Методическая статья

Простая хирургическая индукция кондуктивной потери слуха с проверкой с использованием Otoscope Визуализация и поведенческие хлопать Startle ответ на крысы

DOI:

10.3791/57993

⸱

26 октября 2019 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Instituto de Neurobiología, Universidad Nacional Autónoma de México, México, 2State Key Laboratory of Marine Pollution (SKLMP), City University of Hong Kong, Hong Kong, 3Department of Biomedical Sciences, College of Veterinary Medicine and Life Sciences, City University of Hong Kong, Hong Kong, 4Department of Physics, City University of Hong Kong, Hong Kong, 5Department of Clinical Oncology, Queen Elizabeth Hospital, Hong Kong, 6Department of Materials Science and Engineering, City University of Hong Kong, Hong Kong

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем протокол для создания репликативной кондуктивной индукции потери слуха через хирургический проколов ывана барабанная перепончатость и проверки по otoscope визуализации и поведенческой оценки хлопать startle.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Кондуктивная потеря слуха (CHL) является распространенным нарушением слуха у людей. Целью протокола является описание простой хирургической процедуры для индуцирования КХЛ у грызунов. Протокол демонстрирует КХЛ по переплету барабанной оболочки. Проверка хирургии КХЛ была otoscope обследования и поведенческой оценки хлопать startle ответ, как репликати и надежные, и простые методы, чтобы продемонстрировать потерю слуха произошло. Простая процедура CHL выгодна из-за ее воспроизводимости и гибкости для различных занятий в исследовании потери слуха. Ограничения индуцирования CHL хирургическим подходом связаны с кривой обучения для выполнения хирургической процедуры и уверенностью в аудиологическом обследовании. Индуцирование нарушения слуха ч. 4 м. позволяет легко изучать нервные проявления и поведенческие исходы потери слуха.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Распространенность потери слуха у детей и взрослых составляет примерно 19,5%1 и 15,2%соответственно. Тем не менее, примерно 39,3% всех новорожденных с ненормальным скринингслух не получают лечения, как сообщили Центры по контролю заболеваний3. Потеря слуха является широко изученным состоянием, и грызун является надежной моделью для изучения нормальных нарушений слуха и слуха4,5,6,7,8,9 ,10,11,12,13,14,15. Слуховые расстройства, такие как кондуктивная потеря слуха (CHL) приводят к увеличению краткосрочной синаптической депрессии в слуховой коре4, что приводит к более мелким психометрическим склонам, связанным с порогами обнаружения частотной модуляции 5. Кондуктивные модели потери слуха путем хирургического удаления /смещения Malleus, тимпанической мембраны (TM) прокол или затычка для ушей легко используются и позволяют быстро индукции модели потери слуха5,14 ,15,16,17,18. Целью настоящего протокола и метода является демонстрация простой и воспроизводимой модели КХЛ у грызунов.

Настоящий протокол является недорогим (300 долларов США со всеми инструментами), и легко изменить для различных исследований. Крыса была подробная оценка анатомии среднего уха19,20,21,22,23, хирургические подходы24, модели в отит СМИ25, 26,27 и ТМ прокол регенерации16,17,18,28,29,30, что делает его идеальной моделью для изучения потеря слуха. Здесь, простая процедура индукции CHL описана с проверкой otoscope и поведенческой оценкой с реакцией хлопать startle в крысе, которая после этого может быть использована для того чтобы исследовать дополнительные sequelae потери слуха. Процедура КХЛ индуцируется хирургическим проколом ТМ. Проверка процедуры КХЛ осуществляется с помощью визуализации отоскопа для определения отсутствия ТМ. Поведенческая оценка осуществляется высоким уровнем децибел (dB) уровня звукового давления (SPL) ручной хлопок. Этот метод был применен ранее в различных грызунов. Легко размножается, производит надежные психометрические различия и изменения в нервных физиологических реакциях4,5,16,17,18.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Настоящее исследование и процедуры были одобрены комитетами по этике исследований в отношении животных Городского университета Гонконга, Университета Гонконга и Департамента здравоохранения Специального административного района Гонконга.

1. Звери

  1. Используйте Крысы Sprague-Dawley (SD) двухмесячных (N 90, 200-250 г).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Грызуны были предоставлены аккредитованным лабораторным отделом животных Университета Гонконга.
  2. Поддерживайте крыс при постоянной температуре 25 градусов по Цельсию и 60-70% влажности в Отделе лабораторных исследований животных.
  3. Дом грызунов в 12/12-h свет / темные циклы с доступом к пище и питьевой воде, объявление libitum.
  4. Акклиматизировать грызунов к жилой среде, по крайней мере за один день до операции КХЛ.
  5. Возьмите грызуна по шерсти и анестезируйте грызуна коктейлем из кетамина и ксилазина (80-100 мг/кг: 5-10 мг/кг соответственно) с помощью интраперитонеальной инъекции (смешайте 1,0 мл кетамина с 0,5 мл ксилазина в качестве конечной концентрации).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте 1 мл шприца с иглой 23-25G. Вводят около 0,2 мл на 100 г массы тела крысы в течение 30 минут анестезии.
  6. Выполните щепотку ног, чтобы проверить ощущение боли и подтвердить правильную анестезию. Реакция на глубокий щепотку ног (путем снятия задней конечности) указывает на недостаточную анестезию.

2. Хирургическая установка

  1. Стерилизовать все оборудование в автоклавили или горячего стекла стерилизатора перед началом операции. Очистите хирургическую область с 70% этанола.
  2. Используйте латексные перчатки и лабораторное пальто перед началом процедуры.
  3. Поместите стерильную хирургическую драпировку на чистую скамейку(рисунок 1A).
  4. Стерилизовать микро-ножницы и отоскоп до операции, чтобы свести к минимуму инфекции уха(рисунок 1B).
  5. Поместите микро-ножницы и отоскоп в стерильной области.
  6. Поместите грызунов в хирургическое поле и в соответствие с хирургом.
  7. Продолжить хирургическую индукцию КХЛ.

3. Хирургическая индукция кондуктивной потери слуха

  1. Поместите хвост и голову грызуна выровнены в склонном положении, голову ближе к хирургу.
  2. Визуализируйте левое и правое ухо грызуна под отоскопом для обеспечения здоровой барабанной перепонки(рисунок 2а). Оцените как правое, так и левое ухо каждого грызуна, чтобы проверить состояние здоровья до индукции КХЛ.
  3. Захватите ушную спирали и расширить внешний слуховой канал (т.е. ушной канал, внешний слуховой meatus, здесь слуховой канал), чтобы вызвать внутри, чтобы стать скрытыми и почернели от глубины. Здесь слуховой канал выполнен перпендикулярно поверхности ТМ.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что слуховая каннеля прямо параллель сейчас и Tm формирует правильный угол с оси вставки микро-ножницы. Он будет визуализироваться как черная трубка без света. Иногда слуховой канал должен быть наклонен под небольшим углом, примерно на 15 градусов по плановой поверхности черепа. Это гарантирует, что рука хирурга перпендикулярна поверхности ТМ.
  4. Введите микро-ножницы в центре слухового канала обращая внимание не обезжиренное или ник ткани слухового канала и продолжить слегка, примерно 5 мм от центра безвестности, толкая вперед мягко через центр ТМ.
    ПРИМЕЧАНИЕ: ТМ прокол может быть подтверждена поп-звук, когда микро-ножницы советы прокол ТМ. Появляются звук можно услышать примерно на 2 мин 52 с в видео. Это не звук ножниц; это звук прокола ТМ. Как измеряется после анализа, "поп" составляет примерно 20 дБ SPL больше, чем фоновый звук, записанный высокочастотным микрофоном. Нет необходимости проверять "поп" звук до такой степени, достаточно визуализации отоскопа. Следователь, возможно, потребуется на практике обеспечения "поп" слышал во время каждой процедуры КХЛ.
  5. Немедленно откройте пружинные микроножницы и поверните три раза после прокола ТМ, чтобы обеспечить перемещение головы маллеуса от ТМ (только при желании смещения malleus).
  6. Удалите микро-ножницы и поместите грызуна под отоскоп для визуализации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно отметить, что после хирургической процедуры не должно происходить значительного кровотечения. Эвтанизировать грызунов и не приступайте к поведенческой оценке, если кровотечение происходит.
  7. Побудить двустороннюю КХЛ, продолжая, как выше, в противоположном ухе.

4. Визуализация отоскопа

  1. Подтвердите успешную операцию КХЛ с помощью speculum малого диаметра для визуализации среднего уха грызунов.
  2. Оцените каждого грызуна до и после хирургической процедуры CHL под отоскопом. Обеспечить подтверждение нормального ТМ(рисунок 2a)и поврежденных ТМ после индукции CHL(рисунок 2b).
  3. Послеоперационный уход за грызунами
    1. Поместите грызуна в домашнюю клетку под теплую лампу.
    2. Наблюдайте за индукцией грызунов после КХЛ до тех пор, пока грызун не не удосучится.
    3. Введите грызунов с глюкозой (декстроза / солиной) сыворотки для восстановления сознания и место грызунов в домашней клетке для восстановления.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте 23G иглу с шприцем 10 мл, чтобы ввести 5 мл сольственного раствора после операции КХЛ.
    4. Вводят грызунов через внутримышечный с антибактериальным Энрофлоксацин 0,05 мг/кг дважды в течение 24 ч период восстановления.
    5. Регулярно наблюдайте за грызунами при болевом поведении или симптомах после операции.

5. Поведенческая оценка (проверка индукции КХЛ) - ответ на хлопок

  1. Корроборат КХЛ (после подтверждения отоскопа) 24 ч после операции с поведенческой оценки, состоящей из хлопать-старт-тест.
  2. Поместите крысу, индуцированную КХЛ, рядом с обычной крысой в две отдельные смежные клетки.
  3. Поместите грызунов в тихую комнату.
  4. Встаньте примерно на 0,5 м от грызунов и приступайте к хлопанию в одинаково расставленных длительности несколько раз (5 хлопков были выбраны и расположены более 1 секунды).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Хлопок испуг производства хлопать в ладоши измеряется 40 дБ SPL больше, чем фоновый звук, как записано высокочастотным микрофоном.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Простая процедура CHL была выполнена на 90 крыс и из этой группы 2 было значительное кровотечение и 2 не имеют потери слуха на следующий день, как оценивается поведенческие хлопок startle. Эти четыре крысы были отброшены. Крысы должны быть отброшены, как описано в причинах в обсуждении из-за осложнений. Индуцирование ТМ прокола и /или маллеуса смещения / удаления(рисунок 2B)вызывает CHL, что приводит к поведенческим проявлениям (т.е. CHL - нет ответа на громк...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы описываем простую хирургическую индукцию КХЛ с проверкой с использованием визуализации отоскопа и поведенческой реакции хлопания у крыс. Здесь мы демонстрируем метод на крысах и ранее этот метод был применен к песчанки и мышей. Этот метод может быть легко принят к другим грызунам. Индукция КХЛ позволяет изучать тонкую форму потери слуха, которая проявляется в слуховых корковых изменениях и психофизических поведенческих выводах4,5,1...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не заявляют о каких-либо финансовых или нефинансовых конфликтах интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была частично поддержана Гонконгнаучной гранты Совета, Ранняя карьера Схема, проект #21201217 К. Л., для проекта мозга картирования управляемой электрофизиологии с приложениями в области слуха и исследования шумового загрязнения. Мы благодарим Посградо ан Сьенсиас Биомидикас, Институт нейробиологии Национального университета Aut'noma де Мексика (УНАМ), Consejo Nacional де Ciencia у Tecnologa (ConACyT) Мексика для аспирантов 578458 в FAM.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Латексные, поливиниловые или нитриловые перчаткиAMMEXИспользуйте неопудренные перчатки 8-миловые
микропружинные ножницы (см. рис. 1b)RWD Life ScienceS11035-08общая длина 8,0 см, с режущей кромкой 3,5 мм, или аналогичные микрощипцы. Достаточно стандартного пинцета с пружинным действием
Otoscope mini 3000HEINE D-008.70.120MСтандартный светодиодный отоскоп будет достаточным
крысы или мышиJAX labsЛюбой мелкий грызун...
Маленькая клетка для грызуновTecniplast1284LНеобходимо две клетки, чтобы отделить грызуна CHL от слышащего грызуна. Если грызуны находятся в прямом контакте друг с другом, они будут пугать друг друга. Размеры клетки 365 x 207 x 140 мм, площадь пола: 530 см2/82,15 дюйма2
для

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shargorodsky, J., Curhan, S. G., Curhan, G. C., Eavey, R. Change in prevalence of hearing loss in US adolescents. The Journal of the American Medical Association. 304 (7), 772-778 (2010).
  2. Lucas, J. W., Schiller, J. S., Benson, V. Summary health statistics for U.S. adults: National health interview survey, 2001. National Center for Health Statistics. Vital and health statistics. 10 (218), 1-134 (2004).
  3. Gaffney, M., Green, D. R., Gaffney, C. Newborn hearing screening and follow-up: Aare children receiving recommended services? Public Health Reports. 125 (2), 199-207 (2010).
  4. Xu, H., Kotak, V. C., Sanes, D. H. Conductive hearing loss disrupts synaptic and spike adaptation in developing auditory cortex. The Journal of Neuroscience. 27 (35), 9417-9426 (2007).
  5. Buran, B. N., et al. A sensitive period for the impact of hearing loss on auditory perception. The Journal of Neuroscience. 34 (6), 2276-2284 (2014).
  6. Finck, A., Sofouglu, M. Auditory sensitivity of the Mongolian gerbil. The Journal of Auditory Research. 6, 313-319 (1966).
  7. Finck, A. Auditory sensitivity of the Mongolian Gerbil (Merionesunguiculatus). The Journal of the Acoustical Society of America. 41 (60), 1579(1967).
  8. Finck, A., Schneck, C. D., Hartman, A. F. Jr Development of auditory function in the Mongolian gerbil. The Journal of the Acoustical Society of America. 46 (1A), 107(1969).
  9. Ryan, A. Hearing sensitivity of the Mongolian gerbil, Meriones Unguiculatis. The Journal of the Acoustical Society of America. 59, 1222-1226 (1976).
  10. Dallos, P., Harris, D., Ozdamar, O., Ryan, A. Behavioral, compound action potential, and single unit thresholds: relationship in normal and abnormal ears. The Journal of the Acoustical Society of America. 64 (1), 151-157 (1978).
  11. Kelly, J. B., Potash, M. Directional responses to sounds in young gerbils (Meriones unguiculatus. Journal of Comparative Psychology. 100 (1), 37-45 (1986).
  12. Heffner, H. E., Koay, G., Heffner, R. S. Behavioral assessment of hearing in mice--conditioned suppression. Current Protocols in Neuroscience. , Chapter 8, Unit 8.21D (2006).
  13. Heffner, R. S., Koay, G., Heffner, H. E. Audiograms of five species of rodents: implications for the evolution of hearing and the perception of pitch. Hearing Research. 157 (1-2), 138-152 (2001).
  14. Lupo, E. J., Koka, K., Thornton, J. L., Tollin, D. J. The effects of experimentally induced conductive hearing loss on spectral and temporal aspects of sound transmission through the ear. Hearing Research. 272 (1-2), 30-41 (2011).
  15. Liberman, M. C., Liberman, L. D., Maison, S. F. Chronic conductive hearing loss leads to cochlear degeneration. PLoS One. 10 (11), e0142341(2015).
  16. Tucci, D. L., Cant, N. B., Durham, D. Conductive hearing loss results in a decrease in central auditory system activity in the young gerbil. Laryngoscope. 109, 1359-1371 (1999).
  17. Tucci, D. L., Cant, N. B., Durham, D. Effects of conductive hearing loss on gerbil central auditory system activity in silence. Hearing Research. 155, 124-132 (2001).
  18. Cook, R. D., Hung, T. Y., Miller, R. L., Smith, D. W., Tucci, D. L. Effects of conductive hearing loss on auditory nerve activity in gerbil. Hearing Research. 164, 127-137 (2002).
  19. Albuquerque, A. A., Rossato, M., Oliveira, J. A., Hyppolito, M. A. Understanding the anatomy of ears from guinea pigs and rats and its use in basic otologic research. Brazilian Journal of Otorhinolaryngology. 75, 43-49 (2009).
  20. Li, P., Gao, K., Ding, D., Salvi, R. Characteristic anatomical structures of rat temporal bone. Journal of Otology. 10, 118-124 (2015).
  21. Judkins, R. F., Li, H. Surgical anatomy of the rat middle ear. Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 117, 438-447 (1997).
  22. Hellström, S., Salén, B., Stenfors, L. E. Anatomy of the rat middle ear. A study under the dissection microscope. Acta Anatomica (Basel). 112, 346-352 (1982).
  23. Albiin, N., Hellström, S., Salén, B., Stenfors, L. E., Wirell, S. The vascular supply of the rat tympanic membrane. The Anatomical Record. 212, 17-22 (1985).
  24. Li, P., Ding, D., Gao, K., Salvi, R. Standardized surgical approaches to ear surgery in rats. Journal of Otology. 10, 72-77 (2015).
  25. Johansson, U., Hellström, S., Anniko, M. Round window membrane in serous and purulent otitis media. Structural study in the rat. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 102, 227-235 (1993).
  26. Magnuson, K., Hellström, S. Early structural changes in the rat tympanic membrane during pneumococcal otitis media. European Archives of Oto-Rhino-Laryngology. 251, 393-398 (1994).
  27. Hellström, S., Salén, B., Stenfors, L. E. The site of initial production and transport of effusion materials in otitis media serosa. A study on rat middle ear cavity. Acta Oto-Laryngologica. 93, 435-440 (1982).
  28. Shen, Y., et al. Scaffolds for tympanic membrane regeneration in rats. Tissue Engineering Part A. 19, 657-668 (2013).
  29. Wang, A. Y., et al. Rat model of chronic tympanic membrane perforation: Ventilation tube with mitomycin C and dexamethasone. International Journal of PediatricOtorhinolaryngology. 80, 61-68 (2016).
  30. Stenfeldt, K., Johansson, C., Hellström, S. The collagen structure of the tympanic membrane: collagen types I, II, and III in the healthy tympanic membrane, during healing of a perforation, and during infection. Archives of Otolaryngology--Head & Neck Surgery. 132, 293-298 (2006).
  31. Zhao, H., et al. Temporary conductive hearing loss in early life impairs spatial memory of rats in adulthood. Brain and Behavior. 8, e01004(2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи