Эта статья представляет метод, основанный на спаривания, для облегчения гиперэкспрессия скрининга в многообещающий дрожжей с использованием библиотеки выстроились плазмиды.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
На основе спаривания гиперэкспрессия библиотека скрининга в дрожжи
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Многообещающий дрожжи широко используется как модель в изучении белков, связанные с заболеваниями человека. Генетический скрининг генома общесистемной является мощным инструментом, широко используется в исследованиях дрожжей. Выражение целого ряда нейродегенеративные заболевания связанных белков в дрожжей вызывает цитотоксичности и совокупных формирования, изложив выводы, видел у больных с этими расстройствами. Здесь мы описываем метод для проверки модель дрожжи связанные боковой амиотрофический склероз Белка FUS для модификаторов его токсичности. Вместо преобразования, эта новая платформа скрининга зависит спаривания дрожжей, чтобы внедрить библиотеку выстроились плазмид в модель дрожжей. Спаривания метод имеет две явные преимущества: во-первых, она очень эффективна; Во-вторых, предварительно преобразованные выстроились библиотека плазмиды могут храниться для долгосрочного как глицерин запас и быстро прикладной для других экранов без трудоемкого шаг преобразования в модель дрожжи каждый раз. Мы демонстрируем, как этот метод может успешно использоваться для экран для генов, которые изменяют токсичность FUS.
Введение
Многообещающий дрожжей Saccharomyces cerevisiae широко используется в фундаментальных научных исследований1 понять клеточных процессов, непосредственно связанных с заболеваниями человека. Кроме того он был использован в качестве модельного организма для изучения человеческих болезней связанных белков, таких как те связаны с наиболее распространенными нейродегенеративных заболеваний, включая болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Хантингтона и амиотрофический Склероз (ALS)2. Преимуществом дрожжевых модели является легкость, с которой геном широкий экран может выполняться для выявления клеточных пути, от....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Примечание: Протокол, описанные здесь предназначен для отбора библиотека плазмид, содержащихся в десяти 96-луночных пластины, но можно вычислить по маштабу вверх или вниз соответственно. Протокол должен быть повторен для завершения проверки всей библиотеки. Обычно скрининг против 10 пластины библиотека генов каждый раз можно комфортно обрабатываться 1 человек.
1. Подготовка к 96-луночных дрожжи преобразования
Примечание: Этот шаг делается как ранее описанных7,10.
- Аликвота 5 мкл (около 50 – 100 нг) плазмидной ДНК из библиотеки выстроились плазмида в каждой скважине 9....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
ALS-связанные Белка FUS, белок, связывающий РНК/ДНК, был ранее учился в haploid дрожжи7,,8. Генетический скрининг с использованием метода на основе преобразования обнаружил несколько дрожжи генов, которые подавляют FUS токсичности. Человека гомолога одного из дрожжей генов позднее была продемонстрирована эффективность подавления токсичности в первичной нейрональных клеток и крысы модель ALS13. Здесь, мы исп.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Здесь мы описываем протокол для выполнения экран гиперэкспрессия плазмида с помощью спаривания представить библиотеку плазмида в модель дрожжей дрожжи. Используя этот подход, несколько моделей дрожжи токсичности белка нейродегенеративные заболевания может проверяться с помощью той же коллекции дрожжей преобразуется с библиотекой плазмиды. Трудоемкий процесс преобразования только необходимо выполнить один раз, после которого высокоэффективных дрожжи спаривания используется ввести плазмида библиотека в нагрузку запросов. Э.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего сообщать.
Благодарности
Мы благодарны за вдумчивого обсуждения с членами Ju лаборатория и Лаборатория Чжун и финансовой поддержке Райт государственный университет.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| ДНК сперматозоидов лосося (SS-ДНК) | Sigma-Aldrich | D1626 | |
| YPD broth | Research Products International (RPI) | Y20090 | |
| Гранулированный агар | Fisher Sci | BP97445 | |
| D-(+)-Glucose | Research Products International (RPI) | G32040 | |
| D-(+)-Galactose | Research Products International (RPI) | G33000 | |
| D-(+)-Raffinose Pentahydrate | Research Products International (RPI) | R20500 | |
| Сульфат аммония | Fisher Sci | A702-500 | |
| Синтетический ура-среда | Clontech | 630416 | |
| дрожжевые аминокислоты дроп-гистидин/-урацил | Clontech | 630422 | |
| дрожжевая азотная основа без аминокислот и сульфата аммония | Research Products International (RPI) | Y20060 | |
| Диметилсульфоксид (ДМСО) | Fisher Sci | S67496 | |
| Ацетат лития, безводный | Fisher Sci | AC268640010 | |
| полиэтиленгликоль 3350 (PEG-3350) | Spectrum Chemical | РО125-12КГ | |
| 96-контактный репликатор | Scinomix | SCI-5010-OS | |
| Nunc OmniTray | Thermo Sci | 140156 | |
| Corning Costar 96 тестовая пластина, круглое дно с крышкой | Fisher Sci | 07-200-760 | необработанная, стерильная |
| Eppendorf Research plus Многоканальный пипетка | Eppendorf | TI13690052 | объемом 30-300 мкл |
| Fisherbrand Isotemp Цифровые сухие ванны/блочные обогреватели | Fisher Sci | 88-860-023 | |
| Eppendorf MixMate | Eppendorf | 21-379-00 | |
| Eppendorf 5810R Центрифуга | Fisher Sci | 05-413-112 | |
| Avanti J-26 XPI Центрифуга | Beckman | 393127 | |
| MultiFlo FX Многорежимный дозатор | BioTek | ||
| Rotor HDA | Певческие инструменты |
Ссылки
- Dujon, B. A., Louis, E. J. Genome diversity and evolution in the budding yeasts (Saccharomycotina). Genetics. 206 (2), 717-750 (2017).
- Khurana, V., Lindquist, S. Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: why cook with baker's ye....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
