Биологическая совместимость профиль на биоматериалов для костной регенерации

Ремонт кости — это сложный процесс, который начинается с формирования гематома, воспаление, мозоль формирования и затем ремоделирования^1,2. Однако костной регенерации потенциал ограничен размером^1,перелом кости³. Например большие переломов, вызванных травмой, рака или остеопороза не может исцелить и называются несрастание переломов. Эти поражения кости часто требуют лечения для поощрения здорового физиологических кости ремонт и регенерации. В настоящее время аутотрансплантатом и аллотрансплантата костной трансплантации является подход⁴ выбор процедур замены кости 2,2 миллиона ежегодно⁵. Хотя эти процедуры имеют высокий показатель успеха, могут быть осложнения, например, ограниченное наличие костей, инфекции, доноров сайт заболеваемости и неприятие⁴. Для решения этих проблем в настоящее время изыскиваются новые альтернативы для тканевой инженерии костей.

Дизайн биоматериалов, основанный на натуральных или синтетических полимеров, биокерамики или металлов в сочетании с клетки и биоактивных молекул находится на подъеме⁶. Нашего нынешнего понимания физиологических кости Исцеление и исцеление в контексте биоматериалов, зависит от нескольких факторов, таких как механические свойства и несколько местных и системных факторов, включая клетки от циркуляции и перелом^{7 ,8,9}. Биоматериалов для регенерации кости направлены на продвижение osteogenicity и остеоинтеграции¹⁰ и удобно биосовместимых, биологически и пористые (содействие миграции клеток, кислорода и питательных веществ). Они также должны быть достаточно сильным, чтобы поддержать перелом сайт для облегчения боли. Кроме того необходимо инициировать процесс заживления факторов воспаления. Однако если биоматериала индуцирует чрезмерного воспаления и аллергических реакций, это может ограничивать или препятствовать кости Исцеление^11,12. Таким образом междисциплинарный подход необходим для оценки биоматериалов, разработанные для ремонта костей.

В этом исследовании мы представляем доклинические оценки представительной материалов, 1) Orthovita Vitoss, пены, который замена трансплантата коммерчески доступных губчатой кости, состоящий из Трикальцийфосфат, состоящий из нанометрового размера чистого β-трикальцийфосфат частицами фосфата (β-TCP) и бычий коллаген типа 1 (C) (β-TCP/C пены) и 2) β-TCP диски. Здесь, мы показываем, тестирование биосовместимости эти биоматериалов, используя первичный остеобластов (OB) и assays остеокластов (OC), модель в vivo кости ремонта, иммунологические оценки входящих в vitro распространения Т-лимфоцитов и производство цитокинов и в естественных условиях иммуногенность и аллергенность, как сообщалось ранее,¹³.

Процедуры были сделаны с мышей BALB/c после всех руководящих принципов для ухода и использования лабораторных животных австрийского министерства образования, науки и исследований и были одобрены Комитетом по этике австрийского министерства образования, науки и научных исследований.

1. Первичная мыши OB культура

1. OB изоляции от новорожденных мыши Кальвария с помощью ферментативного пищеварения
   1. Усыпить 1 – 2 дня старый новорожденных щенков (60 в общей сложности), обезглавливание и место главы в чашке Петри стерильные 1 x фосфат амортизированное saline (PBS).
   2. Держите голову затылка и вырезать кожу с помощью стерильными ножницами. Надрезать calvarium, пирсинг он (около 0,1 – 0,3 мм) с ножницами, которые затем вставляется под calvarium затылок на базе черепа и разрезать вдоль края подвздошную сбоку от задней фронт выше уши, а затем Абова e переносица (рис. 1).
   3. Инкубировать расчлененных Кальвария с 8 мл раствора пищеварение фильтров стерилизованные (300 единиц/мл коллагеназы типа IV и 2,14 единиц/мл dispase II растворенные в α-минимум необходимых среде (α-MEM)) в 50 мл Конические трубки при 37 ° C 10 мин в тряску инкубатор на 200 коктейлей / мин.
   4. Отменить первый супернатант и повторить процедуру три раза с 8 мл раствора пищеварение пищеварение. Собирать супернатанта, содержащие клетки после каждого шага пищеварение и добавить его в 50 мл Конические трубки. Храните 50 мл Конические трубки с клетками в ледяной воде ванны до завершения процедуры пищеварение (примерно 40 мин).
   5. Центрифуга клетки на 300 x g 5 минут при температуре 4 ° C, аспирационная супернатант (с пипетка Пастера, придает вакуумного насоса) и Ресуспензируйте в 40 мл костный рост средних (BGM) содержащий α-MEM с 10% тепло инактивированная плода бычьим сывороточным (ФБС) и 1% пенициллин стрептомицином решение. Затем добавьте 10 мл суспензии клеток 4 культуры ткани пластины (10 см).
   6. Культура клетки при 37 ° C и 5% CO₂ до слияния (2-3 дней).
   7. В месте слияния аспирационная старый среднего и мыть культуры ткани пластины с ПБС (37 ° C). Затем аспирационная PBS и добавить 2 мл раствора 1 x трипсина, содержащий 0,5% Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) для каждой пластины культуры ткани 10 см.
   8. Инкубировать 4 культуры пластин при 37 ° C и 5% CO₂ на 5 мин и затем проверьте пластины с инвертированным микроскопом света для обеспечения что клетки отсоединяются от пластика. Затем перенесите всех клеточных суспензий (всего 8 мл) коническая Тюбик 50 мл, содержащие 10 мл свежего BGM. Мыть каждый пластины с 5 мл свежего BGM и передачи же конической Тюбик 50 мл.
   9. Центрифуга клетки на 300 x g 5 минут при температуре 4 ° C, аспирационная супернатант и Ресуспензируйте клетки в 16 мл свежего BGM. Подготовьте 16 новых 10 см культуры ткани пластины (разделение 1:4) содержащих 9 мл BGM. Добавьте 1 мл суспензии клеток в каждой плиты.
   10. Повторите шаги 1.1.6. до 1.1.8.
   11. Центрифуга клетки на 300 x g 5 минут при температуре 4 ° C, аспирационная супернатант и Ресуспензируйте в 10 мл свежего BGM. Подсчитать количество ячеек и рассчитать концентрации клеток.
       Примечание: Данная процедура создает примерно 7,5 – 8,3 x 10⁵ клеток/щенка.
   12. Центрифуга на 300 x g 5 минут при температуре 4 ° C, аспирационная супернатант и Ресуспензируйте замораживания среднего содержащий 10% диметилсульфоксида (ДМСО), α-MEM 40% и 50% FBS. 1,5 мл суспензии клеток передавать криопробирки 2 мл для в общей сложности 2 х 10⁶ клеток на флаконе.
   13. Вспышки заморозить флаконов в жидком азоте для длительного хранения в жидком азоте танк. Используйте клетки в течение одного года для обеспечения полной функциональности. Используйте эти первичной OBs для оценки распространения (шаг 1.2), дифференциация (ALP анализов: шаг 1.4., 1.5.) и минерализации (шаг 1.6.) при наличии биоматериалов. Используйте эти клетки для созревания костей-костного мозга производные OC прекурсоров в сотрудничестве культуры (шаг 2.3).
2. OB распространения пробирного
   1. Предварительно инкубировать дисков β-TCP диаметром 14 мм в 1 мл BGM в 24-ну подвеска культуры пластины при 37 ° C и 5% CO₂ на 24 часа перед добавлением первичной OBs. использования стандартных культуры ткани пластины для элементов управления и подвеска культуры пластин для образцов биоматериала Избегайте клеток привязанность к пластик.
   2. Аспирационная средой предварительной инкубации и затем Ресуспензируйте мыши OBs в BGM. Добавление 4.4 x 10⁴ OBs/см² на диски предварительно инкубирован β-TCP в пластине 24-ну подвеска культуры и для контрольной группы, в культуре ткани 24-ну плиту (1 мл/хорошо). Набл будет прикрепить пластину культуры ткани или биоматериал.
   3. Инкубируйте 14 дней при 37 ° C и 5% CO₂. Инкубационный период изменить носитель каждые 2-3 дня и добавьте 1 mL свежих BGM для каждой скважины.
   4. Для оценки распространения Обь, передать β-TCP диски на 7 и 14 дней в новых скважин для исключения сигналы из клетки, выращенных на пластину подвеска культуры.
   5. Аспирационная старый среднего, добавить 0,5 мл BGM (37 ° C) и инкубировать культуры пластин для 30 минут при 37 ° C и 5% CO₂. Затем 55 мкл 10 x реагент распространения клеток (1:10 разрежения) непосредственно в культуру хорошо. Для заготовки Подготовьте три скважины, содержащий 0,5 мл BGM и 55 мкл Реагента распространения клеток 10 x. Инкубируйте все пластины для 30 минут при 37 ° C и 5% CO₂.
   6. Снять и передаче 150 мкл супернатант от каждой скважины в черный 96-луночных плиту и читать флуоресценции с возбуждением на 560 Нм и выбросов на 590 нм. Вычтите пустой чтений из образца чтений.
3. Дифференциация и минерализации анализов Обь
   1. Предварительно инкубировать дисков β-TCP диаметром 14 мм в 1 мл BGM в 24-ну подвеска культуры пластины при 37 ° C и 5% CO₂ на 24 часа перед добавлением OBs. использования стандартных культуры ткани пластины для элементов управления и подвеска культуры пластин для образцов биоматериала избежать клетки привязанность к пластик.
   2. Аспирационная средой предварительной инкубации и затем Ресуспензируйте мыши OBs в BGM. Добавление 8.8 x 10⁴ OBs/см² на диски предварительно инкубирован β-TCP в пластине 24-ну подвеска культуры и для контрольной группы, в культуре ткани 24-ну плиту (1 мл/хорошо). Набл будет прикрепить пластину культуры ткани или образцов биоматериала.
   3. Замените BGM Остеогенные минерализации среды (мм) 1 мл раствора, содержащего BGM, 50 мкг/мл аскорбиновой кислоты и 5 мм β-Глицерофосфат 24 h после добавления OBs и инкубировать в течение 14 дней при 37 ° C и 5% CO₂. Измените носитель каждые 2-3 дня с 1 мл раствора свежеприготовленные мм для каждой скважины.
4. OB дифференциация оценивается активность щелочной фосфатазы (ALP) от lysates клетки
   1. Для измерения активности ALP на 7 день после добавления мм, аспирационная питательной среды из скважин, а затем вымыть с 1 мл стерильного ПБС (37 ° C). Тщательно аспирационная PBS Разрешить вложенные клетки остаются на культуре ткани пластика или биоматериала и заморозить пластины-80 ° c.
   2. После 24 часов (или до 2 недель), оттепель управления культуры ткани и биоматериала подвеска культуры крышку при комнатной температуре (RT) подготовить для лизиса Обь. Для образцов биоматериала передачи дисков β-TCP в новой культуры плиту подвеска для исключения клетки, прикреплены к плите. Мкл 75 за хорошо 1 x буфер lysis клетки в обе пластины. Встряхните пластины для 5 мин на шейкер в 400 качает/мин.
   3. Перенесите lysate клетки в пробки microcentrifuge 0,5 мл и центрифуги на 300 x g 6 мин на RT для удаления мусора. 50 мкл супернатант lysate клетки образца к 96-луночных черная плита и затем добавьте 50 мкл раствора, состоящий из 200 мкм 6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl фосфат (DiFMUP) fluorogenic субстрата растворяют в 2 x буфере (рН 10) ALP в колодец. Созданы две пустые скважины с 100 мкл раствора 1:1, содержащий буфер lysis клетки 1 x и 2 x ALP буфера.
   4. Подготовка 8 эталонных стандартов с 100 мкл/хорошо с 6,8-difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarin (DiFMU) от 0,5 до 200 мкм, растворяют в растворе 1:1, содержащий буфер lysis клетки 1 x и 2 x ALP буфера для создания стандартной исходной кривой.
   5. Инкубировать черная плита при 37 ° C в течение 15 минут, а затем прочитать флуоресценции с возбуждением 358 Нм и выбросов на 455 Нм. Вычтите пустой чтений от эталонных стандартов и образец чтений.
   6. Нормализует активность фермента ALP от lysates клетки для общего количества белка, с использованием колориметрического анализа для концентрации протеина. Подготовить бычьим сывороточным альбумином (БСА) белка эталонных стандартов в диапазоне от 0,05 – 2,5 мкг/мкл, растворенного в 1 x буфер lysis клетки для создания стандартной кривой.
   7. Подготовка образца lysates клетки и BSA белка стандартов в дубликаты. Добавить 5 мкл lysate клетки образца или 5 мкл BSA белка стандарта в 96-луночных плиту и затем добавить 25 мкл Реагента A' и 200 мкл Реагента B. Set вверх два пустых скважин с 5 мкл 1 x буфер lysis клетки. Инкубировать пластины на RT на 15 мин, а затем прочитать поглощения в 690 нм. Вычтите пустой чтений от эталонных стандартов и образец чтений.
5. OB дифференциация оценены путем пятнать ALP в клеточной культуре
   1. Пятно ALP в культивированный OBs на 7 день после добавления мм на тарелку тканевой культуры управления и биоматериал в пластине подвеска культуры.
   2. Аспирационная питательной среды из скважин и заменить его с 0,5 мл 1 x PBS (37 ° C). Аспирационная PBS и исправить клетки путем инкубации их в 0,5 мл формалина 10% буферизуются в РТ за 1 мин.
   3. Аспирационная формалина 10% буферизации с одноразовой пипетки и добавить 0,5 мл буфера мытья (0,05% Tween20 в однократном ПБС).
   4. Растворите одну таблетку 5-bromo-4-chloro-3-indolyl фосфат/нитро синий tetrazolium (ПКВП/НБТ) субстрата в 10 мл ультрачистая вода и вихревой до тех пор, пока полностью не растворится. Решение должен быть защищен от света и использовать в течение 2 ч.
   5. Аспирационная буфера мытья и заменить 0,5 мл раствора субстрата ПКВП/НБТ и инкубировать пластину на RT в темноте за 10 мин аспирата окрашивание раствора и заменить с 0,5 мл буфера мытья.
   6. Перенесите диски окрашенных β-TCP в новой скважины и сканировать ALP-окрашенные пластины с обычными планшетный сканер для записи ALP пятнать.
6. OB минерализации оценены путем пятнать с S ализарин красный (ARS)
   1. Аспирационная питательной среды из скважин, содержащий основной набл 14 дней после добавления мм и дважды прополощите 0,5 мл 1 x PBS на RT. аспирата PBS и исправить ячейки, добавив, что 0,5 мл 10% буферизуются раствор формалина в РТ за 10 мин.
   2. Аспирационная формалина 10% буферизации с одноразовой пипетки и мыть дважды с 0,5 мл ультрачистая вода.
   3. Для фиксированной OBs добавьте 0,25 мл 40 мм ARS окрашивание раствора (рН 4,2) растворяют в ультрачистая вода и инкубировать пластину в РТ за 10 мин на шейкер в 100 качает/мин.
   4. Аспирационная окрашивание раствора с одноразовой пипетки и промыть с 1 мл раствора ультрачистая вода. Повторите этот шаг 5 – 10 раз для удаления неспецифических пятнать.
      Примечание: Промывной раствор должен быть без цвета.
   5. Аспирационная ультрачистая вода и добавьте 1 mL холодной PBS. Инкубируйте пластину в РТ за 10 мин на шейкер в 100 качает/мин.
   6. Аспирационная PBS, передачи дисков окрашенных β-TCP для новой скважины и сканировать таблички с планшетный сканер для записи минерализации.
   7. Добавьте 0,25 мл 10% раствора хлорида цетилпиридина и инкубировать пластину на RT 15 мин на шейкер в 100 качает/мин для извлечения ARS красителя.
   8. Передача supernatants 1,5 мл трубки и центрифуги на 17.000 x g 5 мин на RT.
   9. 10% раствор цетилпиридина хлорида экстрактов с коэффициентом разбавления 1:10-1:20 и добавить образцы (300 мкл) 96-луночных знаке, включая два пустых скважин, содержащие только 10%, цетилпиридина хлорид.
   10. Подготовка 7 ARS эталонных стандартов, от 4 до 400 мкм путем разбавления ARS 40 мм, окрашивание раствора (рН 4,2) с 10% раствором хлорида цетилпиридина для создания стандартной кривой.
   11. Добавьте 300 мкл эталона в дубликаты 96-луночных пластины.
   12. Читать поглощения образцы, бланки и ссылки на стандарты в 520 Нм.
   13. Вычтите пустой чтений от эталонных стандартов и образец чтений.

2. мыши Обь OC Сопредседатель культуры для получения Зрелые OCs

1. Подготовка и стерилизации ломтики говядины кортикальной кости
   1. Очистить сегменты кости от окружающих тканей и удалить трабекулярной костной ткани и костного мозга.
   2. Сухие кости на 50 ° C в течение 24 ч.
   3. Кусочек кости на более мелкие куски и нарезать ломтиками (примерно 300 – 350 мкм толщиной) с помощью низкой скорости пила с алмазного диска.
   4. Нарежьте ломтиками 300 – 350 мкм квадратичной дисков (1 см²).
   5. Для очистки дисков кости (1 см²), положите их в запирающийся стекла флакона и заполнить с дистиллированной водой. Перевести заполненный стеклянный флакон в ультразвуковой ванне и sonicate за 5 минут Повторите три раза.
   6. Слить дистиллированной водой, добавить 70% этанол и sonicate за 5 мин.
   7. Слить 70% этанола и заменить 100% этанола.
      Примечание: Храните фрагменты костей в 100% этанола на 4 ° C на срок до 4 недель.
   8. Облучить фрагменты костей с ультрафиолетовым светом за 15 минут на каждой стороне в стерильных условиях. Храните фрагменты стерилизованные кости в стерильных культуры пластины на RT до дальнейшего использования.
2. Изоляция костного OC прекурсоров
   1. Усыпить наивно 8 – 12 недельных BALB/c мышей с помощью инъекций внутрибрюшинного (и.п.) раствора кетамина и 24 мг/кг Ксилазина 200 мг/кг.
   2. Изолируйте прекурсоров OC костного мозга от мыши бедра и голени.
   3. Удалите ноги стерильными ножницами от ближайшей точки к телу в тазобедренном суставе, вырезать конечностей на коленного и голеностопного суставов и мягких тканей с стерильным скальпель и пинцет. Отрежьте эпифизов. Промыть и приостановить костного мозга с 1 мл BGM в 6 см стерильная Петри блюдо с помощью иглы 27G прилагается к 1 мл шприц для получения суспензии клеток.
   4. Добавьте 50 мл Конические трубки суспензии клеток, мыть 6см Петри с 5 мл BGM и передачи же конической Тюбик 50 мл. Центрифуга на 350 x g при 4 ° C за 5 мин Ресуспензируйте клетки в OC дифференциации среднего (DM), содержащие BGM, 1 Нм 1,25-(OH)₂-витамина D3 и 1 мкм простагландина Е₂ (1 мл/хорошо).
      Примечание: Один мыши BALB/c обеспечивает достаточное количество прекурсоров OC для одной культуры 24-ну плиты.
3. Подготовка совместного культуры мыши OB-OC с биоматериала
   1. Предварительно Инкубируйте β-TCP дисков диаметром 14 мм или говяжьи кости ломтика (1 см²) в 1 мл BGM в пластине 24-ну подвеска культуры при 37 ° C и 5% CO₂ на 24 часа перед добавлением клетки.
      Примечание: Говяжьи кости фрагменты являются физиологическим субстратом контрольную группу для изучения дифференциации OC присутствии биоматериалов.
   2. Добавление 8.8 x 10⁴ клетки/см² первичных OBs приостановлено в BGM на биоматериалы или управления кости в пластине 24-ну подвеска культуры или к пластине 24-ну тканевые культуры. Инкубируйте при 37 ° C и 5% CO₂ на 24 часа.
      Примечание: OBs придают биоматериала или говядину кости или пластик.
   3. Добавьте свежие изолированные костного OC прекурсоров до 24 ч культивированный первичной OBs и культуры при 37 ° C и 5% CO₂ на 5 дней. Замените носитель свежеприготовленные OC DM каждый день. Затем пятно OCs для тартрата стойкие кислой фосфатазы (ловушка) для оценки OC дифференциации.
4. OC дифференциация оценены ЛОВУШКУ пятнать
   1. Характеризовать Зрелые многоядерные OCs, полученных из шага 2.3.3, аспирационная питательной среды от управления культуры ткани и крышку культуры подвеска биоматериала и добавьте 1 mL ПБС (37 ° C). Аспирационная PBS и исправить клетки путем инкубации их в 1 мл раствора формалина 10% буферизуются в РТ за 10 мин.
   2. Аспирационная раствор формалина 10% буферизации с одноразовой пипетки и добавьте 1 mL ПБС на RT. повторять этот шаг в три раза, аспирационная PBS, заменить ЛОВУШКУ буфера (рН 5) 1 мл и инкубировать пластины при 37 ° C за 30 мин.
   3. Аспирационная буфере ловушки и добавить 1 мл ацетона и 100% этанола 1:1. Инкубировать пластину на RT 30 s. быстро аспирата ацетон этанола раствор с одноразовой пипетки и полностью высушите пластины на RT.
   4. Для окрашивания раствора ловушки Подготовьте 10 мг/мл Нафтол AS-MX фосфат Стоковый раствор в N, N-Диметилформамид, Растворите 0,6 мг/мл быстро красный фиолетовый соли в ЛОВУШКУ буфера и добавить 0,1 мл раствора запасов Нафтол AS-MX фосфата 10 мл быстро красный фиолетовый соли в ЛОВУШКУ буфера.
   5. Добавьте 1 mL ловушки, окрашивание раствора и инкубировать пластины при 37 ° C за 10 мин, затем аспирационная ЛОВУШКУ, окрашивание раствора и добавьте 1 mL ультрачистая вода для остановки реакции.
   6. Передача β-TCP диски и ломтиками говяжьи кости после окрашивания в новой скважины, наблюдать красный окрашенных OCs с использованием световой микроскоп (увеличение: 10 X) и перечисление ЛОВУШКУ + Зрелые OCs с тремя или более ядрами.

3. критического размера мышь дефект черепа модель

1. Придать бупренорфин 0,1 мг/кг подкожно (с.к.) в 8 - неделя старый мышей BALB/c для обезболивания.
2. Анестезировать мышей с смесь 100 мг/кг кетамина и 5 мг/кг Ксилазина и.п., добавьте гель или мази в глаза, чтобы держать их влажными и поместите курсор мыши на нагревательной пластинки при 37 ° C в течение всей процедуры для предотвращения переохлаждения. Оценка глубины анестезии, ноги и хвост пинча.
3. Брить шерсть на верхней части головы между ушами и очистите поверхность с 7,5% повидон йод раствор и 70% этанола.
4. Сделайте срединной Сагиттальный разрез на вершине черепа между ушами с стерильным скальпель подвергать calvarium и удалить ум соединительной ткани выше правой теменной кости, соскоб с помощью скальпеля.
5. Создание критического размера дефекта в правой теменной кости с помощью стерильного стоматологического трепаном с диаметром 4 мм (2000 об/мин) под постоянной ирригации с нормальный физиологический раствор насекают правый теменная кость и прорваться через ectocortex и некоторые endocortex.
6. Для предотвращения повреждения твердой мозговой оболочки, используйте маленький лифт периостальная прорваться через оставшиеся endocortex, осторожно поднимите подвздошную кость и удалить его с щипцами. Результате дефекта следует циркуляр и приблизительно в 3,5 мм в диаметре.
7. Заполнить дефект черепа с предварительно замоченные (стерильные ПБС в RT) β-TCP/C пены с помощью щипцов.
8. Подготовьте соответствующее количество соответствует возрасту, Шам негативный контроль с пустой дефекта.
9. Хранить биоматериал в месте, положите 0.5 мкл ткань клей на краю дефекта в двух противоположных точках.
10. Закройте кожи с не рассасывающиеся шовные.
11. Очистите все хирургические инструменты с холодной sterilant поддерживать стерильные условия перед выполнением следующей операции на наркотизированных мыши.
12. После хирургического лечения место животных на сухом и чистом нагревательная пластинка при 37 ° C в области хирургии для надлежащего мониторинга во время периода восстановления. Контролировать частоту дыхания, температуру тела и цвет слизистых оболочек и глаза каждые 10 мин, до тех пор, пока они звонок.
13. Передача управляемых сознательного мышей в клетку с пищей и водой, отделена от других животных до полного восстановления. Придать 0,1 мг/кг бупренорфин s.c. послеоперационные болеутоляющие терапии дважды в день в течение 72 ч. Возвращение полностью восстановился мышей в их клетках.
14. Для определения эффективности биоматериала, усыпить и.п. мышей с раствором Ксилазина кетамина и 24 мг/кг 200 мг/кг.
15. В 8 – 12 недель после имплантации обезглавить Усыпленных мышь с острыми ножницами.
16. Исправить головку обезглавленное мыши в 30 мл 4,5% буферизации раствор формалина для 1-2 недели, чтобы гарантировать полное проникновение фиксатором в ткани.
17. Перевод главы на 70% этиловом спирте для длительного хранения при температуре 4 ° C на срок до одного года.
18. Использование Микро Компьютерная томография (microCT) или стандартизированных undecalcified Гистологические техники для оценки костной регенерации. Это можно использовать microCT, сканирование на посмертный образцы с высоким разрешением (90 кв, 4 мин) в 2D и 3D сагиттальной и фронтальной плоскости.
19. Для undecalcified гистология обезвоживает головки в возрастающем сортов этанола и встроить в гликоль метилметакрилата.
20. Вырезать гликоль метилметакрилат встроенные блоки с бриллиантом увидел и шлифуют секции толщиной примерно 80 – 100 мкм.
21. Оцените Levai Laczko мореная кость разделы для определения новой кости формирования¹⁴.

4. в Vitro иммунного ответа

1. Усыпить наивно 8 - неделя старый BALB/c мышей и.п. с раствором Ксилазина кетамина и 24 мг/кг 200 мг/кг.
2. Поместите курсор мыши на его правой стороне, брить шерсть на левой стороне и протереть кожу над левой части живота с 70% этиловом спирте.
3. Сделайте 10 мм в длину и 1 мм глубокий разрез в коже мыши на левой стороне кзади после ребра через желудок стерильными ножницами.
4. Откройте кожу и затем подвергать брюшины. Сделать 10 мм и глубиной менее 1 мм разрез в брюшину, используя ножницы в стерильных условиях.
5. Нажмите живот проксимально подвергать селезенки.
6. Аккуратно возьмите селезенки стерильным пинцетом и удалите его, резки ткани и сосудов, прилагается ниже.
7. Поместите нетронутыми селезенки в Тюбик 50 мл, содержащие 10 мл холодного 1 x стерильные PBS.
8. Подготовьте одну ячейку подвеска, мясорубки селезенки, используя 2 стерильный пинцет или 2 стерильных стеклянных скольжениях.
9. Удаление мусора, передав его через стрейнер клеток стерильные 40 мкм с холодной ПБС, используя поршень шприца 1 мл.
10. Центрифуга для одной ячейки подвеска на 300 x g 10 мин при температуре 4 ° C в 50 мл Конические трубки, аспирационная и удалить супернатант. Затем Ресуспензируйте Пелле клеток в 5 мл буфера lysis эритроцитов (РБК).
11. Инкубировать суспензию клеток для 14 мин в RT и остановить реакции, добавив 45 мл Розуэлл парк Мемориальный институт (RPMI) среды.
12. Центрифуга клетки после лизиса клеток на 300 x g 10 мин при температуре 4 ° C и затем удалить супернатант.
13. Ресуспензируйте splenocytes в среду RPMI, содержащую 10% тепло инактивированная FBS, 1% раствора пенициллина и стрептомицина, 0,1% гентамицин, ß меркаптоэтанол 0,2% и 1% несущественные аминокислот.
14. Предварительно Инкубируйте β-TCP/C пены в стерильных 96-луночных культуры пластины, содержащий среду RPMI для 24 ч при 37 ° C и 5% CO₂ до заполнения ячейки.
15. В титруемая чисел, напримердобавить splenocytes., 1,25 x 10⁵, 2,5 x 10⁵ и 5 x 10⁵/well скважин в плиту 96-луночных культуры ткани содержащие, RPMI среднего и добавок, с или без предварительного инкубирован пены β-TCP/C.
16. Добавить 10 мкг/мл конканавалина (Con A) растворяют в среде для в общей сложности 100 мкл/также соответствующие лунки и затем Инкубируйте на 37 ° C и 5% CO₂ за 72 ч.
17. Мера пролиферации с assay Бромдезоксиуридин (BrdU). Добавить 10 мкл/хорошо BrdU маркировки раствора на 48 ч культуры клеток и затем инкубировать пластину на дополнительные 24 часа.
18. 72 h собирать супернатант и хранить при температуре от-20 ° C до дальнейшего использования.
19. Добавить 200 мкл/хорошо фиксации решения каждой скважины и затем Инкубируйте 30 мин на RT. аспирата решение фиксации. Добавьте 100 мкл/хорошо антитела анти BrdU рабочего раствора и проинкубируйте 90 мин.
20. Аспирационная раствор антител, Промыть лунки три раза с 200 – 300 мкл/хорошо моющего раствора и удалить моющий раствор.
21. 100 мкл раствора субстрата и Инкубируйте 3 – 10 мин на RT, а затем измерения оптической плотности на 450 Нм.
22. Измерить интерлейкина 1β (IL-1β), интерлейкин-2 (IL-2), интерлейкина-4 (Ил-4) и интерферона гамма (ИФН γ) в собранных supernatants, используя стандартный ELISA.

5. Высокая пропускная способность внутрибрюшинного модель

1. Анестезировать женщин 6-8-недельного старых мышей BALB/c со смесью 100 мг/кг кетамина и 5 мг/кг Ксилазина и.п. и добавить гель или мази в глаза, чтобы держать их влажными и поместите курсор мыши на нагревательной пластинки при 37 ° C в течение всей процедуры для предотвращения переохлаждения. Оценка глубины анестезии, ноги и хвост пинча.
2. Брить брюшной меха и чистый с 7,5% повидон йод раствор и 70% этанола.
3. Сделать надрез длиной срединной 8 мм через кожу вдоль linea alba. Сделайте небольшой надрез в брюшину, с помощью скальпеля.
4. Стерильные PBS место пропитанной β-TCP/C пены графтов (2 x 2 x 2 мм³) в брюшной полости или без добавлены материалы для мышей управления соответствует возрасту Шам.
5. Шовные брюшины и кожи с рассасывающиеся и не рассасывающиеся шовные, соответственно.
6. Очистите все хирургические инструменты с холодной sterilant поддерживать стерильные условия перед выполнением следующей операции на наркотизированных мыши.
7. После хирургического лечения место животных на сухом и чистом нагревательная пластинка при 37 ° C в области хирургии для надлежащего мониторинга во время периода восстановления. Контролировать частоту дыхания, температуру тела и цвет слизистых оболочек и глаза каждые 10 мин, до тех пор, пока они звонок.
8. Передача управляемых сознательного мышей в клетку с пищей и водой, отделена от других животных до полного восстановления. Возвращение полностью восстановленные мышей в их клетках.
   Примечание: Данная процедура вызывает минимальный боль. Послеоперационная терапия обезболивающее обычно не является необходимым. Если эксплуатируемых животных показывают признаки боли, придать 0,1 мг/кг бупренорфин s.c. или другой соответствующий обезболивающий препарат для облегчения боли.
9. Усыпить мышей 7 дней после имплантации, с раствором 200 мг/кг кетамина и 24 мг/кг Ксилазина и.п.
10. В 7 дней после имплантации Промывание брюшной полости, используя 1 мл шприц с иглой 25 G для в общей сложности 3 мл холодного PBS, удерживая головку мыши и вставляя иглу в левом нижнем квадранте брюшной и цель проксимально.
    Примечание: Перитонеальной жидкости должна быть свободной от эритроцитов.
11. Центрифуга перитонеальный лаваж жидкости на 300 x g 5 минут при температуре 4 ° C и собирать перитонеальной жидкости для хранения при температуре-20 ° C для ELISA измерений цитокинов ИЛ 1β, Ил-2 и Ил-4.
12. Аспирационная супернатанта, Ресуспензируйте Пелле клеток в 1 мл PBS и подсчитать перитонеальный ячейки, используя Трипановый синий на Горяева.
13. Cytocentrifuge суспензию клеток в 5 x 10⁵ клеток на стеклянных вставках, позволяют слайды для сухой и пятно для дифференциальной клеток Кол.
14. С помощью световой микроскоп, рассчитывать минимум 300 клеток в общей сложности и различать макрофагов и эозинофилов, нейтрофилов, лимфоцитов.

6. подострой подкожной модель

1. Анестезировать мышей BALB/c женщин 6 – 8 неделя старый смесью 100 мг/кг кетамина и 5 мг/кг Ксилазина и.п., добавьте гель или мази в глаза, чтобы держать их влажными и поместите курсор мыши на нагревательной пластинки при 37 ° C в течение всей процедуры для предотвращения переохлаждения. Оценка глубины анестезии, ноги и хвост пинча.
2. Поместите курсор мыши на его спине, брить брюшной меха и бритая поверхность с 7,5% повидон йод раствор и 70% этанола.
3. Сделать надрез длиной срединной 8 мм через кожу вдоль linea alba живота с помощью скальпеля и затем имплантата PBS пропитанной биоматериала (2 x 2 x 2 мм³) под кожу или добавить материалы для мышей управления соответствует возрасту Шам.
4. Шовный материал кожи с не рассасывающиеся шовные.
5. Очистите все хирургические инструменты с холодной sterilant поддерживать стерильные условия перед выполнением следующей операции на наркотизированных мыши.
6. После хирургического лечения место животных на сухом и чистом нагревательная пластинка при 37 ° C в области хирургии для надлежащего мониторинга во время периода восстановления. Контролировать частоту дыхания, температуру тела и цвет слизистых оболочек и глаза каждые 10 мин, до тех пор, пока они звонок.
7. Передача управляемых сознательного мышей в клетку с пищей и водой, отделена от других животных до полного восстановления. Возвращение полностью восстановленные мышей в их клетках.
   Примечание: Данная процедура вызывает минимальный боль. Послеоперационная терапия обезболивающее обычно не является необходимым. Если эксплуатируемых животных показывают признаки боли, придать 0,1 мг/кг бупренорфин s.c. или другой соответствующий обезболивающее.
8. Когда будете готовы изучить сайт имплантации, усыпить и.п. мышей с раствором Ксилазина кетамина и 24 мг/кг 200 мг/кг.
9. Восемь недель после имплантации, акцизы на сайте имплантации с окружающих тканей (1 см²).
10. Исправить ткани в 4,5% буферизуются формалин растворе на ночь, внедрить в парафин и нарезать 4 мкм секции.
11. Пятно 4 мкм парафин врезанных тканей секции с гематоксилином и эозином (H & E) для воспаления или Массон в trichrome для осаждения коллагена и фиброза.

Чтобы оценить β-TCP для ее эффективности в качестве биоматериала для ремонта костей, мы использовали в пробирке и в естественных условиях отбора методов. Во-первых мы измерили Обь ответы на β-TCP дисков, по сравнению с базовой средней только элементами управления. Рисунок 2 демонстрирует жизнеспособность Обь в ответ на диски β-TCP на 7 и 14 дней культуры. Жизнеспособность клеток, измеренная от метаболически активных клеток в культуре скважин был то же самое для OBs с среднего в пластической культуры ткани, а также с β-TCP дисков, указывающее, что этот биоматериала повышения ни пресечения распространения Обь.

Для дальнейшей оценки OBs, мы измерили ALP деятельность как маркер дифференциации, с использованием количественных и качественных подходов. Рисунок 2 иллюстрирует ALP активность фермента в культуре скважины после 7 дней культуры. Набл в скважинах с носителя только был базовых ALP активность, в то время как в оптимальной минерализации OBs среднего (мм) был интенсивным ALP окрашивание, отражая высокий уровень OB дифференциации. В противоположность этому OBs покрытием на дисках β-TCP продифференцировано меньше OBs, инкубировали в мм. В количественного анализа концентрация ALP был 77% выше для скважин, содержащие мм, по сравнению с базовой средой самостоятельно, тогда как концентрация ALP 40% ниже в клетках, культивируемых на дисках β-TCP, по сравнению с мм элементов управления. Хотя эти результаты показывают, что клетки, выращенных на дисках β-TCP продифференцировано меньше, чем те, с оптимальными условиями пластика с мм, они продифференцированы достаточно на биоматериалов.

Другой важнейшей особенностью OBs является их способность стимулировать минерализации, которая является важным шагом в кости Исцеление. Мы окрашенных культивируемых клеток Обь с ARS после 14 дней и обнаружили, что минерализация был выше для контроля мм, по сравнению с OBs, культивируемых в среде самостоятельно и на дисках β-TCP в культуре скважин (рис. 2). Когда мы измеренная концентрация ARS, мы обнаружили, что контроль мм были более чем на 45% выше, чем группа β-TCP. Эти данные показывают что OBs, культивируемых на пластиковые присутствии мм зрелых, дифференцировать и минерализации лучше, чем те, с среднего самостоятельно и на дисках β-TCP.

Чтобы определить, как OCs реагировать β-TCP дисков, мы использовали культивирования технологии, в котором OBs совместно культивируемых с костного OC прекурсоров следуют изучения морфологии OC. OB-OC Сопредседатель культур были на 5 дней и существенно отличается между клетками, выращенных на пластик с OC DM и клеток, выращиваемых на кусочки кости и β-TCP. На пластиковые OCs были большие и широко, тогда как OCs на физиологические субстратов были меньше, менее распространение и неправильной формы (рис. 3). Чтобы quantitate OCs, мы перечисленных ЛОВУШКУ + OCs и обнаружил, что там были выше числа, когда инкубировали с β-TCP (1755 ± 21,41/см2) по сравнению с тканевой культуры управления (1140 ± 15.71/см2) и костных фрагментов (709 ± 59,69/см2), предлагая расширение OC дифференциация на дисках β-TCP (рис. 3).

Чтобы определить коммерчески доступных β-TCP/C пены в естественных условиях, мы использовали модель критического размера дефекта черепа мышей. Мы показываем представитель гистологических срезах, обработанных методом undecalcified гистологические с гликолем метилметакрилата встраивание и Levai Laczko окрашивание. MicroCT и гистология может использоваться для оценки новых формирования костей в зоне дефекта. Здесь мы покажем пример с Гистологические срезы на рисунке 4. Когда дефект хирургически индуцированной кости было оставлено пустым (фиктивный), мы наблюдали тонкий слой, покрывающий весь дефект, но без существенных кости формирования присутствовал на операции post 12 недель, подтверждающие критический размер созданного кости перелом. В отличие от этого когда дефект содержится β-TCP/C пены, там были остатки пены β-TCP/C, окруженный плотной волокнистой ткани, включая некоторые кровеносные сосуды и воспалительные клетки, преодоление площадь дефекта без признаков формирования костей.

Чтобы оценить ответ инородного тела, мы оценивали иммунологических и аллергических реакций для биоматериалов, используя assay в пробирке . Рисунок 5 показывает, что когда наивно splenocytes инкубировали с среднего самостоятельно или с β-TCP/C пены, клеток селезенки наивно не отвечает пролиферирующих или производить IL-2, IL-4 и цитокинов ИФН γ. В противоположность этому в ConA содержащих культур, пролиферация клеток и производство цитокинов, увеличилось за исключением ИЛ 1β. Клетки ответы были когда совместно культивируемых с Кона и β-TCP/C пены, по сравнению с ConA одиночку, указывающее, что пена β-TCP/C ни увеличение или уменьшение в vitro ответы.

Чтобы определить ли β-TCP/C пены индуцированной в vivo иммунный ответ, мы имплантировали его 1) внутрибрюшинно измеренные концентрации графов и цитокина воспалительных клеток в перитонеальный лаваж жидкости и 2) подкожно и оценены воспаление и фиброз на гистологических срезах имплантации сайта. В таблице 1дифференциальной в жидкости перитонеальный лаваж клетки показывает, что общее количество воспалительных клеток была значительно выше в β-TCP/C пены имплантированных мышей, по сравнению с контролем Шам. Кроме того было увеличение числа всех типов клеток. В рисунке 6Aесть более высокие концентрации цитокинов ИЛ 1β, Ил-2 и Ил-4 в β-TCP/C пены, по сравнению с контролем Шам. Β-TCP/C пены s.c. имплантированных мышей мы наблюдали воспалительной реакции с инородного тела гигантских клеток на H & E-окрашенных секций (Рисунок 6B) и доказательства фиброза на Массон в Trichrome окрашенных секции (рис. 6 c) на 8 недель. В отличие от этого на сайте имплантации Шам контроля было минимальное воспаление и не фиброз (рис. 6 c).

Рисунок 1: Кальвария удаления для первичной схемы изоляции клеток OB. Диаграмма показывает, как удалить calvarium с 4 ассорти (красная пунктирная линия) с помощью изогнутые ножницы. Первый отрезок перпендикулярно правой глазницы (R) от X1 до X 2, а вторая перпендикулярно левой глазницы (L) от X3 до X 4. Третий срез является отделить calvarium на фронте от X4 до X 2 и четвертый cut является отделить спину от X3 X 1. Calvarium затем могут быть удалены. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2: β-TCP-индуцированной в vitro OB дифференцировки и созревания. OB жизнеспособность и распространения на 7 и 14 дни для клетки культивировали в средних только (бары) или β-TCP (открытый бар) (среднее ± SEM; n = 3). Количественная оценка деятельности ALP lysates клетки и нормализации содержания белка (мкм DIFMU/мкг белка, среднее ± SEM, n = 3) с представителем изображениями иллюстрирующие ALP-окрашенных культуры скважин от 7 день. Минерализация, количественно методом цетилпиридина экстракции хлорид показано как концентрация ARS ARS-окрашенных культур (мкм ARS, среднее ± SEM, n = 3) с представителем ARS-окрашенных культуры скважин на 14 день. Группы включают кости среднего роста только (BGM); Средней минерализации (мм); Β-TCP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3: β-TCP-индуцированной в vitro OC дифференцировки. Представитель микрофотографиями Показать ЛОВУШКУ + МНК на 5 день после совместного культивирования мыши OBs и костного OC прекурсоров. Анализ конечных ЛОВУШКУ + многоядерные клетки (МНК) демонстрирует абсолютное количество ЛОВУШКУ + МНК (≥3 ядер) в см2 (означает ± SEM, n = 3) ***p < 0,001. Группы включают OC дифференциации среднего только (DM); Кость; Β-TCP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4: В естественных условиях оценки β-TCP/C пены кости графтов в модели критического размера дефекта черепа. Незаживающие черепа дефекты, созданный в 8 - неделя старый женского BALB/c (n = 3) мышей с использованием стоматологического трепаном 4 мм. Лечение групп управления включены Шам (пустой дефект) и дефектов очищенных с β-TCP/C пены. Представитель гистологических срезах, подготовленных на 12 недель после имплантации. Формалин Исправлена ткани гликоль метилметакрилат встроенные разделы (80 – 100 мкм) окрашенных краской Levai Laczko. Микрофотографиями, показано на low (слева) и высокой (справа) увеличение. Черные треугольники указывают дефекта кости. Черные * обозначает костной ткани и белый * относится к β-TCP/C пены. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 5: β-TCP/C пена индуцированной в пробирке клеток распространения цитокина производства и. Splenocytes от мышей BALB/c наивными, культивируемых в одиночку, с β-TCP/C пены или ConA среде. Супернатант пролиферации (BrdU) и производства ИЛ 1β, Ил-2, Ил-4 и ИФН γ (Средний только ●, ConA ○, β-TCP/C пены ■, β-TCP/C пены и ConA □). Распространения результатов представлены как среднее трех экземплярах образцов (O.D. ± SEM) в BrdU assay и среднее дубликаты проб (± SEM пг/мл) для концентрации цитокинов от двух независимых экспериментов. p < 0,05 считается значимым для биоматериала против среднего и биоматериала и ConA против ConA одиночку. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 6: В vivo иммунный ответ β-TCP/C пены Кость имплантатов в и.п. быстрое высокой пропускной способности и подострой мыши модель. (A) женский BALB/c мышей имплантированных и.п. с пеной β-TCP/C или без добавления материалов (фиктивный). Семь дней спустя, перитонеальный лаваж проанализированы для концентрации цитокинов (данные, представленные как означает цитокина концентрации ПГ/мл ± SEM). Эти данные представляют два независимых экспериментов (n = 5). p < 0,05 считается значительным по сравнению с обманом. (B-C) Самок мышей BALB/c (n = 5) имплантированных s.c. пеной β-TCP/C или без добавлены материалы (фиктивный). На 8 недель после имплантации кожи от имплантации сайтов, окрашенных с H & E (B) и Массон в Trichrome (C) для оценки воспаления и фиброз, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Таблица 1: В естественных условиях иммунный ответ β-TCP/C пены кости графтов в модели мыши быстрый высокая пропускная способность и.п.. Самок мышей BALB/c были имплантированы и.п. с пеной β-TCP/C или без материалов (фиктивный). Семь дней спустя, перитонеальный лаваж были получены и проанализированы для количества воспалительных клеток и дифференциального клетки подсчитывает (данные, представленные как означает ячейку графов ± SEM). Эти данные представляют два независимых экспериментов (n = 5).

Авторы не имеют ничего сообщать.