Методическая статья

Моделирование синаптических микросхемы с 3D Cocultures астроциты и нейроны от человеческих плюрипотентных стволовых клеток

DOI:

10.3791/58034

⸱

16 августа 2018 г.

 ,  , 
1Center for Neuroregeneration, Department of Neurosurgery, Houston Methodist Research Institute

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе мы стремимся, чтобы описать воспроизводимый метод для объединения отделить человеческих плюрипотентных стволовых клеток получены нейронов и астроциты вместе в 3D шар cocultures, поддержание этих сфер в Свободный плавающий условиях и впоследствии измерение активности синаптических цепи сфер с иммуноанализа и многоэлектродный массив записей.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Барьер для нашего понимания того, как различные типы клеток и сигналы способствует синаптических цепи функции является отсутствие соответствующих моделей для изучения человеческого мозга. Одной из новых технологий для решения этой проблемы является использование три трехмерные (3D) Нейронные клеточных культур, называется «organoids» или «сфероидов», для долгосрочного сохранения включая молекулы внеклеточного адгезии межклеточных взаимодействий. Однако эти системы культуры, много времени и не систематически сгенерированный. Здесь мы подробно метод быстро и последовательно производить 3D cocultures нейронов и астроциты от человеческих плюрипотентных стволовых клеток. Во-первых, предварительно дифференцированной астроциты нейрональных прародителями отделить и рассчитывал. Далее, ячейки объединяются в сфере формирования блюда с Ро-киназы ингибитора и на конкретные показатели производить сферах воспроизводимость размеров. После нескольких недель культуры как плавающий сферы cocultures («астероиды») наконец секционного для иммуноокрашивания или покрытием на многоэлектродный массивы для измерения синаптических плотность и прочность. В целом ожидается, что этот протокол будет выход 3D нейронных сфер, которые отображают зрелых клеток тип ограничен маркеры, формируют функциональные синапсов и проявлять спонтанные синаптических сетевой всплеск активности. Вместе Эта система позволяет наркотиков скрининг и расследования механизмов болезни в более подходящие модели по сравнению с монослоя культур.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Астроциты являются очень обильные глиальных клеток типа в пределах центральной нервной системы (ЦНС) с целым рядом функциональных обязанностей за пределами структурной поддержки. Через секрецию растворимых synaptogenic факторов и компонентов внеклеточного матрикса (ECM) астроциты помощи в создании и кластеризации зрелых синапсов во время развития1. Они также играют важную роль в поддержании здоровья и пластичности синапсов через внеклеточных сигналов2,3,4,5и способствуют долгосрочной стабильности гомеостаза среды, регулируя внеклеточного калия и глутамата, а также секрецию энергетических субстратов и СПС6,,78. Наконец они могут способствовать синапсах, воздействуя на внесинаптического течения9и может косвенно влиять на активность через другие типы клеток, таких как содействие миелинизации10. Что важно потому что аномалий или дисфункции астроциты может привести к много нервной синдромы и взрослых невропатология, существует очевидная необходимость включить астроциты наряду с нейронов в инженерии нейронных сетей в целях улучшения модели эндогенного мозга окружающей среды. Астроциты является неотъемлемой характеристикой является их способность динамического взаимодействия формы с нейрональных синапсах1,,1112. В отсутствие глии нейроны образуют ограниченное количество синапсов, которые в целом также не хватает функциональной зрелости13.

Человека астроциты морфологических, транскрипционный анализ и функциональные характеристики отображения — например увеличение размера и сложности ветвления, а также вегетационных генов — что не изъятый в грызунов12,14, 15. В результате исследования использования человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSC)-производных нервные клетки получили широкое признание как средство изучения заболеваний ЦНС в пробирке при разработке Роман терапии, травмы модели и культура парадигмы16 ,17. Кроме того hPSCs разрешения на изучение человека синапса формирования и функции без необходимости в основной ткани18,19.

Барьер для нашего понимания того, как различные типы клеток и сигналы способствует синаптических цепи функции является отсутствие соответствующих моделей человеческого мозга. Существует необходимость для соответствующей платформы для резюмировать его синаптических сетей с высокой точностью и воспроизводимостью. Недавно, интерес возник в производстве систем 3D культуры (широко известный как «organoids», «сфероидов», или «мини-мозги»)20 для моделирования сложных трехмерных (3D) структур на сотовые и макро уровнях. 3D культуры систем сохраняют ECM и ячеек взаимодействия, которые обычно отсутствуют или ограниченные во время типичного 2D coculture парадигмы21,22. Обилие методы существуют для культивирования 3D нейронных сфероидов23,24,25; Однако, многие требуют длительных культуры периодов (месяцев до лет) для спонтанного развития и сохранения слоя, с пользователем выставке очень мало контроля над выходных данных.

Здесь мы иллюстрируем систематический способ быстро и последовательно биоинженер Нейронные взаимодействия среди нескольких типов клеток (предварительно дифференцированной нейронов и астроциты) полученных от hPSCs путем сборки клеток в сфере cocultures («астероиды»)26 , пилки морфологических сложности конкретного человека в 3D. Этой высокой плотности нервная система генерирует равномерно рассеяны нейронных подтипы, которые взять на зрелых свойств с течением времени и может быть показан или assayed в духе высокой пропускной способности. Мы показываем, в первый раз, что человека астроциты побудить синаптических сетевой всплеск активности в этих 3D cocultures. Кроме того этот протокол является легко адаптируется для создания сферы разных размеров, использовать клетки, указанный для различных региональных тождества ЦНС и для изучения взаимодействия нескольких других типов клеток по желанию.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. клетки культуры и подготовка реагента

Примечание: Протоколы в этом разделе написаны в том порядке, в котором они появляются в протоколе дифференциации (раздел 2). Смотрите Таблицу материалов для материалов и Каталог номеров.

  1. Подготовьте пластины с покрытием для клеточной культуры.
    1. Разбавьте раствор для нанесения покрытия внеклеточного матрикса (ECM) с СМИ в среде DMEM/F12 подготовить 1 мг/мл, раствор. Аликвота разреженных ECM складе решение в 30 конические трубы 3 мл и сразу же хранить в-20 ° C. Для рабочего раствора Ресуспензируйте 3 мл бульона ECM в 33 мл предварительно охлажденные DMEM/F12 СМИ, в результате чего общий объем 36 мл для концентрации 80 мкг/мл.
    2. Слой 1 мл на хорошо 6-ну клетки культуры плиты с ECM рабочего раствора. Добавьте дополнительные 1 мл DMEM/F12 на колодец (при необходимости) для обеспечения полного охвата поверхности хорошо. Разрешить покрытием ячейки 6-ну культуры пластин сидеть при комнатной температуре по крайней мере 1 час перед использованием.
      Примечание: Пластины с покрытием может храниться в инкубаторе или при температуре 4 ° C на срок до 2 недель.
  2. Подготовьте СМИ рецептуры, факторы роста и малых молекул.
    1. Подготовить 500 мл человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSC) средний27, добавьте 20 x и 500 x добавки в соответствии с инструкциями производителей.
    2. Чтобы подготовить 500 мл нейронных среды (Нм), добавьте гепарина конечная концентрация 2 мг/мл, 1 x антибиотик/противогрибковое раствора, дополнение 1 x B27 или 1 x N2 дополнение к 500 мл бутылка DMEM/F12 с L-глютамин добавки как ранее подробные28.
    3. Подготовить 10 мм (1, 000 x) сток решение Ро-киназы ингибитора Y27632 (Y), добавить 10 мг порошка в 3 мл-фосфатный буфер (PBS). Фильтр стерилизовать, Алиготе и хранить при температуре от-20 ° C. Использовать на 10 мкм рабочие концентрации в средствах массовой информации.
    4. Подготовить 20 мм (10, 000 x) сток раствор SB431542, добавить 10 мг порошка в 1,3 мл диметилсульфоксида (ДМСО). Подготовить 2 мм (1, 000 x) сток раствор DMH1, добавить 10 мг порошка в 13,1 мл ДМСО. Фильтр стерилизовать, Алиготе и хранить для каждого решения, при-20 ° C. Используйте каждый на 2 мкм рабочие концентрации в средствах массовой информации (Нм + SB431542 + DMH1).
      Примечание: Этот протокол рекомендует 2 мкм рабочей концентрации обоих SB431542 и DMH1 основаны на наши замечания и сообщения от других29 , заявив, что эта концентрация эффективно способствует нейронной индукции от hPSCs. Более высокие концентрации были также сообщил30. Кроме того с альтернативных средств массовой информации, она также было показано что малые молекулы не являются необходимыми для высокой нейронной преобразования31. Таким образом рабочие концентрации будет варьироваться в зависимости от альтернативных клетки культуры средах, и оптимальной концентрации должна быть проверена отдельных исследователей.
    5. Для подготовки отдельных 100 мкг/мл (10, 000 x) акций решения эпидермального фактора роста (EGF) и фактор роста фибробластов-2 (FGF2), добавить 1 мг в 10 мл PBS + 0.1% BSA. Аликвота EGF и FGF2 складе решения в 50 мкл аликвоты и хранить при температуре-80 ° C. Использование 10 нг/мл концентрация рабочих в средствах массовой информации; например, добавить 5 мкл EGF и 5 мкл FGF2 до 50 мл Нм (Нм + EGF + FGF2).
    6. Подготовить раствор Доксициклина гидрохлорид (Dox), сначала растворить порошок в ДМСО до 100 мг/мл и хранить при температуре от-20 ° C. Далее, разбавить его сделать 2 мг/мл (1, 000 x) сток решение в PBS и хранить при температуре от-20 ° C. Использовать на 2 мкг/мл концентрация рабочих в средствах массовой информации; например, добавьте 50 мкл Dox до 50 мл Нм (Нм + Dox).
      Примечание: Повторно не замерзают решения после оттаивания.

2. поколение нейронных подтипы из индуцированных плюрипотентных клеток человека (hPSCs)

Примечание: Все клеточных культур следует сохранить в инкубаторе с 5% CO2 при 37 ° C. Эти культуры поддерживаются на номер кислорода уровнях, хотя более низкого уровня могут быть использованы.

  1. Создание и поддержание экзоцитоз прародителями (hAstros) из hPSCs.
    Примечание: Этот раздел предоставляет краткий и упрощенный дифференциации протокол. Для получения подробного описания (с формирования embryoid тела, розетка отбора и региональных патронирования шаги) относятся к ранее описанных протокол28 (рис. 1A, пунктир зеленом поле).
    1. Семя кластеры hPSCs (Рисунок 1B) на ECM-покрытием 6-ну плиты (см. шаг 1.1) с 2 мл на хорошо hPSC средний + Y. Кормите стволовые клетки каждый день до тех пор, пока они являются около 50% вырожденная и разделить при необходимости.
      1. Чтобы разделить hPSCs, добавьте 1 mL реагента, пассированый скважин и аспирационная после того, как клетки инкубировать 1 мин при комнатной температуре в течение 5 минут, добавляют 1 мл hPSC среды и разделить агрегаты 1:10 на новые ECM-покрытием скважин в 2 мл на хорошо hPSC средний + Y.
    2. Сохранить стволовые клетки, до тех пор, пока они являются около 50% притока, то средства массовой информации изменения в Нм + SB431542 + DMH1, с тем чтобы побудить нейронных дифференциации (день 0). Когда клетки являются около 95% притока, разделить 1:6 на новые ECM-покрытием скважины в той же среде.
    3. На 14 день разбить ячейки с отряд решение и передача-покрытием колба с Y поощрять формирование агрегатов.
      Примечание: Дополнение Y используется для содействия ячейку выживания и сферы образования, но не включается во время каждого канала.
    4. Для генерации нейрональных прародителями и нейронов (hNeurons) Используйте эти клетки день-14, как описано ниже. Кроме того используют эти клетки в позднее время точках монослоя или сфере культур перед нейрональных созревания происходит или глиогенез начинается.
      Примечание: По умолчанию этот протокол производит спинной корковых астроциты. Однако экзоцитоз подтипы регионарно задается путем добавления кучность morphogens при желании28,32,33. Ретиноевой кислоты (RA) могут быть добавлены к caudalize клетки в спинной фенотипы, в то время как Еж Соник (ТСС), сглаживается агонистов (SAG), или purmorphamine будет производить вентральной фенотипов.
    5. Для поколения экзоцитоз прародителями и астроциты в спонтанно формируется 3D агрегатов (hAstrospheres) перейдите в Нм + EGF + FGF2 и кормить еженедельно (или по мере необходимости для обеспечения стабильного рН) как ранее подробные34.
      1. Аккуратно отделить hAstro агрегатов с отрядом решения когда темно центров появляются и удалить сфер, которые спонтанно прикрепить. Перерыв сферах аккуратно один раз в неделю для поддержания сфера здоровья и избежание некротические ядер.
        Примечание: Не превышает 5 минут лечения с решением отряда.
      2. После 4-6 месяцев экспансии, подтвердить личность клеток и либо заморозить в криоконсервирования средний (согласно инструкциям производителя) или альтернативных хранения условий для долгосрочного сохранения в жидком азоте или использовать немедленно для эксперименты.
    6. Чтобы разморозить замороженные запас hAstrospheres, быстро разморозить флакон при комнатной температуре, передачи содержимого в пустой 15 мл конические пробки и центрифуги на 300 x g за 1 мин тщательно аспирационная супернатанта, мыть с DMEM/F12 и повторите для в общей сложности два мыть шаги. Добавить в настой T25 с общим объемом 6 мл Нм, EGF + FGF2 + Y (или масштабировать при необходимости).
  2. Создание и поддержание индуцибельной нейронов (iNeurons) из hPSCs.
    1. Семя трансгенных hPSCs (с трансген стабильной доксициклин индуцибельной neurogenin 235) на ECM-покрытием 6-ну пластины с 2 мл hPSC средний + Y на хорошо (как описано выше, для не трансгенных линий). Подача каждый день с 2 мл СМИ на хорошо, пока они не готовы поднять на 70% confluency. Разбиение ячеек, как описано в пункте 2.1.2.
    2. Когда клетки являются около 35% вырожденная, добавить Нм + Dox побудить дифференцировку в iNeurons. Сохранить как монослойном культивировании с Нм + Dox за 2 дня перед переходом к шагу 3.2.
      Примечание: Клетки будет переход в нейрональных прародителями но не будет еще продлить невритов (рис. 1 c).

3. Подготовка и поддержание 3D сфере Cocultures

  1. Отделить hAstros от 3D агрегатов в суспензии (как описано в шаге 2.1.5.1).
  2. Отделить hNeurons или iNeurons от 2D монослоя.
    1. Извлеките из 6-ну пластины и добавьте 500 мкл раствора отряд в каждый хорошо содержащие монослоя культур. Инкубируйте при 37 ° C за 5 минут аккуратно добавить 2-3 мл DMEM/F12 для удаления вложенных клеток.
    2. Собирать клетки и СМИ в 15 мл Конические трубки и центрифуги на 300 x g за 1 мин аспирата супернатанта, добавьте 1 mL свежих средств массовой информации и Пипетка вверх и вниз осторожно с 1000 мкл микропипеткой достичь одну ячейку подвеска.
  3. Формы 3D шары с помощью микрорезервуар культуры пластин.
    1. Подготовьте пластины, добавив 0,5 мл раствора анти соблюдение ополаскивания для каждой скважины микрорезервуар пластины. Центрифуга пластины на 2000 x g 5 мин аспирата промывной раствор, добавьте 1 mL DMEM/F12 для каждой хорошо помыть, и аспирационная снова.
      Примечание: Всегда проверяйте, что центрифуги сбалансирована во время использования.
    2. Количество каждого типа клеток с помощью Горяева или счетчик автоматизированных клеток. Добавьте нужное соотношение диссоциированных hAstros и hNeurons или iNeurons в каждой скважине в общем объеме 2 мл Нм + Y (включая Dox, если используются iNeurons). Центрифуга пластины на 100 g x 3 мин и вернуться в инкубаторе.
      Примечание: 24-ну микрорезервуар пластины (см. Таблицу материалов) содержат 300 microwells в колодец. Добавьте как минимум 6 x 105 клеток (для сферы 2 x 103 клеток) и максимум 6 x 106 клеток (для сферы4 ячейки 2 x 10) в 2 мл СМИ за хорошо. Для жизнеспособных сфер плотность в этом диапазоне использовать определенное количество клеток и разделить на 300, чтобы подсчитать количество ячеек на сфере. Альтернативный сфере, формирование методы и инструменты могут быть использованы также при желании. Следуйте инструкциям производителя для приемлемых диапазонов плотностей клеток.
    3. Разрешить клетки самостоятельно собрать в плотно упакованных сфер в микрорезервуар пластины в течение 2 дней (рис. 2A). Замените 50% средств массовой информации, если пожелтение культуры.
      Примечание: Обмен только половина средств массовой информации и Пипетка осторожно, когда удаление и Добавление средств массовой информации в порядке, чтобы не мешать сферах. Сферах может поднять вверх от microwells и предохранитель вместе с высших сил.
    4. После 2 дней аккуратно удалите сферах от microwells с 1000 мкл микропипеткой (рис. 1 d). Слегка применяйте силу к нижней части microwells с СМИ, чтобы удалить любые дополнительные придерживался сферы. Пусть сферах поселиться в 15 мл Конические трубки, аспирационная старые средства массовой информации, и добавить свежие средства массовой информации.
  4. Настроить систему биореактор колбу счетчика для формирования 3D сферах.
    1. Очистить поверхность плиты магнитные перемешать с 70% этиловом спирте, поместите его в инкубатор культуры клеток. Автоклав индивидуальный счетчик колбы для стерилизации.
    2. Добавить сферах с минимум 50-60 мл средства массовой информации для каждого счетчика колбу (рис. 1 d, вставка). Поместите колбу на магнитные перемешать пластину на 60 об/мин. Сферы культуры в колбах спиннер, пока они не готовы для сбора данных.
      Примечание: Не менее 3 недель в культуре необходим для формирования синапсов. Если системе биореактор колбу счетчика не желателен, сферах может культивировали в стационарных условиях в колбах культуры клеток или блюда. Сферах могут также быть встроенными в ECM или гидрогеля.

4. Измерение живой синаптических физиологии с массивами многоэлектродный (МЭС)

  1. Подготовьте МЭС для клеточной культуры.
    1. Чистая поверхность каждого МЭС с 1 мл раствора моющего средства на 1 ч. промыть стерильной дейонизированной водой (DI), промыть 70% этанола для стерилизации и затем воздух сухой в области биобезопасности, кабинет под УФ светом.
      Примечание: МЭС могут храниться в DI воды при температуре 4 ° C в стерильных условиях до использования.
    2. Подготовьте 0.5 мг/мл раствора поли орнитина (ООП), растворяют 50 мг в 100 мл борной кислотой буфера ООП. Покрыть поверхность каждого МЭС с 1 мл раствора ООП для визуализации поверхности гидрофильных и инкубировать при 37 ° C не менее 4 ч. удалить ООП, промойте поверхность водой ди, добавляют 1 мл ECM (см. шаг 1.1.1) и инкубировать при 37 ° C не менее 4 ч.
    3. Удаление ECM и сфер в 1,5 мл СМИ на поверхности МПС, обеспечивая, что сферы расположены на вершине массива электрода (цифры 3А, 3а '). Позвольте присоединиться на 2 дня. Измените половина средств массовой информации каждые 2-3 дня (или чаще, если необходимо), обеспечение не нарушается сферах.
      Примечание: Добавление факторов роста может улучшить выживания культуры и созревания.
  2. Мера электрическая активность нервных сфер.
    1. Создать систему многоэлектродный массив (МПС) с контролируемой температурой headstage. Создание программы с фильтр высоких частот 5 Гц, 200 Гц НЧ-фильтр и Спайк порог 5 x стандартное отклонение (SD).
    2. Место МПС на headstage и запись спонтанной электрической активности (рис. 3БB'). Сохраните необработанных данных, включая всплеска частоты и амплитуды для статистического анализа.
      Примечание: Перфузии системы могут быть использованы с МПС для добавления фармакологических агентов или для увеличения потока свежей СМИ для длительной записи. Дополнительные пост-обработки шипов может выполняться как желаемого36,37.

5. Измерение синаптических плотности с Immunocytochemistry

  1. Подготовка реагентов.
    1. Чтобы сделать 500 мл Стоковый раствор 4% параформальдегида (PFA), добавьте 400 мл ПБС в стеклянный стакан или плитой перемешать в вентилированные капюшон. Добавить движение бар и тепла до 60 ° C во время перемешивания; не кипятить. Добавить 20 г порошка PFA подогревом решение PBS и повысить рН 6,9 каплям добавляя медленно 1 N NaOH.
      Примечание: 4% раствор PFA может быть aliquoted и хранить при 4 ° C на срок до одного месяца.
    2. Добавьте 20 г или 30 г сахарозы в 100 мл PBS сделать решения 20% и 30% сахарозы, соответственно.
    3. Добавьте 1 мл моющего средства до 10 мл PBS приготовить раствор 10% акций. Инвертируйте несколько раз для гомогенизации.
    4. Добавьте 10 мл PBS подготовить основной блокирующий буфер 250 мкл 10% акций моющим средством (конечная концентрация 0.25%) и 500 мкл коза и осел сывороток (конечной концентрации 5%).
    5. Добавьте 100 мкл коза и осел сывороток (конечная концентрация 1% каждый) 10 мл PBS подготовить вторичный блокирующий буфер.
  2. Подготовка образцов.
    1. Перевести сферы в 15 мл Конические трубки, позволять им селиться в нижней части трубки и аспирационная старые средства массовой информации. Промойте сферах с 500 мкл PBS, пусть урегулировать и аспирационная PBS. Добавьте 500 мкл 4% PFA (или достаточно, чтобы покрыть сферах) и Инкубируйте на 4 ° C на 30 мин.
    2. Аспирационная ППД и аккуратно мыть дважды с PBS. Добавить 20% раствора сахарозы и Инкубируйте на 4 ° C на несколько часов или на ночь. Тщательно аспирационная, добавить 30% раствора сахарозы и Инкубируйте на 4 ° C на несколько часов или на ночь.
      Примечание: Образцы можно хранить при 4 ° C в PBS или сахароза до 1 недели перед переходом к следующему шагу. Если нет нарезки, сохранить как 3D сферы (рис. 4A-C) в 1,5 мл трубку и перейти к шагу 5.3.
    3. Если нарезки сферах, тщательно передать сферы внедрения криогенных плесень на вершине сухого льда. Аспирационная 30% раствор сахарозы и медленно вылейте ткани, внедрение решения в форму до тех пор, пока она полностью покрывает образца, избегая пузырьков воздуха. Подождите, пока раствор замерзает и хранить при температуре-80 ° C до нарезки криостата.
    4. С помощью криостата в-20 ° C, нарежьте встроенных блоков 30 мкм разделов (или по желанию) и передачи в стеклянных скольжениях. Хранить при температуре-80 ° С до готовности пятно.
  3. Имунноконтраст сферах.
    1. Контур края слайды с гидрофобным Пап пера для предотвращения разлива жидкости. Подготовка первичного и вторичного блокирования решения с антителами (см. Таблицу материалы). 500 мкл первичного блокирующий буфер для каждого слайда или трубки и инкубации при комнатной температуре за 30 мин.
    2. Удалите жидкость, 500 мкл свежей первичной блокировки буфера с разбавленным первичных антител на каждый слайд или трубы и инкубировать на ночь при 4 ° C. Удаление решения основное антитело и мыть 3 x 10 мин с PBS.
    3. 500 мкл вторичных блокирующий буфер с разбавленным вторичные антитела на каждый слайд или трубы и Инкубируйте на 4 ° C, 1 ч., удалить раствор вторичных антител и мыть 3 x 10 мин с PBS.
      Примечание: В Таблице материаловпредоставляется список рекомендуемых антител. Другие антител или красители могут быть использованы как пожелано. Не подвергайте флуоресцентные образцов для освещения (шаг 5.3.3 вперед).
    4. Добавьте 50 мкл решение каплям для покрытия поверхности и тщательно место coverslip на слайд, избегая пузыри для монтажа. Разрешить слайды сушат при комнатной температуре в течение 24 ч и хранить при 4 ° C.
  4. Изображения слайдов.
    1. Используйте конфокальный или два Фотон флуоресцентный микроскоп с 63 X нефти погружения цель изображения до и после синаптических белков изобилия и colocalization в сфере срезы (рис. 4 d). Использование 20 X или 40 X цель для визуализации морфологические особенности hAstros.
    2. Файлы изображений в открытых флуоресценции с ImageJ программного обеспечения. Граф до и после синаптических puncta, вручную с помощью плагина, счетчик клеток, используя объективные подсчитывая метод как ранее подробные38, или с альтернативными методами.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Когда выполняется должным образом, этот протокол будет производить определенные популяции функциональных cocultures астроциты28,,3334 и нейронов35 из hPSCs (Рисунок 1A-1C), как подробные ранее26 и описано здесь 2.1-2.2. Ожидается, что эта поэтапная процедура с использованием микрорезервуар пластин, выхо...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе мы описываем систематический метод для производства 3D сфер нейронные cocultures. Сферах состоят из астроцитов и нейроны, которые являются производными независимо от hPSCs. Хотя не в центре внимания настоящего Протокола, поколение чистого популяций астроциты hPSCs28 является важным шагом и может быть технически сложным, если выполняется без предварительного опыта. Этот первый шаг в поколении этих синаптических микросхем должны быть выполнены с тщательной времени и внимания к детал...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы хотели бы поблагодарить д-р Эрик Ullian (UCSF) за интеллектуальный вклад в разработке этих процедур, д-р Майкл Уорд (НИЗ) для технических консультаций по iNeuron дифференциация и Саба Барлас для анализа предварительных изображений.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
6-луночная пластинаFisher Scientific08-772-1B
15 мл конические пробиркиOlympus Plastics28-101
AccutaseSigmaA6964-100MLРаствор для отслойки
AggreWell plateStemcell Technologies34850
Антиадгезионный промывочный растворStemcell Technologies7010Prevent cell адгезия к микролуночным пластинам
Anti/antiThermofisher15240062
B27Thermofisher17504044Медиа Добавка
BrainPhys нейрональная средаStemcell Technologies5790Нейрофизиологическая базальная среда альтернатива
Круглая стеклянная защитная пленкаNeuvitroGG-12-oz
Cryostor CS10Stemcell Technologies7930Среда для криоконсервации с 10% ДМСО
DEM/F12Thermofisher10565-042С добавкой GlutaMAX
DMH-1Stemcell Technologies73634ОПАСНОСТЬ: Токсична при проглатывании. Рабочая концентрация: 2 мкм; M
Сыворотка ослаLampire Biological Laboratories7332100Рабочая концентрация: 5% в первичном блокирующем буфере, 1% во вторичном блокирующем буфере
Доксициклина гидрохлорид (Dox)SigmaD3072-1млОПАСНОСТЬ: Токсичен для беременных женщин. Рабочая концентрация: 2 мкм; г/мл
Эпидермальный фактор роста (EGF)PeprotechAF-100-15Рабочая концентрация: 10 нг/мл
Фактор роста фибробластов-2 (FGF)Peprotech100-18BРабочая концентрация: 10 нг/мл
Раствор для монтажа Fluoromount-GSouthern Biotech0100-01
Предметные стеклаFisherbrand22-037-246
Сывороткадля козLampire Biological Laboratories7332500Рабочая концентрация: 5% в первичном блокирующем буфере, 1% во вторичном блокирующем буфере
Гемацитометр или автоматический счетчик клетокLife TechnologiesAMQAX1000
HeparinSigmaH3149-50KUРабочая концентрация: 2 мг/мл
Магнитная пластинаDLAB8030170200
Матригель мембранная матрицаCorning354230ECM Покрытие раствор. Рабочая концентрация: 80 мкм; г/мл. Приготовьте на льду и убедитесь, что пипетки, пробирки и фильтрующий материал предварительно охлаждены.
MEA 2100 СистемаМногоканальные системыMEA2100
Монтажный раствор
N2Thermofisher17502048Медиа Добавка
OCTTissue-Tek4583Раствор для встраивания ткани для криосекции
Пап-ручка (Aqua Hold)Научное оборудование Лаборатория9804-02
Параформальдегид ( PFA)Acros Organics169650025ОПАСНОСТЬ: Токсичен при вдыхании. Рабочая концентрация: 4% в PBS
Фосфатно-солевой буфер (PBS)Stemcell TechnologiesCA008-300
Поли-л-орнитин (PLO)SigmaP3655-100MGРабочая концентрация: 0,5 мг/мл
Прямоугольные стеклянные покровные стеклаFisherfinest Premium Superslip12-545-88
ReLeSRStemcell Technologies5872Отслоение и пассирование реагент
Ингибитор ро-киназы Y27632- (Y)Tocris1254Рабочая концентрация: 10 мкМ
SB431542Stemcell Technologies72234Рабочая концентрация: 2 мкм; M
Колбы SpinnerFisher Scientific4500-125
СахарозаFisher ChemicalS5-3Рабочая концентрация: 20% или 30% в PBS
T25 Колба для культурыOlympus Plastics25-207Вентилируемые
колбы T75 Колба для культурыOlympus Plastics25-209Вентилируемые колпачки
Terg-A-zymeSigmaZ273287-1EAМоющее средство. Рабочая концентрация: 1%
TeSR-E8 базальная средаStemcell Technologies5940Среда для плюрипотентных стволовых клеток человека (hPSC)
TeSR-E8 ДобавкиStemcell Technologies5940Добавки для среды плюрипотентных стволовых клеток человека
TritonX-100SigmaX100-500MLМоющее средство для проникновения клеток. Рабочая концентрация: 0,25% в блокирующем буфере
Trypan blueInvitrogenT10282
Антитела
AlexaFluor 488ThermofisherA-11029Вторичное антитело
AlexaFluor 594ThermofisherA-11037Вторичное антитело
EzrinThermofisherMA5-13862Первичное антитело; астроциты перисинаптические
GFAPChemiconMAB360Первичное антитело; астроциты
GFPAvesGFP-1020Первичное антитело; астроциты
Glt1Подарок от д-ра Джеффри Ротштейнан/дПервичное антитело; астроциты
HomerSynaptic Systems160 011Первичное антитело; нейроны, постсинаптические
MAP2Синаптические системы188 004Первичное антитело; нейроны
PSD95Abcamab2723Первичное антитело; нейроны постсинаптические
S100Abcamab868Первичное антитело; астроциты
Synapsin 1Синаптические системы106 103Первичное антитело; нейроны пресинаптические
TuJ1/β 3-тубулин (TUBB3)CovanceMMS-435PПервичное антитело; нейроны

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ullian, E. M., Christopherson, K. S., Barres, B. A. Role for Glia in Synaptogenesis. Glia. 47, 209-216 (2004).
  2. Baldwin, K. T., Eroglu, C. Molecular mechanisms of astrocyte-induced synaptogenesis. Current Opinion in Neurobiology. 45, 113-120 (2017).
  3. Molofsky, A. V., et al. Astrocyte-encoded positional cues maintain sensorimotor circuit integrity. Nature. 509 (7499), 189-194 (2014).
  4. Sultan, S., et al. Synaptic Integration of Adult-Born Hippocampal Neurons Is Locally Controlled by Astrocytes. Neuron. 88, 957-972 (2015).
  5. Clarke, L. E., Barres, B. A. Emerging roles of astrocytes in neural circuit development. Nat Rev Neuroscience. 14 (5), 311-321 (2013).
  6. Cheung, G., Sibille, J., Zapata, J., Rouach, N. Activity-Dependent Plasticity of Astroglial Potassium and Glutamate Clearance. Neural Plasticity. , 109106(2015).
  7. Ghezali, G., Dallerac, G., Rouach, N. Perisynaptic astroglial processes dynamic processors of neuronal information. Brain Struct Funct. 221, 2427-2442 (2016).
  8. Kimelberg, H. K., Nedergaard, M. Functions of Astrocytes and their Potential As Therapeutic Targets. Neurotherapeutics. 7, 338-353 (2010).
  9. Pál, B. Astrocytic Actions on Extrasynaptic Neuronal Currents. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 474(2015).
  10. Kiray, H., Lindsay, S. L., Hosseinzadeh, S., Barnett, S. C. The multifaceted role of astrocytes in regulating myelination. Experimental Neurology. 283, 541-549 (2016).
  11. Allen, N. J., Eroglu, C. Cell Biology of Astrocyte-Synapse Interactions. Neuron. 96 (3), 697-708 (2017).
  12. Krencik, R., van Asperen, J. V., Ullian, E. M. Human astrocytes are distinct contributors to the complexity of synaptic function. Brain Research Bulletin. 129, 66-73 (2017).
  13. Ullian, E. M., Sapperstein, S. K., Christopherson, K. S., Barres, B. A. Control of Synapse Number by Glia. Science. 291, 657-662 (2001).
  14. Oberheim Bush, N. A., Nedergaard, M. Do Evolutionary Changes in Astrocytes Contribute to the Computational Power of the Hominid Brain? Neurochemical Research. 42 (9), 2577-2587 (2017).
  15. Han, X., et al. Forebrain Engraftment by Human Glial Progenitor Cells Enhances Synaptic Plasticity and Learning in Adult Mice. Cell Stem Cell. 12 (3), 342-353 (2013).
  16. Inoue, H., Nagata, N., Kurokawa, H., Yamanaka, S. iPS cells: a game changer for future medicine. The EMBO Journal. 33 (5), 409-417 (2014).
  17. Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology a decade of progress. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (2), 115-130 (2017).
  18. Dodla, M. C., Mumaw, J., Stice, S. L. Role of astrocytes, soluble factors, cells adhesion molecules and neurotrophins in functional synapse formation: implications for human embryonic stem cell derived neurons. Stem Cell Res Ther. , 251-260 (2010).
  19. Krencik, R., Ullian, E. M. A cellular star atlas: using astrocytes from human pluripotent stem cells for disease studies. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, 1-10 (2013).
  20. Pasca, S. P. The rise of three-dimensional human brain cultures. Nature. 553 (7689), 437-445 (2018).
  21. Huch, M., Knoblich, J. A., Lutolf, M. P., Martinez-arias, A. The hope and the hype of organoid research. Development. 144, 938-941 (2017).
  22. Mason, J. O., Price, D. J. Building Brains in a Dish: Prospects for Growing Cerebral Organoids from Stem Cells. Neuroscience. 334, 105-118 (2016).
  23. Kelava, I., Lancaster, M. A. Dishing out mini-brains: Current progress and future prospects in brain organoid research. Developmental Biology. 420 (2), 199-209 (2016).
  24. Kelava, I., Lancaster, M. A. Stem Cell Models of Human Brain Development. Cell Stem Cell. 18 (6), 736-748 (2016).
  25. Sloan, S. A., et al. Human Astrocyte Maturation Captured in 3D Cerebral Cortical Spheroids Derived from Pluripotent Stem Cells. Neuron. , 779-790 (2017).
  26. Krencik, R., et al. Systematic three-dimensional coculture rapidly recapitulates interactions between human neurons and astrocytes. Stem Cell Reports. 9 (6), 1745-1753 (2017).
  27. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  28. Krencik, R., Zhang, S. -C. Directed differentiation of functional astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 6 (11), 1710-1717 (2011).
  29. Du, Z. -W., et al. Generation and expansion of highly pure motor neuron progenitors from human pluripotent stem cells. Nature Communications. 6, 6626(2015).
  30. Neely, M. D., et al. DMH1, a highly selective small molecule BMP inhibitor promotes neurogenesis of hiPSCs: Comparison of PAX6 and SOX1 expression during neural induction. ACS Chemical Neuroscience. 3 (6), 482-491 (2012).
  31. Lippmann, E. S., Estevez-Silva, M. C., Ashton, R. S. Defined Human Pluripotent Stem Cell Culture Enables Highly Efficient Neuroepithelium Derivation Without Small Molecule Inhibitors. Stem Cells. 32, 1032-1042 (2014).
  32. Eggan, K., Kawada, J., Kaneda, S., Kirihara, T., Maroof, A. Generation of a Motor Nerve Organoid with Human Stem Cell-Derived Neurons. Stem Cell Reports. 9, 1441-1449 (2017).
  33. Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. -J., Zhang, S. -C. Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 29 (6), 528-534 (2011).
  34. Krencik, R., et al. Dysregulation of astrocyte extracellular signaling in Costello syndrome. Science Translational Medicine. 7 (286), 286(2015).
  35. Wang, C., et al. Scalable Production of iPSC-Derived Human Neurons to Identify Tau- Lowering Compounds by High-Content Screening. Stem Cell Reports. 9 (4), 1221-1233 (2017).
  36. Amin, H., Maccione, A., Marinaro, F., Zordan, S., Nieus, T., Berdondini, L. Electrical Responses and Spontaneous Activity of Human iPS-Derived Neuronal Networks Characterized for 3-month Culture with 4096-Electrode Arrays. Frontiers in Neuroscience. 10, (2016).
  37. Kapucu, F. E., Mäkinen, M. E., Tanskanen, J. M. A., Ylä-Outinen, L., Narkilahti, S., Hyttinen, J. A. K. Joint analysis of extracellular spike waveforms and neuronal network bursts. Journal of Neuroscience Methods. 259, 143-155 (2016).
  38. Ippolito, D. M., Eroglu, C. Quantifying Synapses: an Immunocytochemistry-based Assay to Quantify Synapse Number. Journal of Visualized Experiments. 45, 2-9 (2010).
  39. Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
  40. Odawara, A., Katoh, H., Matsuda, N., Suzuki, I. Physiological maturation and drug responses of human induced pluripotent stem cell-derived cortical neuronal networks in long-term culture. Scientific reports. 6, 26181(2016).
  41. Bardy, C., Hurk,, et al. Neuronal medium that supports basic synaptic functions and activity of human neurons in vitro. PNAS. 112 (25), E2725-E2734 (2015).
  42. Monzel, A. S., et al. Derivation of Human Midbrain-Specific Organoids from Neuroepithelial Stem Cells. Stem Cell Reports. 8, 1144-1154 (2017).
  43. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
  44. Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2018).
  45. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7647), 373-379 (2013).
  46. Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
  47. Yan, Y., et al. Derivation of Cortical Spheroids from Human Induced Pluripotent Stem Cells in a Suspension Bioreactor. Tissue Engineering Part A. , 1-46 (2016).
  48. Obien, M. E. J., Deligkaris, K., Bullmann, T., Bakkum, D. J., Frey, U. Revealing neuronal function through microelectrode array recordings. Frontiers in Neuroscience. 9 (JAN), 423(2015).
  49. Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. How to Culture, Record and Stimulate Neuronal Networks on Micro-electrode Arrays (MEAs). Journal of Visualized Experiments. (39), 1-7 (2010).
  50. Shigetomi, E., Patel, S., Khakh, B. S. Probing the Complexities of Astrocyte Calcium Signaling. Trends in Cell Biology. 26 (4), 300-312 (2016).
  51. Bagley, J. A., Reumann, D., Bian, S., Lévi-strauss, J., Knoblich, J. A. Fused cerebral organoids model interactions between brain regions. Nat Methods. 14 (7), (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи