Модель ожога у свинейзаживление ожоговых ранизмерение закрытия раныВанкуверская шкала рубцеваниягистологическое исследованиебактериологический посевнагретый глицерином железный стерженьстерильный физиологический растворадгезивная пластырная повязка
Серьезный ожог в свином модели для оценки клинических Туалетная
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.