Методическая статья

Использование мыши Splenocytes оценить патоген связанные молекулярные модели влияние на экспрессию генов будильник

6.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/58022

⸱

24 июля 2018 г.

1Department of Biology, University of Hartford

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает метод, с помощью мыши splenocytes обнаружить патоген связанные молекулярные модели, которые изменить выражение гена молекулярные часы.

Аннотация

От поведения для экспрессии генов циркадные ритмы регулируют почти все аспекты физиологии. Здесь мы представляем методологии вызов splenocytes мыши с патоген связанные молекулярные структуры (PAMPs) липополисахарида (LPS), ODN1826 и жар убитые листерий и изучить их воздействие на молекулярном суточного Часы. Ранее исследования были посвящены изучению влияния LPS на молекулярные часы, с использованием различных подходов в естественных условиях и ex vivo из ассортимента моделей (например, мышь, крысы и человека). Этот протокол описывает изоляции и вызов splenocytes, а также методологии оценки после задача выражение гена часы через количественного PCR. Этот подход может использоваться для оценки не только влияние микробиологических компонентов на молекулярные часы но других молекул, которые могут изменить выражение часов. Этот подход может использоваться помимо дразнить молекулярный механизм влияния будильник выражение PAMP-Толл подобный рецептор взаимодействия.

Введение

Главные часы в млекопитающих, который оркеструет 24 h колебаний для почти всех аспектах физиологии и поведения, расположен в пределах Супрахиазмальное ядро (SCN) гипоталамус1,2. Помимо регулирования биологических процессов на Организменное уровне, мастер будильник синхронизирует периферийных сотовой часы на протяжении всего тела3,4,5. В то время как молекулярные часы машины состоит из по меньшей мере три взаимосвязанных transcriptional поступательные обратной, ядро состоит из периода (Per1-3), Криптохром (Cry1-2), Bmal1, и часы генов6,7. Помимо поддержания точного времени основные молекулярные часы, некоторые продукты гена вспомогательные будильник (например, Rev-erbα и Dbp) также регулировать экспрессию генов-часы, то есть, часы контролируемых генов (CCGs)6 , 7.

Функциональные молекулярные часы были описаны в различных иммунных тканей (например, селезенке и лимфатических узлах)8 и клетки (например, B клетки, дендритные клетки, макрофаги)8,9. Эти клетки обнаруживать и реагировать патоген связанные молекулярные структуры (PAMPs), сохраняется микробные компоненты, через врожденное иммунного распознавания рецепторов Толл подобные рецепторы (TLRs)10. На сегодняшний день, были описаны 13 функциональных TLRs, которые признают микробной составляющих, таких как компоненты клеточной стенки бактерий, flagellar белка и микробных нуклеиновые кислоты10. Было показано, что PAMP, липополисахарида (LPS), компонент клеточной стенки грамположительных бактерий, признанные TLR4, изменить циркадные ритмы на научные и молекулярном уровнях. Например в естественных условиях задача ЛПС индуцированной фотическом как этап задержки как измеряется активность мышей11 и привело к сокращению Будильник экспрессии генов в ППП и печени определяется в situ Гибридизация и количественного PCR, соответственно в12крыс. После вызов в vivo с ПЛАСТИНОК анализ лейкоцитов периферической крови человека13 и подкожной жировой клетчатки14 показал изменены экспрессию нескольких генов Будильник, измеренного через ПЦР. И наконец ex vivo LPS проблемы человеческого макрофагов и мыши перитонеальных макрофагов, также привело к экспрессию часы как измеряется ПЦР14.

Здесь мы описываем протокол для оценки влияния PAMPs LPS, ODN1826 (синтетические олигонуклеотиды содержащих unmethylated CpG мотивы) и жар убитые листерий (HKLM), TLR4, TLR9 и TLR2, соответственно, на молекулярные часы экспрессии генов в splenocytes мыши. Протокол включает в себя мыши спленэктомии, splenocyte изоляции и вызов, РНК добыча, синтез cDNA и ПЦР Оценить экспрессию нескольких генов будильник. Этот протокол обеспечивает своевременное приобретение большого числа иммунных клеток с очень мало животных или сотовый манипуляции, которые затем могут быть оспорены ex vivo с различными PAMPs. Было показано, что молекулярные часы модулировать различные аспекты иммунного ответа8,,1516, таким образом, нарушение молекулярных часов скорее всего подорвет надлежащее время зависимых вариации иммунный ответ. Кроме того поскольку нарушения циркадианных ритмов может привести к серьезной патологии17,18,19,20, может быть интерес для исследователей, чтобы оспорить splenocytes с широкий спектр молекулы и оценить их влияние на часах.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

В ходе исследования животных ухода и лечения соблюдение политики национальных институтов здравоохранения, были институциональных руководящих принципов и были утверждены Хартфордского университета животных институционального ухода за животными и использования Комитетом.

1. нейроволновой синхронизации животных

Примечание: Двадцать week-old мышей мужской B6129SF2/J используются в исследовании.

  1. Увлекают мышей до 12 ч света (Стандартный подвесной белый свет) / 12 h темные цикла за 2 недели до эксперимента.
    Примечание: Здесь zeitgeber время (ZT) 0 соответствует огни на и ZT12 выключенным, при сохранении всех других экологических факторов (то есть, еда, вода и комнатной температуре) постоянное 21.

2. Подготовка документов, культуры среднего и среднего вызов

  1. Автоклав щипцы и рассечения ножницы. Оберните пар матовое Микроскоп слайды в алюминиевой фольги и автоклав.
  2. Подготовка питательной среды, добавив плода бычьим сывороточным (ФБС) RPMI 1640 до конечной концентрации 10%. Подготовка 10 мл вызов среды в 50 мл трубки, добавив следующие PAMPs питательной среды (RPMI с 10% FBS); ПЛАСТИНОК (5 мкг/мл), ODN1826 (5 мкг/мл), жар убитые листерий (108 HKLM/мл), или другой PAMP его предложил концентрации.
  3. Теплый культуры среднего и среднего вызов до 37 ° C в ванне с водой и держать около 70 мл стерильного фосфатный буфер (PBS, рН 7,2) при комнатной температуре.
  4. Добавьте 10 мл питательной среды с помощью пипетки 10 мл и помощи пипеткой 50 мл трубки и место на льду.
  5. Добавьте примерно 30 мл 70% этанола в 100 мл стакан и место концы рассекает ножницы и щипцами в стакан для предотвращения микробного загрязнения.
  6. Подготовьте буфера lysis для изоляции РНК путем добавления 10 мкл β-меркаптоэтанол (под зонт) каждый 1 мл буфера RLT в 50 мл трубки. Сделайте только сумму, которая будет необходимой (600 мкл на сэмпл, который состоит из примерно 1 х 106 клеток).
    Примечание: RLT буфера является компонентом РНК добыча комплект, который поддерживает привязку РНК кремнезема мембраны.

3. Splenocyte изоляции и вызов

  1. Усыпить мышей в частности zeitgeber время через наркоза, держа их в их оригинальной клетке и добавив CO2 в клетке со скоростью потока, 3 Л/мин продолжить поставлять CO2 за 1 мин после остановки дыхания.
  2. Подтвердите смерть через шейки матки дислокации, поместив большой палец и указательный палец по бокам шеи у основания черепа. Также можно нажмите стержень на базе черепа потянув быстро (с использованием другой) основания хвоста или задних конечностей вызвать разделение шейных позвонков от черепа22.
  3. Spray мыши ствола с 70% этанола и вытрите бумажным полотенцем. Поместите курсор мыши на его спине и слегка наклонена на ее правой стороне. Срезаем меха, с использованием рассечения ножницы, вдоль левой стороны мыши, о на полпути между передней и задней ноги.
  4. С помощью щипцов, захватить брюшины и тщательно сделать надрез, чтобы не повредить селезенки. Удаление селезенки с щипцами и поместите в стерильных 50 мл трубки, содержащие примерно 10 мл культуры средств массовой информации на льду. Повторите для остальных животных.
    Примечание: Хандра цвет фасоли, и это длиннее и льстить чем почки.
  5. Передача одного селезенки с 2 мл питательной среды небольшой Петри стерильные.
    1. Однородный селезенки путем перемалывания его между матовыми часть двух стерильных матовое слайды. Если это возможно Держите вопрос и клеток в среде во время процесса гомогенизации.
    2. После тщательно гомогенизированные, накапайте 2 мл питательной среды, содержащие splenocytes через стрейнер клеток нейлон 40 мкм в 50 мл трубки.
    3. Повторите вышеуказанные шаги для остальных селезенки, с использованием новых пар матовое слайды, 50 мл трубки с питательной среды и ячейки сита.
  6. Добавьте 8 мл холодного питательной среды для каждого из 50 мл пробирки, содержащие splenocytes общим объемом 10 мл. Определите количество клеток на миллилитр, используя Горяева.
  7. Добавьте примерно 1 х 106 клеток/хорошо 6-ну культуры пластин. Добавление ячеек на количество скважин, которые соответствуют количество различных PAMPs используется для эксперимента и включают в себя элемент управления хорошо. Добавьте 3 мл питательной среды или 3 мл вызов среды соответствующих скважин.
  8. Инкубируйте пластины при 37 ° C в 5% CO2 на 3 ч.
  9. Скрип клетки из нижней части хорошо с помощью кончика пипетки 1000 мкл, придает P1000 микропипеткой. Перенесите носитель, содержащий ячейки, используя тот же 1000 мкл накапайте Совет по 15 мл.
  10. Пелле клеток с помощью центрифугирования в 167 x g 5 мин при комнатной температуре. Удалить супернатант и помыть лепешка ячейки с 5 мл ФСБ.
  11. Пелле клетки во второй раз на 167 x g 5 минут, удалить супернатант и 600 мкл буфера lysis клетки Пелле чтобы лизировать клетки. Затем переходите к РНК изоляции.

4. РНК изоляции и синтез cDNA

  1. Изолировать РНК от splenocytes, используя РНК добыча комплект согласно инструкции производителя и выполнять «факультативного» пищеварение ДНК на столбец.
  2. До синтеза cDNA определения концентрации РНК с помощью спектрофотометра microvolume для проверки, что концентрация находится в пределах оптимального диапазона РНК (до 2 мкг) Комплект для синтеза cDNA.
  3. Синтезируют cDNA для каждого из образцов, с помощью обратной транскрипции Кит согласно инструкциям производителя. Используйте для каждого из образцов в томе Общая реакция 20 мкл 10 мкл РНК. В связи с завершением обратной транскрипции (Термоциклер запуска) добавить 20 мкл H2O для каждой реакции.
  4. Постройте стандартные изгибаясь, используя P10 или P20 микропипеткой объединить mRNA от нескольких контрольных образцов (например, 5 мкл от 2 образцов для в общей сложности 10 мкл) в 0,5 мл трубку подготовить cDNA.
    1. Мкл 10 2 x Мастер микс обратной транскриптазы.
    2. В связи с завершением обратной транскрипции мкл 10 H2O к пробке реакции, которая будет служить в качестве начальной концентрации («1») в серии разрежения для стандартной кривой.
    3. Выполните серию десятикратного разрежения (1-10-4), добавив 45 мкл воды с помощью P100 или Р200 микропипеткой в четыре трубы 0,5 мл, 10-1, 10-2, 10-3и 10-4.
      1. Добавить 5 мкл начальной концентрации «1» в первой трубки (10-1) с помощью micropipettor P20, микс, закупорить вверх и вниз несколько раз, затем передача 5 мкл от 10-1 труба в трубу места для 10-2 и перемешать.
      2. Передача 5 мкл с помощью P20 микропипеткой от 10-2 труба в трубу места для 10-3 и перемешать. Передача 5 мкл, используя P20 micropipettor от 10-3 трубки в места для 10-4 трубку и перемешать.

5. количественные полимеразной цепной реакции (ПЦР)

  1. Определите относительную количественный уровень мРНК, ПЦР. В рамках экспериментальной установки выберите «Quantitation – относительная стандартной кривой» и «TaqMan» химия. Изменить громкость реакции до 10 мкл. Введите соответствующую информацию в пластине макет (например, целевых генов, калибровочной кривой, репортер, и т.д.).
  2. Подготовьте реакции, так что она содержит 0.5 мкл пробирного праймер/зонд, 5 мкл ген выражение мастер смеси, H2O 2 мкл и 2,5 мкл cDNA (10-100 нг).
    1. Подготовка мастер смесь путем умножения каждого из предыдущих реагентов (за исключением cDNA) на количество реакций, убедившись в том включать те из стандартной кривой, негативный контроль, выполнение каждой реакции в дубликат и 2 дополнительных реакций, которые будут учитывать для дозирования вариации.
    2. 7.5 Накапайте µL мастер раствора в заранее скважины в 96-луночных реакции табличка с микропипеткой или многоканальные пипетки. Накапайте 2,5 мкл cDNA в соответствующие колодец для неизвестных и стандартов и 2,5 мкл H2O в отрицательный контроль скважины.
    3. Включают праймер/зонд анализов для различных молекулярных часов генов, а также включают assay для внутреннего элемента управления (например, β-миозина).
  3. Для того чтобы определить относительное выражение значения, рассчитать среднее относительное количество для каждой репликации, а затем, для каждого образца, разделите среднее относительное количество для целевых генов, среднее относительное количество для β-миозина.

6. Статистический анализ

  1. С помощью программного обеспечения для статистического анализа, введите данные в программу под опцией статистики столбцов. Выберите односторонний дисперсионный анализ с Дуннетт post hoc тест, чтобы оценить различия между средними значениями выражения гена часы после PAMP вызов против элемента управления.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Мышей были принесены в жертву на ZT13, splenocytes были изолированы и оспорены ex vivo с PAMPs LPS, ODN1826 или HKLM. После 3 h РНК был изолирован, и ПЦР была использована для оценки уровней относительное выражение генов молекулярные часы, будильник, Per2, Dbp и Rev-erbα по сравнению с клетки безнаказанное управления. После PAMP вызов будильник выражение уровни не были значительно отличается от выражения в ячейках элемента управления (...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В рамках этого протокола спектрофотометр microvolume может использоваться для количественного определения и оценки чистоты используется в определении экспрессии генов РНК. Нуклеиновые кислоты поглощают УФ света на 260 Нм, белки обычно поглощают свет в 280 Нм, в то время как другие потенциальные загрязнители, используемые во время процедуры извлечения РНК (например, фенола) обнаруживаются на 230 Нм. Таким образом, путем оценки поглощения () отношение в 260/280 Нм (РНК к белку) и 260/230 Нм (РНК не протеинового за...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Автор не имеет ничего, чтобы раскрыть.

Благодарности

Эта работа была поддержана факультет исследовательских грантов от Колледж искусств и наук Дин отделении университета Хартфорда.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Матовые слайдыFisher12-550-343
Клеточные сетчатые фильтрыFisher22363547
Липополисахарид InvivoGenltrl-eklps
ODN1826InvivoGenTlrl-1826-1
HKLMInvivoGenTlrl-hklm
RPMI 1640Gibco11875-093
PBSGibco20012-043
RNeasy Mini KitQiagen74104 или 74106
Набор ДНКазы без РНКазыQiagen79254
6-луночный планшет для культивирования клетокDenvilleT1006
50 мл пробиркиCorning352070
15 мл пробиркиCorning352097
High Capacity кДНК Набор для обратной транскрипцииThermoFisher4368814
TaqMan Анализ экспрессии генов b-актинThermoFisherMm00607939_s1
TaqMan Анализ экспрессии генов Per2ThermoFisherMm00478113_m1
TaqMan Анализ экспрессии генов Rev-erbaThermoFisherMm00520708_m1
TaqMan Анализ экспрессии генов Bmal1ThermoFisherMm00500226_m1
TaqMan Анализ экспрессии генов DbpThermoFisherMm00497539_m1
аппарат для количественной ПЦР StepOnePlusThermoFisher
TaqMan Gene Expression Master MixThermoFisher4369016
MicroAmp Fast 96-луночная реакционная пластина (0,1 мл)ThermoFisher4346907
Prism 7.0a
Программное обеспечение для статистического анализа

Ссылки

  1. Bell-Pedersen, D., et al. Circadian rhythms from multiple oscillators: lessons from diverse organisms. Nat. Rev. Genet. 6, 544-556 (2005).
  2. Mohawk, J. A., Green, C. B., Takahashi, J. S. Central and Peripheral Circadian Clocks in Mammals. Annu. Rev. Neurosci. 35, 445-462 (2012).
  3. Balsalobre, A., Damiola, F., Schibler, U. A serum shock induces circadian gene expression in mammalian tissue culture cells. Cell. 93, 929-937 (1998).
  4. Yoo, S. -H., et al. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 5339-5346 (2004).
  5. Yamazaki, S. Resetting Central and Peripheral Circadian Oscillators in Transgenic Rats. Science. 288, 682-685 (2000).
  6. Lowrey, P. L., Takahashi, J. S. Genetics of circadian rhythms in mammalian model organisms. Adv. Genet. 74, 175-230 (2011).
  7. Curtis, A. M., Bellet, M. M., Sassone-Corsi, P., O'Neill, L. A. J. Circadian Clock Proteins and Immunity. Immunity. 40, 178-186 (2014).
  8. Keller, M., et al. A circadian clock in macrophages controls inflammatory immune responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 21407-21412 (2009).
  9. Silver, A. C., Arjona, A., Hughes, M. E., Nitabach, M. N., Fikrig, E. Circadian expression of clock genes in mouse macrophages, dendritic cells, and B cells. Brain. Behav. Immun. 26, 407-413 (2012).
  10. Kawai, T., Akira, S. The role of pattern-recognition receptors in innate immunity update on Toll-like receptors. Nat. Publ. Gr. 11, 373-384 (2010).
  11. Marpegán, L., Bekinschtein, T. A., Costas, M. A., Golombek, D. A. Circadian responses to endotoxin treatment in mice. J. Neuroimmunol. 160, 102-109 (2005).
  12. Okada, K., et al. Injection of LPS Causes Transient Suppression of Biological Clock Genes in Rats. J. Surg. Res. 145, 5-12 (2008).
  13. Haimovich, B., et al. In vivo endotoxin synchronizes and suppresses clock gene expression in human peripheral blood leukocytes. Crit. Care Med. 38, 751-758 (2010).
  14. Curtis, A. M., et al. Circadian control of innate immunity in macrophages by miR-155 targeting Bmal1. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 7231-7236 (2015).
  15. Silver, A. C., Arjona, A., Walker, W. E., Fikrig, E. The Circadian Clock Controls Toll-like Receptor 9-Mediated Innate and Adaptive Immunity. Immunity. , (2012).
  16. Gibbs, J. E., et al. The nuclear receptor REV-ERB α mediates circadian regulation of innate immunity through selective regulation of inflammatory cytokines. PNAS. 109, 582-587 (2012).
  17. Zee, P. C., Attarian, H., Videnovic, A. Circadian rhythm abnormalities. Contin. Lifelong Learn. Neurol. 19, 132-147 (2013).
  18. Bovbjerg, D. H. Circadian disruption and cancer: sleep and immune regulation. Brain. Behav. Immun. 17, 48-50 (2003).
  19. Fu, L., Lee, C. C. The circadian clock: pacemaker and tumour suppressor. Nat. Rev. Cancer. 3, 350-361 (2003).
  20. Germain, A., Kupfer, D. J. CIRCADIAN RHYTHM DISTURBANCES IN DEPRESSION. Hum. Psychopharmacol. 23, 571-585 (2008).
  21. Basic Mouse Care and Maintenance. JoVE. , Cambridge, MA. JoVE Science Education Database (2018).
  22. Leary, S., et al. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals : 2013 Edition. AVMA. , (2013).
  23. Silver, A. C. Pathogen-associated molecular patterns alter molecular clock gene expression in mouse splenocytes. PLoS One. , 12-15 (2017).
  24. Silver, A. C., et al. Daily oscillations in expression and responsiveness of Toll-like receptors in splenic immune cells. Heliyon. , 00579(2018).
  25. Flow-cytometric Anal. 11 strains mice. MPDJaxpheno6. Mouse Phenome Database web Resour. (RRIDSCR_003212). Jackson Lab. , Bar Harb. Maine USA. Available from: https//phenome.jax.org (2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

PAMPLPS ODN1826

Похожие статьи