Method Article

Крупномасштабные трехмерных изображений клеточной организации коры головного мозга мыши

DOI:

10.3791/58027

⸱

September 5th, 2018

 ,  ,  , 
1RIKEN Brain Science Institute, 2Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы опишем процедуру для очистки ткани, люминесцентные маркировки и крупномасштабных изображений мыши мозговой ткани, которая, таким образом, позволяет визуализации трехмерных организации типов клеток коры головного мозга.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Неокортекс млекопитающих состоит из многих типов возбуждающих и ингибирующих нейронов, каждый с конкретными электрофизиологических и биохимических свойств, синаптических связей, и в естественных условиях функции, но их основные функциональные и анатомические плохо понимается Организация от сотовой сети шкалой. Здесь мы описываем метод для трехмерных изображений дневно меченых нейронов через большие участки мозга для расследования кортикального слоя клеточной организации. Конкретные типы нейронов помечены введения флуоресцентных Ретроградная нейрональных Трейсеры или выражением флуоресцентных белков у трансгенных мышей. Блока мозга образцы, например, полушария, готовятся после фиксации, прозрачными с ткани, очистка методов и подвергается флуоресцентный immunolabeling типов конкретных клеток. Большие площади, проверяются с помощью конфокальной или два Фотон Микроскопы, с большого расстояния рабочих целей и моторизованных этапов. Этот метод может решить периодической организации конкретного типа microcolumn функциональных модулей ячейки в коры головного мозга мыши. Процедура может быть полезным для изучения трехмерной сотовой архитектуры в областях различных мозга и других сложных тканей.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Неокортекс млекопитающих состоит из большого числа типов клеток, каждый с картин выражения определенного гена, электрофизиологических и биохимических свойств, синаптических связей, и в естественных условиях функции1,2 ,3,4,5,6,7. Ли эти типы клеток организованы неоднократные структуры был неясным. Корковых столбцы, включая столбцы визуальные ориентации и соматосенсорные бочки, повторили структур, но их клеточной Организации остается неясным8,9. Они присутствуют в конкретных областях, коры и не мозг всей системы.

В слое 5 кортикальное значительное большинство нейронов, подразделяются на четыре основных типа. Основной тип возбуждающих нейронов, югу мозгового проекции нейронов, проекты аксоны подкорковых целей, включая Понс, спинного мозга и четверохолмия и, таким образом, представляет основные корковые выходной путь10. Проекции корковых нейронов, другой основной тип возбуждающих нейронов, иннервируют коры10. Ингибирующих нейронов также содержит два основных класса: выражая Парвальбумин и соматостатина выражая клетки11.

Недавние анализы показывают, что типы четыре ячейки организованы в неоднократных структуры12,,1314. Югу мозгового проекции нейронов12,13,14 и корковые проекции нейронов14 организовать в конкретных microcolumns тип ячейки диаметром 1 – 2 клетки. Парвальбумин выражая и соматостатина выражая клетки выровнять специально с microcolumns югу мозгового проекции нейронов, но не с microcolumns проекции корковых нейронов14. Microcolumns, сами периодически выровнять форма шестиугольная решетка массива14 и присутствуют в нескольких корковых областях, включая визуальные и соматосенсорные мотор районы мыши мозга12,14 и на языке области человеческого мозга13. Нейронов в отдельных microcolumn выставку синхронизированной активности и имеют аналогичные сенсорные ответы14. Эти наблюдения показывают, что слой 5 типов клеток организовать в структуру решетки microcolumn, представляющий первый известный мозг всей Организации повторения функциональных модулей.

Microcolumns имеют радиус около 10 мкм и пространственной периодичности приблизительно 40 мкм. Кроме того параллельно с их апикальных дендритов и изменения в зависимости от их позиции в коре14ориентации microcolumns. Таким образом система microcolumn трудно анализировать с помощью обычных корковых ломтики с типичной толщиной в несколько десятков микрометров. Кроме того анализ периодичности требует трехмерных данных от широкий спектр областей мозга и, следовательно, типичный визуализации области конфокальной микроскопии или в естественных условиях 2-фотонных изображений является слишком узким.

Недавно были разработаны методы для очистки толстые ткани15,16. Здесь мы описываем применение этих методов для получения типов основных клеток мыши кортикальное слоя 5 крупномасштабных, трехмерные изображения, которые составляют систему microcolumn. Subcerebral проекции нейронов помечены путем ретроградного маркировки или выражение расширенной Зеленый флуоресцирующий белок в Панамакс egfp трансгенных мышей12и корковые проекции, которые нейронами помечены путем ретроградного маркировки или выражением tdTomato в Tlx3-cre/Ai9 мышей17. Парвальбумин выражая и соматостатина выражая клетки помечены, иммуногистохимия. Метод (антитела шкалы S) AbScale18 используется для антитело пятная экспериментов, в то время как для других экспериментов используется метод SeeDB (см. глубокие мозга)19 . Эти методы преодоления вышеуказанных трудностей обычных методов обработки изображений и выявить точные клеточной организации слой 514.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все экспериментальные процедуры были одобрены RIKEN Wako животных эксперименты Комитета и Комитета по безопасности RIKEN генетической рекомбинации эксперимент и соответствии организационных руководящих животных зал RIKEN мозга науки Институт.

1. Подготовка изображений камер

  1. Изображения камеры19
    1. Используя Листы резиновые силиконовые, Подготовьте камеру с толщиной около 5 мм и Пол плиты различной толщины. Кроме того готовить Петри с и без низа стекла (рис. 1A).
  2. Разделители фрагментов
    1. Подготовьте распорки для хранения образцов, используя резиновые силиконовые листы толщиной 0,5 мм (рис. 1 c).

2. tracer инъекций

Примечание: Сделать инъекции в Понс (2.1) или четверохолмия (2.2). Инъекции в Понс лейбл югу мозгового проекции нейронов в широкий мозга регионе, включая визуальные и мотор районах, тогда как инъекции в четверохолмия этикетки югу мозгового проекции нейронов в области визуального. Для управления экспериментов придать солевых вместо дневно меченых холеры токсин Субблок б. Для поддержания стерильные условия использования стерилизовать оборудование и резиновые перчатки, очищены с этанолом.

  1. Сделайте инъекции в Понс взрослых мышей.
    1. Нарисуйте 1 мкл дневно меченых холеры токсин Субблок B (25 µг/мкл в PBS) в 26 G Гамильтон шприц.
    2. Поместите насос форсунки на шприц.
    3. Поместите шприц и насос на держатель инструмента манипулятора на стереотаксического инструмента. Наклона манипулятора 12° кзади от вертикальной оси.
    4. Анестезировать мужского или женского пола взрослых мыши (C57BL/6J или Tlx3-cre/Ai9) путем инъекций Пентобарбитал натрия внутрибрюшинно (60 мг/кг массы тела) или управляющими изофлюрановая (2-3%). Подождите, пока мыши делает никакого ответа, когда его хвост ущипнул с щипцами, указав, что мышь полностью под наркозом.
    5. Поместите курсор мыши на стереотаксического инструмента.
    6. Осторожно удалите волосы с помощью лезвия бритвы для предотвращения инфекции и вырезать 10 мм волосистой части головы, так что видны bregma и лямбда. Администрировать 0,1 мл 1% лидокаина с помощью пипетки. Задайте угол головы, регулируя вертикальное положение мундштук стереотаксического инструмента так, что bregma и лямбда имеют тот же z уровень.
    7. Отрегулируйте положение манипулятора, сдвинув ее на стереотаксического инструмента так, что кончик шприца, недалеко от bregma и записать позицию манипулятора. Убрать шприц, перемещая держателя инструмента на манипулятор.
    8. Переместите манипулятор 5,4 мм кзади и 0.4 мм сбоку. Заранее шприц так, что кончик близка точка входа на черепе. Убрать шприц и отметьте точку входа.
    9. На помеченную позицию Просверлите отверстие диаметром около 1 мм.
    10. Вставьте наконечник шприца через отверстие, так, что кончик глубина составляет 6,9 мм больше, чем что измеряется в bregma.
    11. Придать 1 мкл Трейсеры с помощью насоса в 0.2 мкл/мин.
    12. Удалите шприц из мозга.
    13. В случае необходимости, покрытия подвергаются мозга с небольших фрагментов microfibrillar зажим и мгновенного клея.
    14. Промойте подвергаются мозга с помощью солевых поставляется с пипеткой для предотвращения инфекции и шовные волосистой части головы.
    15. Удалите из стереотаксического инструмента мышь. Позволяет мыши, чтобы оправиться от анестезии в инкубаторе на 30 градусов, обычно в течение 1 ч. Не оставляйте мыши без присмотра, до тех пор, пока он сознание достаточно для поддержания грудной recumbency. Возвращение мыши в компании других животных после того, как он полностью выздоровел.
    16. Сохранить мыши для 3-7 дней.
  2. Сделайте инъекции в четверохолмия взрослых мышей.
    1. Подготовка стеклянной пипетки с наконечник диаметром 30-50 мкм.
    2. Подключите стеклянной пипетки к Гамильтон шприцем через пластиковую трубку (рис. 2A).
    3. Заполните Пипетки стеклянные, пластиковые трубки и Гамильтон шприца с жидкостью, парафин.
    4. Поместите насос форсунки на шприц.
    5. Место стеклянной пипетки на манипулятор и наклона манипулятора 60° кзади от вертикальной оси (рис. 2B).
    6. Выполните 2.1.4–2.1.9. Позиция манипулятора-1,4 мм задняя, 0.5 мм сбоку лямбда-выражения.
    7. Место небольшой пластиковый парафин фильм на черепе, а затем положить на него примерно в 1 мкл раствора трассирующими. Быстро вперед стеклянной пипетки и заполнить его с по крайней мере 0.5 мкл раствора трассировщик.
    8. Вставьте стекло пипетки, так что глубина кончик-3,0 мм от поверхности мозга.
    9. Придать 0.5 мкл Трейсеры с помощью насоса в 0.2 мкл/мин.
    10. Пипетки стеклянные удалите из мозга.
    11. Выполните 2.1.13–2.1.16.

3. Фиксация и обрезки

  1. Внутрибрюшинно привнести Пентобарбитал натрия (60 мг/кг массы тела) в мышь (C57BL/6J или Tlx3-cre/Ai9, с или без инъекций трассирующими, как описано в шаге 2. Подождите, пока мыши делает никакого ответа, когда его хвост ущипнул с щипцами, указав, что мышь полностью под наркозом.
  2. Усыпить мыши гуманно, perfusing мыши transcardially20 с 0,9% физиологического раствора.
  3. Исправить мыши20 , perfusing параформальдегида 4% (PFA) в 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,5).
  4. Вырежьте головы с помощью ножниц выставить череп как описано20.
    1. Вырежьте срединной подвергаются черепа с помощью ножниц. Удаление черепа с помощью щипцов.
    2. Если необходима маркировка позиции bregma и лямбда, сначала удалите одно полушарие черепа. Вставьте тонкий вольфрамовый иглы в мозг на позиции bregma и лямбда на череп, оставаясь на мозг, а затем удалите оставшиеся черепа.
      Примечание: Мозг может храниться в PBS на 4 градусов.
  5. Чтобы выполнить антитело пятная ингибирующих нейронов, нарежьте ломтиками образцов мозга.
    1. Поместите образцы мозга на vibratome.
    2. Нарезать ломтиками до 500 мкм толщиной в PBS при комнатной температуре и перейдите к шагу 5 (метод elAbSca).
  6. Если Пятнать антитела является ненужной, отделка образец мозг блокирует (толщиной до 3 мм) с помощью лезвия бритвы (рис. 3) и перейдите к шагу 4 (метод SeeDB).
    Примечание: Мозг может храниться в PBS на 4 ° C после резки или обрезки. SeeDB метод является предпочтительным при Пятнать антитела не является необходимым, поскольку он требует меньше времени, чем метод elAbSca.

4. Очистка без антитело пятная (метод SeeDB)

  1. Передача образца с помощью шпателя до 50 мл пластиковая трубка, содержащая 20 мл 0,5% α-thioglycerol и 20% (w/v) фруктозы и проинкубируйте 4 ч с нежным тряску при комнатной температуре.
  2. Передача образца с помощью шпателя до 50 мл пластиковая трубка, содержащая 20 мл 0,5% α-thioglycerol и 40% (w/v) фруктозы и проинкубируйте 4 ч с нежным тряску при комнатной температуре.
  3. Передача образца с помощью шпателя до 50 мл пластиковая трубка, содержащая 20 мл 0,5% α-thioglycerol и 60% (w/v) фруктозы и проинкубируйте 4 ч с нежным тряску при комнатной температуре.
  4. Передача образца с помощью шпателя до 50 мл пластиковая трубка, содержащая 20 мл 0,5% α-thioglycerol и 80% (w/v) фруктозы и проинкубируйте 12 ч с нежным тряску при комнатной температуре.
  5. Передача образца с помощью шпателя до 50 мл пластиковая трубка, содержащая 20 мл 0,5% α-thioglycerol и 100% (w/v) фруктозы и проинкубируйте 12 ч с нежным тряску при комнатной температуре.
  6. Передача образцов, с помощью шпателя для пластиковый Тюбик 50 мл, содержащие 20 мл 0,5% α-thioglycerol и 80,2% фруктозы (w/w) и проинкубируйте 24 ч с нежным тряску при комнатной температуре.
    Примечание: Обработка образца тщательно, чтобы держать деформаций как можно меньше. Не Проинкубируйте образцы дольше, чем указано, как образцы могут быстро стать непрозрачным.
  7. Внедрите выборку в тепловизионные камеры, заполненные раствором фруктозы 80,2% (рис. 1B). При необходимости, исправьте образца, поставив небольшие кусочки резиновый клей вокруг. Если Палата является слишком глубоко, положить Пол пластины в камере до размещения образцов.
  8. Поместите Петри с стеклянной крышкой на тепловизионные камеры и положить воду в блюдо и изображения с помощью конфокальный или два Фотон микроскопии с водой погружение долгий расстояние цель. Волны возбуждения и выбросов фильтры описаны в таблице 1. При необходимости, используйте моторизованного столика.

5. Очистка с антитело пятная (метод elAbSca)

  1. Подготовка реагентов, как описано в таблице 2.
  2. Передача с помощью шпателя до 5 мл пластиковая трубка, содержащая 4 мл раствора Sca/eS0 ломтиками и проинкубируйте 12 h с нежным тряску при 37 ° C (рис. 4B).
  3. Удаление решения из трубки с помощью пипетки и добавить 4 мл раствора Sca/eA2 и инкубации срезов для 36 h с нежным тряску при 37 ° C.
  4. Удаление решения из трубки с помощью пипетки и добавить 4 мл раствора Sca/eB4 и инкубации срезов для 24 h с нежным тряску при 37 ° C.
  5. Удаление решения из трубки с помощью пипетки и добавить 4 мл раствора Sca/eA2 и инкубации срезов для 12 h с нежным тряску при 37 ° C.
  6. Удаление решения из трубки с помощью пипетки и добавить 4 мл PBS и инкубации срезов для 6 h с нежным тряску при комнатной температуре.
  7. Осторожно удалите кусочками по 2 мл пластиковых труб, с помощью шпателя.
  8. Проинкубируйте с первичных антител (Таблица 3) в 1 мл AbScale решения для 48-72 ч при 37 ° C (рис. 4 c) с нежным встряхивания.
  9. Осторожно удалите ломтики в 5 мл пластиковых труб, с помощью шпателя.
  10. Инкубируйте в 4 мл AbScale решения для 2 h 2 раза при комнатной температуре с нежным встряхивания.
  11. Осторожно удалите кусочками по 2 мл пластиковых труб, с помощью шпателя.
  12. Проинкубируйте с дневно меченых вторичные антитела (Таблица материалов, 1: 100) в 1 мл AbScale решения для 48 ч при 37 ° C с нежным встряхивания.
  13. Тщательно удалить фрагменты с помощью шпателя до 5 мл пластиковая трубка, содержащая 4 мл раствора AbScaле и инкубации срезов для 6 h с нежным тряску при комнатной температуре.
  14. Удаление решения из трубки с помощью пипетки и добавить 4 мл раствора AbScaле и инкубации срезов для 2 h 2 раза с нежным тряску при комнатной температуре.
  15. Удаление решения из трубки с помощью пипетки и добавить 4 мл 4% PFA и инкубации срезов для 1 h с нежным тряску при комнатной температуре.
  16. Удаление решения из трубки с помощью пипетки и добавить 4 мл PBS и инкубации срезов для 1 h с нежным тряску при комнатной температуре.
  17. Удаление решения из трубки с помощью пипетки и добавить 4 мл раствора Sca/eS4 и инкубации срезов для 12 h с нежным тряску при 37 ° C.
  18. Поместите прокладку на стеклянное скольжение и место ломтики в распорку и погружать ломтики Sca/eS4 раствором. Уплотнение распорку с покровным стеклом (рис. 1 d).
  19. Положите воду на Стекло покровное и изображения с помощью конфокальный или два Фотон микроскопии с водой погружение долгий расстояние цель. При необходимости, используйте моторизованного столика.
    Примечание: Проверьте ли глубокой части образца помечены аналогично поверхностных частей для подтверждения отсутствия значительных маркировки уклоном.
    Примечание: Проникновение протестированных антител описан в таблице 3.

6. Определение положения ячейки

  1. Для каждой позиции в отсканированные изображения Рассчитайте значения корреляции с помощью трехмерного изображения фильтр14 (Рисунок 5A-5D).
  2. Определите позиции вершин значение корреляции (рис. 5 d).
  3. Исследуйте изображения вокруг вершины для обнаружения ячеек (Рисунок 5E).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы помечены корковых проекции нейронов выражением tdTomato в Tlx3-cre/Ai9 трансгенных мышей и визуализированы югу мозгового проекции нейронов путем впрыскивать Ретроградная трассировщик CTB488 в Понс. Левое полушарие мозга был подвергнут к методу SeeDB и сканирование с помощью двух Фотон микроскоп оснащен-погружения в воду долгий расстояние цель (25 X, н.а. 1.1, рабочее расстояние 2 мм) и моторизованного столика. Стек 401 изображений (512 x 512 пикселов; размер пикселя =...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы представили процедуры для получения крупных трехмерные изображения клетки конкретного типа организации типов основных клеток мыши кортикальное слоя 5. По сравнению с обычных ломтик окрашивание, метод является более полезным в определении трехмерной Организации коры головного мозга. Этот метод позволяет захвата изображений из более широких и более глубоких зонах мозга по сравнению с типичными в естественных условиях 2-Фотон микроскопии или обычных confocal микроскопии и, таким образом, можно разрешить всесторо...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Atsushi Miyawaki и Хироси Хама за их советы по AbScale эксперименты, Чарльз Yokoyama для редактирования рукописи, Эрико Ohshima и Миюки Кишино для их технической помощи. Эта работа была поддержана исследовательских фондов от RIKEN т.г. и дотаций для научных исследований от министерства образования, культуры, спорта, науки и техники (МПКСНТ) Японии т.г. (инновационных областей «Мезоскопических Neurocircuitry»; 22115004) и С.С. (25890023).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Трансгенные мыши Crym-egfpMMRRC012003-UCD
Tlx3-cre трансгенные мышиMMRRC36547-UCD
ROSA-CAG-flox-tdTomato мышиJackson LaboratoryJAX #7909
Лист из силиконовой резиныAS ONE6-611-01толщина 0,5 мм
Лист из силиконовой резиныAS ONE6-611-02Толщина 1,0 мм
Силиконовый резиновый листAS ONE6-611-05толщина 3,0 мм
Чашки ПетриFalcon351008
Cover glassМацунамиC022241
Холерный токсин субъединица B (рекомбинантный), Alexa Fluor 488 конъюгатInvitrogenC22841
Холерный токсин субъединица B (рекомбинантный), Alexa Fluor 555 конъюгатInvitrogenC22843
Субъединица холерного токсина B (рекомбинантная), Alexa Fluor 594 конъюгатInvitrogenC22842
Холерный токсин субъединица B (рекомбинантная), Alexa Fluor 647 конъюгатInvitrogenC34778
26 г Гамильтон ШприцHamilton701N
Инжекторный насосKD ScientificKDS 310Pons Инъекционный
насосKD ScientificKDS 100Superior colliculus Инъекционный
манипуляторNarishigeSM-15
Пентобарбиталнатрия Kyoritsu SeiyakuСомнопентилизофлуран
Pfizer
ЛидокаинAstraZenecaКсилокаин для инъекций 1% с эпинефрином
DrillToyo AssociatesHP-200
Avitene microfibrillar hemostatDavol Inc1010090
AlonalfaDaiichi-SankyoAlonalpha A
Хирургический шелкEthiconK881H
ИнкубаторUVPHB-1000 Гибридизатор
Стеклянная пипеткаDrummond Scientific Company2-000-075
Съемник электродовSutter Instrument CompanyP-97
Парафин жидкий, легкийNacalai tesque26132-35
Физиологический растворOtsuka1326
ПараформальдегидNacalai tesque26126-54
Вольфрамовая иглаInter medicalΦ 0,1 *L200 мм
ВибратомLeicaVT1000S
50 мл пластиковая трубкаFalcon352070
&альфа;-тиоглицеринNacalai tesque33709-62
D(-) ФруктозаNacalai tesque16315-55
BluTackBostikCKBT-450000
Двухфотонный микроскопNikonA1RMP
Водно-иммерсионные объективы для большого рабочего расстоянияNikonCFI Apo LWD 25XW, NA 1.1, WD 2 мм
Водоиммерсионные объективы для большого рабочего расстоянияNikonCFI LWD 16XW, NA 0.8, WD 3 мм
Моторизованный столикCOMSPT100C-50XY
ФильтрSemrockFF01-492/SP-25
ФильтрSemrockFF03-525/50-25
ФильтрSemrockFF03-575/25-25
ФильтрSemrockFF01-629/56
ФильтрChromaD605/55m
5 мл пластиковая трубкакак одинvio-5B
2 мл пластиковая трубкаEppendorf 
МочевинаNacalai tesque35905-35
Triton X-100Nacalai tesque35501-15
GlyserolSigma-aldrich191612
D(-)-сорбитWako191-14735
Метил-&бета;-циклодекстринТокийская химическая промышленностьM1356
γ- ЦиклодекстринWako037-10643
N-ацетил-L-гидроксипролинОсновные активные вещества кожи33996-33-7
DMSONacalai tesque13445-45
Бычья сыворотка АльбуминSigma-aldrichA7906
Tween-20 (1,1 г/мл)Nacalai tesque35624-15
Козий антимышиный IgG (H+L) Перекрестная адсорбция вторичная Антитело, Alexa Fluor 555InvitrogenA21422
Козье антитело против кролика IgG (H+L) Перекрестно-адсорбированное вторичное антитело, Alexa Fluor 555InvitrogenA21428
Козье антитело против мыши IgG (H+L) Перекрестно-адсорбированное вторичное антитело, Alexa Fluor 647InvitrogenA21235
Козье антитело против мыши IgG (H+L) с высокой степенью перекрестной адсорбции, Alexa Fluor 488InvitrogenA11029
Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Высокоадсорбированное вторичное антитело, Alexa Fluor 488InvitrogenA21206
Конфокальный микроскопOlympusFV1000
Водно-иммерсионные объективы для большого рабочего расстоянияOlympusXLUMPLFLN 20XW, NA 1.0, WD 2 мм
Anti-NeuNMilliporeMAB377
Anti-NeuNMilliporeABN78
Anti-CTIP2Abcamab18465
Anti-Statb2Abcamab51502
Anti-GAD67MilliporeMAB5406
Anti-GABASigmaA2052
Anti-ParvalbuminSwan235
Anti-ParvalbuminFrontier InstitutePV-Go-Af460
Анти-парвальбуминSigmaP3088
Анти-парвальбуминAbcamab11427
Анти-соматостатинPeninsula LaboratoriesT-4103
Анти-c-FosCalbioChemPC38
0030120094

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lein, E. S., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445 (7124), 168-176 (2007).
  2. Defelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nature Reviews Neuroscience. 14 (3), 202-216 (2013).
  3. Jiang, X., et al. Principles of connectivity among morphologically defined cell types in adult neocortex. Science. 350 (6264), aac9462(2015).
  4. Sorensen, S. A., et al. Correlated gene expression and target specificity demonstrate excitatory projection neuron diversity. Cerebral Cortex. 25 (2), 433-449 (2015).
  5. Zeisel, A., et al. Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq. Science. 347, 1138-1142 (2015).
  6. Tasic, B., et al. Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics. Nature Neuroscience. 19 (2), 335-346 (2016).
  7. Zeng, H., Sanes, J. R. Neuronal cell-type classification: Challenges, opportunities and the path forward. Nature Reviews Neuroscience. 18 (9), 530-546 (2017).
  8. Horton, J. C., Adams, D. L. The cortical column: a structure without a function. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 360 (1456), 837-862 (2005).
  9. Costa, N. M., Martin, K. A. C. Whose cortical column would that be? Frontiers in Neuroanatomy. 4, Article 16 (2010).
  10. Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R. L., Macklis, J. D. Neuronal subtype specification in the cerebral cortex. Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 427-437 (2007).
  11. Hioki, H., et al. Cell type-specific inhibitory inputs to dendritic and somatic compartments of parvalbumin-expressing neocortical interneuron. Journal of Neuroscience. 33 (2), 544-555 (2013).
  12. Maruoka, H., Kubota, K., Kurokawa, R., Tsuruno, S., Hosoya, T. Periodic organization of a major subtype of pyramidal neurons in neocortical layer V. Journal of Neuroscience. 31 (50), 18522-18542 (2011).
  13. Kwan, K. Y., et al. Species-dependent posttranscriptional regulation of NOS1 by FMRP in the developing cerebral cortex. Cell. 149 (4), 899-911 (2012).
  14. Maruoka, H., Nakagawa, N., Tsuruno, S., Sakai, S., Yoneda, T., Hosoya, T. Lattice system of functionally distinct cell types in the neocortex. Science. 358 (6363), 610-615 (2017).
  15. Treweek, J. B., Gradinaru, V. Extracting structural and functional features of widely distributed biological circuits with single cell resolution via tissue clearing and delivery vectors. Current Opinion in Biotechnology. 40, 193-207 (2016).
  16. Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical Principles in Tissue Clearing and Staining Protocols for Whole-Body Cell Profiling. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32 (1), (2016).
  17. Gerfen, C. R., Paletzki, R., Heintz, N. GENSAT BAC cre-recombinase driver lines to study the functional organization of cerebral cortical and basal ganglia circuits. Neuron. 80 (6), 1368-1383 (2013).
  18. Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
  19. Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).
  20. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).
  21. Kim, S. -Y., et al. Stochastic electrotransport selectively enhances the transport of highly electromobile molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (46), E6274-E6283 (2015).
  22. Murray, E., et al. Simple, scalable proteomic imaging for high-dimensional profiling of intact systems. Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).
  23. Ke, M. T., et al. Super-resolution mapping of neuronal circuitry with an index-optimized clearing agent. Cell Reports. 14 (11), 2718-2732 (2016).
  24. Lee, E., et al. ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging. Scientific Reports. 6, 18631(2016).
  25. Renier, N., et al. Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
  26. Kubota, S. I., et al. Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution. Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).
  27. Li, W., Germain, R. N., Gerner, M. Y. Multiplex, quantitative cellular analysis in large tissue volumes with clearing-enhanced 3D microscopy (Ce3D). Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (35), E7321-E7330 (2017).
  28. Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C. C., Gentleman, S. M. Free of acrylamide sodium dodecyl sulphate (SDS)-based tissue clearing (FASTClear): a novel protocol of tissue clearing for three-dimensional visualization of human brain tissues. Neuropathology and Applied Neurobiology. 43 (4), 346-351 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Three dimensional ImagingMouse NeocortexFluorescent LabelingTissue ClearingConfocal MicroscopyTwo photon MicroscopyRetrograde TracersTransgenic MiceImmunolabelingMicrocolumn Organization

Related Articles