Методическая статья

Быстрый, безопасный и простой ручной прикроватные нуклеиновой кислоты извлечения для обнаружения вируса в пробах цельной крови

DOI:

10.3791/58001

⸱

30 июня 2018 г.

 ,  , 
1Virus Research & Development Laboratory, Statens Serum Institut, 2Infectious Disease Research Unit, University of Southern Denmark

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем протокол для извлечения антивирусную нуклеиновой кислоты из цельной крови инактивированный вирус. Добыча осуществляется непосредственно в пробирки и не требует оборудования или электричество. Метод не зависит от лабораторных объектов и могут быть использованы в любом месте (например, в полевых госпиталях).

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Быстрая диагностика инфекции имеет важное значение для управления вспышки, сдерживание рисков и ухода за пациентами. Ранее мы показали метод для быстрого прикроватные инактивация вируса Эбола во время забора крови для безопасного нуклеиновой кислоты (NA) тестов, добавив коммерческих лизис/привязки буфера непосредственно в вакуумной пробирки. Используя этот подход прикроватные инактивации, мы разработали безопасного, быстрого и упрощенного метода прикроватные NA извлечения для последующего обнаружения вируса в крови целом инактивированная буфера lysis/привязки. NA добыча производится непосредственно в пробирки и не требует оборудования или электричество.

После того, как кровь собирается в буфере lysis/привязки, содержание смешиваются, щелкая трубки вручную, и смесь инкубировали в течение 20 минут при комнатной температуре. Магнитные стекла частиц (MGPs) добавляются к трубе, и содержание смешиваются, щелкая трубки коллекции вручную. MGPs затем собираются на стороне пробирка с помощью магнита и магнитным держателем или резинкой. MGPs промывают три раза, и после добавления Элюирующий буфер непосредственно в коллекции трубку, NAs готовы для испытаний NA, например ПЦР или изотермический цикл амплификации (лампа), без удаления MGPs от реакции. Метод извлечения NA не зависит от каких-либо лабораторных объектов и могут быть легко использованы в любом месте (например, в полевые госпитали и больницы изоляторах). Когда этот метод извлечения NA сочетается с лампой и портативный инструмент, диагноз можно получить в течение 40 мин сбора крови.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В ситуациях вспышки вируса когда пациенты сводятся к изоляции стационарах или когда требуется быстрый диагноз, безопасной, простой и точной точки обслуживания молекулярной диагностики является императивом для пациента ухода и риска сдерживания. Два недавних вспышек вирусных, вирус Эбола (EBOV) в Западной Африке (2013) и вирус Зика в Южной Америке (2015), повысили интерес к улучшение обслуживания точки молекулярных диагностических тестов, например обратная транскрипция цикла опосредованной изотермический амплификация (RT-лампа)1,2 и рекомбиназа полимеразы амплификации (РПА)3,4. RT-лампа и РПА, быстрое, чувствительной и конкретные молекулярные тесты, которые могут быть выполнены на упрощенный пример подготовки. Для вируса Зика RT-лампа была объединена с бокового потока проба (LFA), который может обнаружить вирус Зика проб неочищенных цельной крови в течение 30 мин-1; Однако, для EBOV, который классифицируется как риск группы 4 возбудителя и очень заразна, образцы необходимо обрабатывать по биобезопасности уровня 4 (BSL-4) условия и инактивированных перед любой безопасной диагностические процедуры могут быть выполнены.

Упрощенные инактивации методы для EBOV, такие как добавление лизис буферов для образца2,3,4,5, были использованы во время вспышки; Однако эти методы требуют обработки условиях BSL-4 с лабораторным оборудованием, например биобезопасности шкафы BSL-3, центрифуги, Отопление блоков и пипетки, как минимум. Это оборудование обычно не присутствует, в следственных изоляторах или в полевых госпиталях. Чтобы преодолеть эту проблему, были предприняты попытки для выполнения диагностики в чемоданах3, и несколько портативных устройств и машин были развитые [например, портативное устройство для извлечения нуклеиновой кислоты (NA)]6. Однако EBOV-позитивных образцов необходимо инактивированная, прежде чем эти устройства могут быть использованы.

Мы уже ранее сообщали метод инактивации антивирусную Тумба для EBOV7, Vaccinia вируса и вирус коровьей8 добавлением буфера коммерческих лизис/привязки для обычных вакуумной пробирки, позволяя для прямого Передача крови от пациента в инактивации буфера7. Это прямой и непосредственный инактивации в закрытой системе устраняет необходимость для обработки образцов с помощью любой строгий сдерживания, например BSL-4 условия7, и образцы могут быть обработаны при нормальных условиях BSL-2. Этот метод инактивации совместим с несколькими системами извлечения NA, таких как роботы и ручной очистки наборы7; Однако эти методы требуют лабораторного оборудования, таких как роботы, центрифуги и электричество, которые не всегда присутствуют в поле Параметры или внутри изоляции стационарах.

В настоящем докладе мы описываем безопасного, быстрого и упрощенного метода ручной NA извлечения для последующего молекулярной обнаружения вируса в крови целом инактивированная буфера lysis/привязки. Метод извлечения NA не требуют никакого оборудования помимо магнит/магнитный держатель. Нет центрифуги, Отопление блоков, или электричество необходимо для извлечения NA. Следовательно, этот метод не зависит от лабораторных объектов и могут быть легко использованы в любом месте (например, в полевых госпиталях, в стационарах изоляции, или с ограниченными ресурсами). Метод извлечения NA быстрый и простой и может использоваться непосредственно в любой течению NA тесты, такие как RT-лампа, лампа, ПЦР и RT-ПЦР. Когда этот метод извлечения NA сочетается с лампой и портативный аккумулятор driven изотермический инструмент, прикроватные диагноз можно получить в течение 40 мин сбора крови.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Комитет по этике биомедицинских исследований, столичный регион дал согласие, и все методы, описанные здесь были освобождены от обзора по системе этического Комитета, в соответствии с датского Закона о анализа проектов в области развития.

1. Подготовка вакуумной пробирки для инактивирования вирусов и извлечения быстрой NA

Предупреждение: Буфер, используемый для этого протокола содержит Гуанидиновые тиоцианат (GITC) и неионогенные ПАВ, которые являются раздражителями. Принять меры безопасности соответствующие лабораторные, используйте бленду потока и надевайте перчатки при обращении с ней. Избегайте любой кожи и глаза. Если буфер пролилась, загрязненной поверхности должны никогда не быть продезинфицированы непосредственно с хлорамина или гипохлорита натрия (активные ингредиенты в «Блич») потому, что эта смесь может привести к образованию токсичных цианистых. Во-первых Вытрите пролитое буфер с поглощающей ткани. Затем очистите поверхность с 70% этанола, а затем с водой и, наконец, использовать хлорамина или гипохлорита натрия.

  1. Подготовить Вакуумные пробирки, привнести 1,6 мл конкретных коммерческих литического буфера в вакуумной трубке 4 мл ЭДТА, проколов крышку трубки с помощью 25 G x 1 иглу и шприц 3 мл.
    Примечание: Не снимайте крышки вакуумной трубки. Необходимо поддерживать вакуум.
  2. Хранения Вакуумные пробирки, содержащие буфер при комнатной температуре до использования.
    Примечание: Трубы устойчивы, по крайней мере 1 год после их подготовки.

2. Подготовка буферов для извлечения NA

  1. Подготовить буферы для извлечения NA, место два 1.8 мл, два 4.5 мл и один 3,6 мл трубки в стойку.
  2. Добавьте, дозирование, 960 мкл частиц (MGPs) магнитных стекла чистые 1.8 мл трубки и этикетка с MGPs. Ресуспензируйте MGP подвеска полностью перед его закупорить.
    Примечание: MGPs склонны быстро собирать в нижней части трубки.
  3. Добавить, дозирование, 4 мл буфера мытья я к чистой 4,5 мл трубки и пометьте ее как ВБ-1.
    Предупреждение: Мыть буфер содержит Гуанидиновые хлорид, который является раздражающим. Принять меры безопасности соответствующие лабораторные, используйте бленду потока и надевайте перчатки при обращении с ней. Избегайте любой кожи и глаза.
  4. Добавить, дозирование, 1,5 мл буфера II мыть чистой 3,6 мл пробирку и пометьте ее как WB-2.
  5. Добавить, дозирование, 3 мл буфера III мыть чистой 4,5 мл пробирку и пометьте ее как WB-3.
  6. Добавить, дозирование, 100 мкл буфера в чистой 1.8 мл трубку и пометьте ее как EB.
  7. Магазин aliquoted буферов при комнатной температуре до использования.
    Примечание: Трубы устойчивы, по крайней мере 1 месяц после их подготовки.

3. крови коллекции от пациентов с признаками и симптомами заражения вирусом

Предупреждение: Принять соответствующие лабораторные меры безопасности при сборе цельной крови от пациента. Надевайте перчатки и очки. Если пациент находится в изоляции, выполните процедуры по биобезопасности уровня 4.

  1. Для сбора внутривенного цельной крови от пациента, используйте Бабочка иглы с малокалиберная расширение трубы и вакуумной пробирки содержащие буфера lysis/привязки. Подлокотники пациента в положении вниз и позицию коллекции трубки, ниже, чем Бабочка иглы. Вставьте Бабочка иглы в вену больного и прикрепите вакуумная пробирка малокалиберная расширение.
    Примечание: Это предотвратит обратного потока.
  2. После сбора крови Смешайте содержимое трубки, щелкая трубки 5 - 10 раз.
    Примечание: Из-за оставшихся вакуума в пробирки, содержащие 1,6 мл буфера lysis/привязки, объем собранных образцов будет автоматически 1,6 мл.
  3. Продезинфицируйте внешней трубки с помощью 70% этиловом спирте.
  4. Инкубируйте трубы для 20 мин при комнатной температуре.
    Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь и полный пробирки могут храниться при-20 ° C, 5 ° C, 25 ° C или 37 ° C для по крайней мере 1 месяц7.
  5. Продолжить прямо на упрощенный метод извлечения NA.

4. упростить извлечение NA цельной крови

  1. Чтобы очистить NA от лизис/привязки буфера инактивированная собранной крови, смесь содержимое тюбика, щелкая вакуум трубки вручную 5-10 x.
  2. Осторожно снимите крышку трубки и выполнять крышку.
  3. Залейте подготовленный Алиготе MGPs (1 мл) непосредственно в пробирки.
  4. Место новой крышкой от неиспользуемых пробирка на трубка, содержащая образец.
  5. Поместите палец на крышке убедитесь, что трубка плотно закрыты и смешать содержимое трубки, щелкая пробирка вручную 5 - 10 раз.
  6. Трубка в магнитный держатель и держать руку на крышке, чтобы убедиться, что трубка плотно закрыты.
  7. Флип магнитный держатель с трубки несколько раз вручную, чтобы убедиться, что все MGPs собираются на стороне трубки с магнитом.
    Примечание: Магнитный держатель могут быть заменены удлиненные магнит и резинкой.
  8. Снимите крышку трубки и сбросить содержимое трубки, либо с помощью одноразовой пипетки или просто наливание содержимого в коллекции Тюбик 50 мл.
    Примечание: Избегайте аэрозолей из коллекции Тюбик 50 мл, закрыв трубки с крышкой.
  9. Залейте подготовленный Алиготе ВБ-1 (4 мл) непосредственно в пробирки.
  10. Установите крышку на трубе и Поместите палец на крышке, чтобы убедиться, что трубка плотно закрыты.
  11. Снять трубку с магнитным держателем, сохраняя крышка надежно затянуты с пальцем.
    Примечание: Если с помощью магнита и резинкой, просто удалите резинкой и магнит из трубки.
  12. Ресуспензируйте MGPs, щелкая пробирка вручную 5 - 10 раз.
  13. Повторите шаги с 4,6-4,8.
  14. Залейте подготовленный Алиготе WB-2 (1,5 мл) непосредственно в пробирки.
  15. Установите крышку на трубе и снять трубку из магнитного держателя.
    Примечание: Если с помощью магнита и резинкой, просто удалите резинкой и магнит из трубки.
  16. Поместите палец на крышке, чтобы убедиться, что трубка плотно закрыты.
  17. Ресуспензируйте MGPs, щелкая пробирки на несколько секунд вручную.
  18. Повторите шаг 4,6-4,8.
  19. Залейте подготовленный Алиготе WB-3 (3 мл) непосредственно в пробирки.
  20. Установите крышку на трубе и снять трубку из магнитного держателя.
    Примечание: Если с помощью магнита и резинкой, просто удалите резинкой и магнит из трубки.
  21. Поместите палец на крышке, чтобы убедиться, что трубка плотно закрыты.
  22. Ресуспензируйте MGPs, щелкая пробирка вручную 5 - 10 раз.
  23. Повторите шаги с 4,6-4,8.
  24. Залить подготовленные Алиготе EB (100 мкл) непосредственно в пробирки.
  25. Установите крышку на трубе и снять трубку из магнитного держателя.
    Примечание: Если с помощью магнита и резинкой, просто удалите резинкой и магнит из трубки.
  26. Ресуспензируйте MGPs в EB, нажав пробирка 5 - 10 раз с пальцем.
    Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь, и трубы могут храниться при температуре-20 ° C.
  27. Передача одной капли (5-8 мкл) ресуспензированы MGPs течению NA усиление реакции микс используя одноразовые пипетки 1,5 мл (любой течению диагностических NA амплификации пробирного такие как RT-лампа или ПЦР/RT-ПЦР-анализов могут быть использованы).
    Примечание: NAs будет придерживаться MGPs, так что не забудьте использовать MGPs в нижнем реакции амплификации NA. Смешайте MGP подвеска перед использованием. После смешивания, MGPs будет собирать в нижней части трубки.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол, представленные здесь проста и эффективна и может широко применяться к любой молекулярных пробирного выполняться на образцах инфекционных цельной крови, инактивированная с буфера lysis/привязки. Рабочий процесс инактивации крови и NA добыча показано на Рисунок 1, включая подготовку крови коллекции вакуумные трубки7 (рис. 1а), крови коллекции7 (рис. 1B

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В настоящем докладе мы описываем безопасной, быстрой и простой ручной прикроватные NA извлечения метод для вниз по течению молекулярной обнаружения вируса в крови целом инактивированная буфера lysis/привязки. Описан метод извлечения NA был разработан непосредственно на пробах цельной крови в вакуумной пробирки, содержащие лизис/привязки буфера (Таблица материалов)7. Этот буфер инактивирует EBOV7 и является важным компонентом в методе. После сбора крови мы р...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Сюзанна Лопес Расмуссен и Солвэй Kolbjørn Дженсен за их технической помощи и для обработки клинических образцов. Этот проект является частью EbolaMoDRAD консорциум, который получил финансирование от инновационной медицины инициатива 2 совместное предприятие под Грант соглашение N ° 115843. Это совместное предприятие получает поддержку от Европейского союза Horizon 2020 исследований и инновационной программы и EFPIA.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Vacutainer K2 EDTA tubes (4 мл)Becton Dickinson368861
Plus Blood CollectionBecton Dickinson362725
23G x 1 иглаBecton Dickinson300800
LUER LOK шприц (3 мл)Becton Dickinson309658
игла-бабочка с удлинительной трубкой малого диаметраJø rgen Kruuse A/S121714
1% VirkonNomeco A/S849265
MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I - лизис/связывающий буфер - заправкаRoche Diagnostics A/S03246752001
MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit RocheDiagnostics A/S3038505001
Nunc™ Биобанкинг и криогенные пробирки для клеточных культур (1,8 мл)Thermo Fisher Scientific375418
Nunc™ Биобанкинг и криогенные пробирки для клеточных культур (3,6 мл)Thermo Fisher Scientific379189
Nunc™ Биобанкинг и криогенные пробирки для клеточных культур (4,5 мл)Thermo Fisher Scientific379146
DynaMag™-5 МагнитThermo Fisher Scientific12303D
Трансферная пипетка (3,5 мл)Sarstedt86.1171.010
Thermo Scientific™ Samco™ Пипетки для переноса с тонким наконечником (1,5 мл)Thermo Fisher Scientific231
Thermo Scientific&торговля; Nunc™ 50 мл конические стерильные полипропиленовые центрифужные пробиркиThermo Fisher Scientific339652

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lee, D., Shin, Y., Chung, S., Hwang, K. S., Yoon, D. S., Lee, J. H. Simple and Highly Sensitive Molecular Diagnosis of Zika Virus by Lateral Flow Assays. Analytical Chemistry. 88, 12272-12278 (2016).
  2. Benzine, J. W., Brown, K. M., et al. Molecular Diagnostic Field Test for Point-of-Care Detection of Ebola Virus Directly from Blood. Journal of Infectious Diseases. 214 (Suppl 3), S234-S242 (2016).
  3. Faye, O., Faye, O., et al. Development and deployment of a rapid recombinase polymerase amplification Ebola virus detection assay in Guinea in 2015. Euro Surveillance. 20 (44), 10-18 (2015).
  4. Yang, M., Ke, Y., et al. Development and Evaluation of a Rapid and Sensitive EBOV-RPA Test for Rapid Diagnosis of Ebola Virus Disease. Scientific Reports. 6, (2016).
  5. Smither, S. J., Weller, S. A., et al. Buffer AVL alone does not inactivate Ebola virus in a representative clinical sample type. Journal of Clinical Microbiology. 53 (10), 3148-3154 (2015).
  6. Byrnes, S., Fan, A., et al. A Portable, Pressure Driven, Room Temperature Nucleic Acid Extraction and Storage System for Point of Care Molecular Diagnostics. Analytical Methods. 5 (13), 3177-3184 (2013).
  7. Rosenstierne, M. W., Karlberg, H., et al. Rapid bedside inactivation of Ebola virus for safe nucleic acid tests. Journal of Clinical Microbiology. 54 (10), 2521-2529 (2016).
  8. Vinner, L., Fomsgaard, A. Inactivation of orthopoxvirus for diagnostic PCR analysis. Journal of Virological Methods. 146, 401-404 (2007).
  9. Schmitz, H., Köhler, B., et al. Monitoring of clinical and laboratory data in two cases of imported Lassa fever. Microbes and Infection. 4 (1), 43-50 (2002).
  10. De La Vega, M. A., Caleo, G., et al. Ebola viral load at diagnosis associates with patient outcome and outbreak evolution. Journal of Clinical Investigation. 125 (12), 4421-4428 (2015).
  11. Hasanoglu, I., Guner, R., et al. Dynamics of viral load in Crimean Congo hemorrhagic fever. Journal of Medical Virology. 90 (4), 639-643 (2017).
  12. Biava, M., Colavita, F., et al. Evaluation of a rapid and sensitive RT-qPCR assay for the detection of Ebola Virus. Journal of Virological Methods. 252, 70-74 (2018).
  13. Fernández-Carballo, B. L., McBeth, C., et al. Continuous-flow, microfluidic, qRT-PCR system for RNA virus detection. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 410 (1), 33-43 (2017).
  14. Weller, S. A., Bailey, D., et al. Evaluation of the Biofire FilmArray Biothreat E-test (v2.5) for rapid identification of Ebola virus disease in heat-treated blood samples obtained in Sierra Leone and United Kingdom. Journal of Clinical Microbiology. 54 (1), 114-119 (2015).
  15. Semper, A. E., Broadhurst, M. J., et al. Performance of the GeneXpert Ebola Assay for Diagnosis of Ebola Virus Disease in Sierra Leone: A Field Evaluation Study. PLoS Medicine. 13 (3), e1001980(2016).
  16. Biocartis. Instructions for Use: Idylla TM Ebola Virus Triage Test. , https://www.fda.gov/downloads/MedicalDevices/Safety/EmergencySituations/UCM503944.pdf (2016).
  17. MPLC. Total Nucleic Acid Isolation Kit. Safety data sheet version 1.7. , https://pim-eservices.roche.com/DownloadDocument/SDS/DE/en/03038505001 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

LAMP

Похожие статьи