Методическая статья

Экстракции ДНК высокой пропускной способностью и генотипирования 3dpf личинки у рыбок данио путем отсечения Fin

DOI:

10.3791/58024

⸱

29 июня 2018 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute, 2Department of Biology, University of Ottawa

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Данио рерио были использованы как надежные генетических модельные организмы в биомедицинских исследований, особенно с появлением гена редактирования технологий. Когда личинки фенотипов, как ожидается, добыча и генотип идентификации ДНК может быть сложным. Здесь мы описывают процедуру эффективного генотипирования данио рерио личинок, путем отсечения хвост, 72-h после оплодотворения в кратчайшие сроки.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Данио рерио (Danio рерио) обладают orthologues 84% генов, известно, что связано с заболеваниями человека. Кроме того эти животные имеют короткий поколения время, легко обрабатывать, показать высокий уровень репродуктивного, низкая стоимость и легко поддаются генетических манипуляций путем микроинъекции ДНК в эмбрионов. Последние достижения в гене, инструменты редактирования позволяют точного внедрения мутаций и трансгенов в данио рерио. Моделирование в zebrafish часто заболевание приводит к личиночной фенотипы и ранней смерти, которая может быть сложным для интерпретации если генотипы неизвестны. Это раннее выявление генотипов также является необходимой в экспериментах, требующих объединения образцов, таких, как ген выражение или масс спектрометрии исследования. Однако обширные генотипической проверки ограничено традиционными методами, которые в большинстве лаборатории выполняются только на взрослых рыбок данио или в посмертных личинки. Мы решили эту проблему путем адаптации метод для изоляции ПЦР готовые геномной ДНК от живой данио рерио личинки, которые могут быть достигнуты в кратчайшие сроки 72 ч после оплодотворения (hpf). Это время и экономически эффективные техники, по сравнению с ранее опубликованной генотипирования протокол, позволяет идентификации генотипов из микроскопических плавник биопсии. Плавники быстро регенерировать как развиваются личинки. Затем исследователи способны выбрать и поднять желаемого генотипов к взрослой жизни, используя этот высокой пропускной способностью на основе ПЦР генотипирования процедуры.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Данио рерио (данио рерио) позвоночных организм, широко используется в качестве модели для проведения расследования болезни, а также для Доклинические испытания терапевтических гипотез1,2,3. Эти животные имеют короткий поколения время, легко обрабатывать, показать высокий уровень репродуктивного, низкая стоимость и легко поддаются генетических манипуляций путем микроинъекции ДНК в4эмбрионов. Через все большее развитие Роман трансгенных и Джин редактирования технологии, такие как Цинк-пальцевый nucleases (ZFN)5, Таль как эффекторных Nucleases (Таленс)6,7и кластерные регулярно Interspaced короткие Рецидивирующий повторяет (ТРИФОСФАТЫ) / связанные ТРИФОСФАТЫ 9 (Cas9) системы8, данио рерио poised для того чтобы существенно улучшить понимание некоторых патологических условий. Эти технологии были использованы для создания целевых нокауты в обоих соматических и микрофлорой ячейки в данио рерио, эффективно порождает генетически изменены животных8. Последние в литературе примерами успешного развития генетической модели эпилепсии и метаболических расстройств в zebrafish3,9,10,11,12 .

С прогресс, достигнутый в zebrafish изменения генома быстрый и надежный генотипирования стал неоспоримым тариф ограничивая шаг. Выявление специфических мутаций ДНК, прилегающих к прогнозируемого изменения генома целевой сайт является важным этапом протокола. Традиционно методов генотипирования плавник отсечения, как правило, только при исполнении несовершеннолетних или взрослых рыбок данио. Однако, время, затраченное поднимая данио рерио до зрелого возраста (> 2 месяца) значительно замедляет прогресс в научных исследованиях. Во многих случаях нельзя достичь совершеннолетия за выбивание важно генов (например, в моделировании болезни) или получить из функция мутаций приводит к пагубным фенотипические эффектам. Кроме того несколько анализов требуют объединения личинок, такие как извлечение RNA или метаболита и таким образом включают предварительной идентификации генотипов, которые может быть сложной задачей, когда доступны только пост Специального генотипирования методы. Эти вышеупомянутые примеры подчеркивают важность личиночной генотипирования методов, которые в то же время точного и полного восстановления и нормального развития личинок. Ранние стадии данио рерио генотипирования не представляется в настоящее время широко использоваться; Это отражено в последних публикациях болезни моделей, в которых определяются личиночной генотипов через post-mortem генотипирования, вместо того, чтобы генотипирования до выполнения эксперимента12,,1314. В этом документе стратегия клип личиночной плавник представлены стремилась улучшить генотипирования ранее установленных процедур.

В прошлом стратегии, используя протеиназы K пищеварения генотип живут данио рерио, личинки привели к переменной полимеразной цепной реакции (ПЦР) эффективности15. Хотя более недавно опубликовал микроскопических хвост биопсии технику предоставляется более многообещающие результаты16, мы и другие группы не смогли воспроизвести высокой эффективностью и восстановления ДНК, сообщили авторы. Серьезный удар протокола, описываемого Уилкинсон и др. 16 может быть передача ткани хвост ПЦР-пробирку. Из-за микроскопических размеров трудно обеспечить надлежащим образом собраны и поворотного закупорить плавника. Для решения этого барьера, мы разработали более протокол для генотипирования большого количества личинки живут рыбки данио рерио с почти 100% эффективность9. С помощью microscalpel, кончик плавник хвоста удаляется и помещены на кусок фильтровальной бумаги. Кусок фильтровальной бумаги, содержащий ткань можно легко визуализировать и правильно помещен в ПЦР-пробирку. Затем выполняется геномной ДНК добыча, следуют амплификации PCR региона интерес к генотип образца. Преимущества этого метода включают высокую эффективность ПЦР, низкий уровень ложных положительных и низкой смертности. Кроме того Генотипирование большого количества эмбрионов можно с помощью этого протокола. Протокол, описываемые позволяет плавник отсечения сотен личинок в течение 2-3 ч, используя этот подход и правильной идентификации генотипируемого рыбы и хвост регенерации в течение двух дней.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Процедуры с участием животных темы были утверждены и находятся в соответствии с принципами животных ухода представленной Канадского совета Уход за животными и университета Оттавы комитетов ухода за животными.

1. Подготовка

  1. Подготовьте поверхность рассечения, лентой 9 см Петри блюдо крышкой автоклав лентой по всей внутренней поверхности. Расположите его под микроскопом стерео.
  2. Место 3-5 дней после оплодотворения (dpf) данио рерио личинок в Петри блюдо и анестезировать в мм Tricaine ˜1.5 в 1 x E3 эмбриона СМИ (5 мм NaCl, 0,17 мм KCl, 0,33 мм2CaCl, 0,33 мм MgSO4, pH 7.2).
  3. Отрезали конце кончика пипетки P1000 с парой ножницы или лезвие диаметром 2 мм для размещения 3 Личинки dpf с минимальным стрессом.

2. плавник отсечения личинок данио рерио

  1. Подобрать наркотизированных личинки, с использованием модифицированных микропипеткой P1000 и место данио рерио личинка на ленту позиционируется автоклава на крышке Петри.
  2. Удалите излишки Tricaine решение, окружающих с помощью микропипеткой личинка. Площадь должна быть сухой, как можно успешно раздел и забрать плавников, но все еще мокрой, чтобы обеспечить выживание.
  3. С помощью микро скальпель, хвостовой плавник под микроскопом стерео как указано на рисунке 1, как описано в Уилкинсон et al16секция. Во время разреза Придайте устойчивый понижательное давление на сайте разрыв пигмент хвостового плавника, дистальнее ограничение кровообращения (рис. 1A). Придайте нежное давление, чтобы избежать повреждения хорда.
  4. Визуализации псевдоразреза плавник под микроскопом и положение кусок на вершине кончик microscalpel лезвия (рис. 2A). Место microscalpel, содержащие плавника на поверхность небольшой кусок фильтровальной бумаги.
    Примечание: Из-за присутствия меланоцитов в пересекал ткани, этот шаг позволяет визуализировать плавника как небольшое черное пятно (рис. 2B).
  5. С помощью ножницы и щипчики (рис. 2 c), передачи документ фильтр, содержащий плавник 96-луночных ПЦР пластины, содержащих 25 мкл 50 мм раствора NaOH в колодец (Рисунок 2D).
  6. Подготовьте плоским-96-луночных днище, нумерация также согласно этикетке ПЦР-планшете. С помощью модифицированных P1000 пипетки, заполнены с 200 мкл свежие 1 x E3 эмбриона СМИ, тщательно Соберите личинок данио рерио, с использованием мягкое давление. Отказаться от личинок в культуре ткани 96-луночных пластине, в том же хорошо число как ПЦР пластины (рис. 2е).
  7. Убедитесь, что фильтр бумага хорошо погружен в раствор (Рисунок 2F). Очищайте лезвие microscapel и пинцет между каждого разреза для предотвращения перекрестного загрязнения путем окунать в раствор EtOH 70%. Протрите с чистой бумаги ткани/стереть.
  8. Повторите шаги 2.1-2.7, до тех пор, пока все эмбрионы были обрезаны.
  9. Храните личинки в 96-луночных пластины на 28 ° C, пока не было выявлено генотипов.
    Примечание: Эмбриона СМИ не должны быть изменены, так как протокол могут быть легко завершены в менее чем за 2 дня. Если требуется больше времени, рекомендуется изменение средств массовой информации.

3. геномной ДНК добыча

  1. Уплотнение 96-луночных ПЦР пластины и центрифуги, что образцы на 1000 x g за 1 мин, чтобы убедиться, что все документы фильтр погружен в раствор NaOH.
  2. Для тканей лизиса тепло образцы в Термоциклер на 95 ° C за 5 мин, после охлаждения до 4 ° C на 10 мин.
  3. Добавьте 6 мкл 500 мм трис-HCl, рН 8,0 для каждого образца. Вихрь.
  4. Кратко центрифуга пластину на 1500 x g, за 5 мин при комнатной температуре.
  5. Использование 1.5 мкл ДНК супернатант в реакции PCR.
  6. Подготовьте ПЦР на генотип личинки, как показано в таблице 1-2.
    Примечание: Этот протокол был протестирован для двух приложений: мультиплексной ПЦР-реакции, выявление генотипа, используя Гели агарозы9и гетеродуплексного плавки пробирного (HMA) выявление генотипов с использованием геля полиакриламида электрофореза (страница)17.

4. альтернативные Genomic извлечения с помощью хелатирующий смолы

  1. Полный шаг 2,5, добавив фильтр-бумаги с подстриженными плавника 96-луночных ПЦР-планшете, содержащая 30 мкл 5% Хелатирующие смолы (сополимер стирола и дивинилбензола, содержащие парные иминодиацетатными ионов).
    Примечание: Этот тип смолы обычно используется для подготовки ДНК ПЦР готовы быстро и эффективно18и лизис ткани.
  2. Выполните шаги 2,6-2,8, как указано.
  3. Кратко Центрифугуйте образцы, чтобы убедиться, что все фильтровальная бумага погружен в пределах хелатирующий смолы и уплотнением 96-луночных ПЦР-планшете.
  4. Для тканей лизиса тепло образцы в Термоциклер на 95 ° C в течение 15 мин, после охлаждения до 4 ° C на 10 мин.
    Примечание: Этот шаг позволяет лизис и последующей привязки полярных смолы бусины в клетчатых компонентов ДНК и РНК, остаются в растворе.
  5. Кратко Центрифугуйте образцы гранулы смолы бусины и получить ДНК в подвеске.
  6. Выполните шаги 3,5-3.6 для завершения процедуры генотипирования.

5. применение 1: Мультиплексной ПЦР после анализа геля агарозы

  1. Таблица 1, учреждена мультиплексной ПЦР реакции для включения дискриминацию между гомозиготных мутантов, heterozygotes и личинки WT. Используйте 96-луночных тепловая велосипедист выполнять ПЦР-реакции, используя Велоспорт условий, описанных в таблице 3.
    Примечание: ПЦР-реакции также могут выполняться в любой других обычных ПЦР тепловая велосипедист. Этот пример описывает ПЦР стратегией, используемой пена, и др. 9 для выявления aldh7a1 WT и вставки 5-ВР мутантных аллелей в же мультиплекс реакции.
  2. Подготовить гель агарозы 1% в буфере Борат натрия, окрашенных с 1 x GelRed.
    Примечание: 20 x Борат натрия буферный запас состоит из 40 мл 10 M NaOH, 1800 мл ddH2O, pH скорректирована до 8,5 с 76 г борной кислоты и затем завершить окончательный объем 2 Л с помощью ddH2O.
  3. Побегите гель в буфере Борат натрия 1 x 15 мин на 250 V. Чтобы облегчить этот процесс, если возможно, используйте гель системы, которая совместима с многоканальные пипетки для возможностей выше пропускной способности, уменьшая время для загрузки образцов.
  4. Изображения гель под ультрафиолетовой (УФ) света, чтобы позволить дискриминации различных генотипов.

6. приложения 2: Гетеродуплексного плавки пробирного

  1. Подготовьте страница 12% гели с помощью пластины распорку 1,5 мм и 15-образцы Расчески. Подготовьте две страницы гели, используя 12.21 мл ddH2O, 2.52 мл 10 x трис/Борат/ЭДТА (КЭ), 10 мл 30% акриламида, 250 мкл 10% Аммония пероксодисульфат (APS) и 20 мкл tetramethylethylenediamine (TEMED). Использовать 1 x TBE буфер (0,089 М трис-HCl, 0,089 M борной кислоты и 0,002 М Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА)) как работает буфер.
  2. Тепло продуктов ПЦР на 94 ° C за 5 мин.
  3. Прохладный трубы на льду или в Термоциклер 10 мин при 4 ° C.
  4. Загрузите 10 мкл на ПЦР сэмпл и 8 мкл маркер молекулярного веса.
  5. Запустите страницу на 150 V в 1 x TBE, с использованием системы вертикального электрофореза, за 1 ч или до маркер молекулярного веса почти достигает линии ног стеклянной пластины.
  6. Изображения гель под УФ светом допускать дискриминацию различных генотипов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эффективность протоколироване была продемонстрирована генотипирования потомство гетерозиготных Креста (aldh7a1+/ ot100, здесь показано как aldh7a1+ /-) ()на рисунке 3A- C)9. Мутантный аллель aldh7a1ot100имеет 5-база пара (bp) вставки первого кодирования экзона гена aldh7a1 данио рерио, что приводит к фреймшифт и потери функции из-за р...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Джин, инструменты редактирования применялись точно ввести мутации и трансгенов в zebrafish в последние лет5,6,,78. При выполнении болезни, моделирование в данио рерио, ранних личиночных или несовершеннолетних фенотипов часто наблюдаются9,12,,1314. Представленные здесь...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы хотели бы поблагодарить редких болезней модели и сетевой механизм (RDMM) (финансируется Канадским институтов здравоохранения исследований (КНИИЗ) и геном Канада). CK поддерживается стипендия премии UROP (Университет Оттавы). DLJ поддерживается Ванье Канада Магистратура стипендии. ИАП поддерживается премию докторантура стипендий Канадского институтов здравоохранения исследований (КНИИЗ). Авторы благодарят генетики общества Америки для предоставления разрешения опубликовать этот протокол и использовать адаптация дополнительная цифра 5 от пена, и др.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Чашка ПетриCorning430167
MicroscalpelWorld Precision Instruments500249
СтереомикроскопNikonSMZ1500
Трикаин/этил 3-аминобензоат метансульфонатSigma-AldrichE10521
96-луночный тканевый культуральный планшетCostar3595
96-луночный ПЦР тарелкаFisher14230232
NaOHFisherS25548A 
Трис база Sigma-AldrichT1503
NaClFisherBP358-10
KClSigma-AldrichP3911
MgSO4Sigma-Aldrich230391
5% Chelex 100 натриевая формаSigma-AldrichC7901
GelRed 1xBiotium41003
Борная кислотаSigma-AldrichB6768
Подклеточная система модели 192Bio-Rad 
30 % раствор акриламида/бис, 37,5: 1Bio-Rad 
GoTaq Green Master Mix, 2XPromegaM7123
(одноразовые салфетки Kimwipes®)Sigma-AldrichZ188956
маркер для молекулярного веса 1kb-plus Thermo ScientificSM1343
Вода, не содержащая нуклеаз...Система Sigma-AldrichW4502
Sub-Cell Model 192 (высокопроизводительная система агарозного геля)Bio-Rad 
система вертикального гель-электрофореза Mini-PROTEAN Tetra Cell Био-Рад 
17045081610158 бумажные салфетки 17045081658004

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), (2013).
  2. Stewart, A. M., Kalueff, A. V. Developing better and more valid animal models of brain disorders. Behav Brain Res. 276, 28-31 (2015).
  3. Grone, B. P., Baraban, S. C. Animal models in epilepsy research: legacies and new directions. Nat Neurosci. 18 (3), 339-343 (2015).
  4. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J Vis Exp. (25), e1115(2009).
  5. Doyon, Y., et al. Heritable targeted gene disruption in zebrafish using designed zinc-finger nucleases. Nat Biotechnol. 26 (6), 702-708 (2008).
  6. Bedell, V. M., et al. In vivo Genome Editing Using High Efficieny TALENs. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
  7. Sander, J. D., et al. Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs. Nat Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2012).
  8. Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
  9. Pena, I. A., et al. Pyridoxine-Dependent Epilepsy in Zebrafish Caused by Aldh7a1 Deficiency. Genetics. 207, 1501-1518 (2017).
  10. Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment. Nat Commun. 4, 2410(2013).
  11. Godoy, R., Noble, S., Yoon, K., Anisman, H., Ekker, M. Chemogenetic ablation of dopaminergic neurons leads to transient locomotor impairments in zebrafish larvae. J Neurochem. 135, 249-260 (2015).
  12. Scheldeman, C., et al. Neurobiology of Disease mTOR-related neuropathology in mutant tsc2 zebra fish Phenotypic, transcriptomic and pharmacological analysis. Neurobiol Dis. 108 (September), 225-237 (2017).
  13. Zabinyakov, N., et al. Characterization of the first knock-out aldh7a1 zebrafish model for pyridoxine-dependent epilepsy using CRISPR-Cas9 technology. PLoS One. 12 (10), 1-14 (2017).
  14. Grone, B. P., et al. Epilepsy, behavioral abnormalities, and physiological comorbidities in syntaxin-binding protein 1 (STXBP1) mutant zebrafish. PLoS One. 11 (3), (2016).
  15. Kawakami, K., Hopkins, N. Rapid identification of transgenic zebrafish. Trends Genet. 12 (1), 9-10 (1996).
  16. Wilkinson, R. N., Elworthy, S., Ingham, P. W., van Eeden, F. J. M. A method for high-throughput PCR-based genotyping of larval zebrafish tail biopsies. Biotechniques. 55 (6), 314-316 (2013).
  17. Zhu, X., et al. An efficient genotyping method for genome-modified animals and human cells generated with CRISPR/Cas9 system. Sci Rep. 4, 6420(2014).
  18. Walsh, P. S., Metzger, D. A., Higuchi, R. Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material. Biotechniques. 54 (3), 506-513 (2013).
  19. Ewing, B., Green, P. Basecalling of automated sequencer traces using phred. II. Error probabilities. Genome Res. 8, 175-185 (1998).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи