Количество новых биоматериалов, разработанные для ремонта больших костных поражений постоянно расширяется с целью укрепить кости Исцеление и преодолеть осложнения, связанные с костной трансплантации. Здесь мы представляем многоплановой стратегии для доклинических биосовместимость испытаний биоматериалов для ремонта костей.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Биологическая совместимость профиль на биоматериалов для костной регенерации
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Большие номера союз переломов являются серьезной проблемой в ортопедической хирургии. Хотя авто - и аллогенной костных имплантатов для лечения таких поражений, существуют потенциальные осложнения с их использованием. Таким образом материальный ученые разрабатывают синтетические, биосовместимых биоматериалов для преодоления этих проблем. В этом исследовании мы представляем междисциплинарных платформу для оценки биоматериалов для ремонта костей. Мы объединили опыт от кости биологии и иммунологии разработать платформу, включая в vitro остеокластов (OC) и анализов остеобластов (OB) и в естественных условиях модели мыши кости ремонт, иммуногенность и аллергенность. Мы демонстрируем как выполнять эксперименты, обобщить результаты и доклад о биоматериала биосовместимостью. В частности мы протестировали OB жизнеспособность, дифференциации и минерализации и жизнеспособности OC и дифференциации в контексте β-трикальцийфосфат фосфат (β-TCP) дисков. Мы также протестировали пены (β-TCP/C) β-TCP/коллагена, который является клинически используется для ремонта костей в подвздошную кость критического размера дефекта мыши модели для определения воздействия на ранней стадии заживления кости коммерчески доступных материалов. В параллельных экспериментов мы оценивали иммунной и аллергических реакций у мышей. Наш подход создает профиль биологической совместимости биоматериала кости с целого ряда параметров, необходимых для прогнозирования биосовместимость биоматериалов, используется для заживления кости и ремонта в больных.
Введение
Ремонт кости — это сложный процесс, который начинается с формирования гематома, воспаление, мозоль формирования и затем ремоделирования1,2. Однако костной регенерации потенциал ограничен размером1,перелом кости3. Например большие переломов, вызванных травмой, рака или остеопороза не может исцелить и называются несрастание переломов. Эти поражения кости часто требуют лечения для поощрения здорового физиологических кости ремонт и регенерации. В настоящее время аутотрансплантатом и аллотрансплантата костной трансплантации является подход....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Процедуры были сделаны с мышей BALB/c после всех руководящих принципов для ухода и использования лабораторных животных австрийского министерства образования, науки и исследований и были одобрены Комитетом по этике австрийского министерства образования, науки и научных исследований.
1. Первичная мыши OB культура
- OB изоляции от новорожденных мыши Кальвария с помощью ферментативного пищеварения
- Усыпить 1 – 2 дня старый новорожденных щенков (60 в общей сложности), обезглавливание и место главы в чашке Петри стерильные 1 x фосфат амортизированное saline (PBS).
- Держите голову затылка и вырезать кожу....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Чтобы оценить β-TCP для ее эффективности в качестве биоматериала для ремонта костей, мы использовали в пробирке и в естественных условиях отбора методов. Во-первых мы измерили Обь ответы на β-TCP дисков, по сравнению с базовой средней только элементами управления. Рисунок 2 демонстрирует жизнеспособность Обь в ответ на диски β-TCP на 7 и 14 дней культуры. Жизнеспособность клеток, измеренная от метаболически активных клеток в культуре скважин.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Здесь мы покажем многодисциплинарного подхода для доклинических оценки биосовместимость для представителя биоматериалов, разработанных для костной регенерации и ремонта. Мы протестировали ответы OBs, OCs, и исцеления ответ в vivo в критических костных дефектов модели мышей, а также в пробирке и в естественных условиях иммунные реакции. Мы стремились продемонстрировать как анализы работы и обобщения данных и выводов, полученных от рассмотрения биоматериалов. Мы покажем, что наша стратегия создае.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего сообщать.
Благодарности
Этот исследовательский проект получил финансирование от Европейского союза, седьмой рамочной программы (FP7/2007-2013), Грант соглашение № 263363.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| <сильно>биоматериалы | |||
| &бета;-трикальцийфосфатные диски (β-TCP, 14 мм) | Диски спекали в муфельной печи при температуре 1150°С. Подробное описание производства можно найти в работе Zimmer et al (doi: 10.1002/jbm.a.34639). Образцы подвергали ультрафиолетовому облучению (по 15 мин с каждой стороны) перед использованием в клеточных культурах. | ||
| Orthovita Vitoss foam (β-TCP/C foam) | Orthovita | 2102-1405 | |
| Mouse osteoblast culture | |||
| Alizarin Red S | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| ALP assay buffer (2x) pH 10,4 | Растворите 200 мМ глицина, 2 мМ хлорида магния, 2 мМ хлорида цинка в ультрачистой воде и отрегулируйте до pH 10. | ||
| Среда для роста костей (BGM) | α-MEM + 10% инактивированный при нагревании FBS + 1% пенициллин/стрептомицин | ||
| Буфер для лизиса клеток: CyQuant буфер для лизиса клеток 20x концентрат | Thermo Scientific | C7027 | Разбавьте концентрированный буфер для лизиса клеток в 20 раз в ультрачистой воде. |
| Реагент для жизнеспособности клеток: Реагент для жизнеспособности клеток Presto Blue | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | A13261 | |
| Коллагеназа типа IV из clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Набор для анализа белка DC II | Bio Rad | 5000112 | набор для анализа белка DC содержит реагент A, реагент B, реагент S и BSA для эталонного стандарта. Для реагента А' добавить 20 & микро; л реагента S к 1000 &; Л реагент А. |
| Диметилсульфоксид (ДМСО) | Sigma-Aldrich | D8418 | Стерил-фильтр ДМСО перед использованием. |
| Dispase II (нейтральная протеаза, степень II) | Roche | 4942078001 | |
| EnzCheck Набор для анализа фосфатазы на активность щелочной фосфатазы | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | E12020 | EnzCheck содержит 6,8-дифтор-4-метилумбеллиферилфосфат (DiFMUP), N,N-диметилформамид и 6,8-дифтор-7-гидрокси-4-метилкумарин (DiFMU). |
| Фетальная бычья сыворотка (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| Раствор формалина нейтральный буферный 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Глицин | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| Гексадецилпирдиний (цетилпиридиний) хлорид моногидрат | Sigma-Aldrich | C9002 | |
| L-аскорбиновая кислота 2-фосфат сесквимагния соль гидрат | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| Магния хлорид гексагидрат | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| MEM альфа-среда (α-MEM) | Gibco Life Technologies | 11900-073 | |
| Остеогенная минерализация среда (ММ) | &альфа;-МЭМ + 10% термоинактивированный FBS + 1% пенициллин-стрептомицин + 50 &; г/мл аскорбиновой кислоты + 5 мМ &бета;-глицерофосфата | ||
| Пенициллин-стрептомицин | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Фосфатно-солевой буфер 1x (PBS) pH 7,4 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | ||
| Sigmafast BCIP/NBT | Sigma-Aldrich | B5655 | |
| Трипсин-ЭДТА (0,5%), без фенола красного (10x) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15400054 | Разведите концентрированный исходный раствор в 10 раз в 1х PBS. |
| Tween20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Ультрачистая вода: Клеточная культура воды без пирогена | VWR | L0970-500 | |
| Буфер для промывки | Добавить 0,05% Tween20 до 1x PBS. | ||
| Хлорид цинка | Sigma-Aldrich | 1.08816 | |
| β-Глицерофосфат динатриевой соли | гидрат Sigma-Aldrich | G5422 | |
| 24-луночный планшет для культуры суспензии | Greiner bio-one | 662102 | |
| 24-луночный планшет для культуры тканей | Greiner bio-one | 662160 | |
| 50 мл коническая трубка | Greiner bio-one | 227261 | |
| 96-луночная черная пластина | Greiner bio-one | 655076 | |
| 96-луночная прозрачная пластина | Greiner bio-one | 655001 | |
| Центрифуга: VWR Mega Star 600R | VWR | ||
| CO2-инкубатор: HeraCell 240 | Thermo Scientific | ||
| Cryovial 2 мл | Greiner bio-one | 122263 | |
| Одноразовый фильтрующий блок FP30/0.2 CA-S | GE Healthcare Life Sciences Whatman | 10462200 | Для стерильной фильтрации ферментного раствора. |
| Планшетный сканер: Epson Perfection 1200 Photo | Epson | ||
| Infinite M200 Pro считыватель микропланшетов | Tecan | ||
| : Eppendorf tube safe-lock 0,5 мл | VWR | 20901-505 | |
| Микроцентрифужная пробирка: Eppendorf tube safe-lock 1,5 мл | VWR | 21008-959 | |
| Shaker Swip (орбитальный и горизонтальный) | Эдмунд Бюлер | ||
| Встряхивающий инкубатор GFL3032 | GFL | 3032 | |
| Одноразовая пипетка: сывороточная пипетка | Greiner bio-one | 612301 | |
| Стерильные инструменты (ножницы, пинцет, изогнутые щипцы) | |||
| Планшет для культуры тканей (10 см) | Greiner bio-one | 664960 | |
| Мышиный остеобласт-остеокласт ко-культура | |||
| 1α,25- Дигидроксивитамин D3 | Sigma-Aldrich | 17936 | 1000x концентрированный запас (10 и микро; M в этаноле 100%) |
| Ацетон | VWR Химикаты | 22065.327 | |
| Среда для роста костей (BGM) | &альфа;-MEM + 10% термоинактивированный FBS + 1% пенициллин-стрептомицин | ||
| Дистиллированная вода | Carl Roth | 3478.4 | |
| Этанол (100% об./об.) | VWR Химикаты | 20821.365 | |
| Этанол (70% об./об.) | VWR Химикаты | 93003.1006 | |
| Быстрая красная фиолетовая соль LB | Sigma-Aldrich | F3381 | |
| Фетальная бычья сыворотка (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| Нейтральный раствор формалина нейтральный буферный 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| MEM альфа Medium (α-MEM) | Gibco Life Technologies | 11900-073 | |
| N,N-диметилформамид | Sigma-Aldrich | D4551 | |
| Нафтол AS-MX фосфат | Sigma-Aldrich | N4875 | |
| Среда для дифференцировки остеокластов (DM) | &альфа;-MEM + 10% инактивированный при нагревании FBS + 1% пенициллин-стрептомицин + 1 нМ 1,25-(OH)2-витамин D3 + 1 &; М. простагландин Е2 | ||
| Пенициллин-стрептомицин | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Фосфатно-солевой буфер 1x (PBS) pH 7,4 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | ||
| Простагландин E2 (PGE2) | Cayman Chemical Company | 9003016 | 1000x концентрированный запас (1 мМ в этаноле 100%) |
| Тригидрат ацетата натрия | Sigma-Aldrich | S7670 | |
| Дигидрат натрия двухосновной дигидрат | Sigma-Aldrich | S8640 | |
| Стерильные инструменты (ножницы, щипцы, скальпель) | |||
| TRAP буфер pH 5,0 | Растворите 40 мМ ацетата натрия, 10 мМ тартрата натрия в ультрачистой воде и отрегулируйте до pH 5. | ||
| Сверхчистая вода: Вода для клеточных культур без пирогена | VWR | L0970-500 | |
| 24-луночная суспензионная культуральная пластина | Greiner bio-one | 662102 | |
| 24-луночная тканевая культуральная пластина | Greiner bio-one | 662160 | |
| 50 мл коническая трубка | Greiner bio-one | 227261 | |
| Центрифуга: VWR Mega Star 600R | VWR | ||
| CO2-инкубатор: HeraCell 240 | Thermo Scientific | ||
| Diamond вафельное лезвие (10,2 см x 0,3 см) | Buehler | ||
| Isomet | Бюлера | ||
| Петри (6 см) | Greiner bio-one | 628,161 | |
| Стеклянная бутылка с завинчивающейся крышкой 20 мл | Carl Roth | EXY4.1 | |
| Одноразовый стерильный шприц 1 мл Henry | Schein Animal Health | 9003016 | |
| Одноразовая пипетка: сывороточная пипетка | Greiner bio-one | 612301 | |
| Стерильная игла: игла для подкожных инъекций RW 27 G x 3/4''Henry | Schein Animal Health | 9003340 | |
| Mouse calvarial defect model | |||
| Анальгезия: бупренорфин (Bupaq) | Richter Pharma AG | ||
| Анестезия: Кетамин (Кетамидор), Ксилазин (Ромпун) | Richter Pharma AG/Bayer HealthCare | ||
| Холодное стерилизатор: SafeSept Max | Henry Schein Animal Health | 9882765 | |
| этанол (70% об./об.) | VWR Chemicals | 93003.1006 | |
| Глазная мазь: VitA POS 5 г | Ursapharm | ||
| Нормальный физиологический раствор (0,9% раствор натрия хлорида) | Fresenius Kabi | ||
| Фосфатно-солевой буфер 1x (PBS) pH 7,4 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | ||
| Раствор повидон-йода: Braunol 1000 мл | B. Braun | 3864154 | |
| Roti-Histofix 4,5% буферизованный формалин | Carl Roth | 2213.6 | |
| Тканевый адгезий: Histoacryl 5 x 0,5 мл | B. Braun Surgical | 1050060 | |
| Средства индивидуальной защиты: хирургические перчатки, шапочка и маска, халат | Henry Schein Animal Health | 1045073, 1026614, 9009062, 370406 | |
| Стерильные инструменты (скальпель, ножницы, щипцы, иглодержатель) | |||
| Стерильные иглы: Иглы для подкожных инъекций RW 27 G x 3/4'' и 30 G x 1/2'' | Henry Schein Animal Health | 9003340, 9003630 | |
| Одноразовый стерильный шприц 1 мл | Henry Schein Animal Health | 9003016 | |
| Нагревательная пластина: Physitemp | Rothacher Medical | TCAT-2LV | |
| Стерильные марлевые тампоны | Henry Schein Animal Health | 220192 | |
| Стерильный одноразовый скальпель (рис. 20) | Henry Schein Animal Health | 9008957 | |
| Хирургическая/стоматологическая бормашина: Implantmed SI-923 | W& H Dentalwerk Bü rmoos GmbH | 16929000 | |
| Наконечник тип S-II | W& H Dentalwerk Bü rmoos GmbH | 30056000 | |
| Трепан, диаметр 4 мм | Hager& Meisinger GmbH | 229040 | |
| Комплект ирригационных трубок 2,2 м | W& H Dentalwerk Bü rmoos GmbH | 4363600 | |
| Периостальный элеватор 2 мм / 3 мм | Henry Schein Animal Health | 472683 | |
| Нерезорбируемый шовный материал: Полиэстер зеленый, DS19, met. 1.5, USP 4/0 75 см | Henry Schein Animal Health | 300715 | |
| In vitro иммунные реакции | |||
| Анестезия при эвтаназии: Кетамин (Кетамидор), Xylazine (Rompun) | Richter Pharma AG/Bayer HealthCare | ||
| Cell Proliferation ELISA, BrdU (колориметрический) Набор для анализа | Sigma-Aldrich | 11647229001 | Набор содержит раствор для мечения BrdU, раствор для фиксации (FixDenat), раствор антитела Anti-BrdU, промывочный буфер и раствор субстрата. |
| Concanavalin A (ConA) | MP Biomedicals | 150710 | |
| Культуральная среда спленоцитов | RPMI среда + 10% термоинактивированный FBS + 1% раствор пенициллин-стрептомицина + 0,1% гентамицин + 0,2% ß-меркаптоэтанол + 1% заменимые аминокислоты | ||
| Этанол (70% об/об.) | VWR Chemicals | 93003.1006 | |
| Фетальная бычья сыворотка (FBS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific& НБСП; | ||
| Gentamicin | Gibco, Thermo Fisher Scientific | ||
| мышь IL-1&бета; ELISA Ready-SET-Go! | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 88-7013-88 | |
| Мышь IL-2 ELISA MAX Standard | BioLegend | 431001 | |
| мышь IL-4 ELISA MAX Standard | BioLegend | 431101 | |
| мыши INF-γ ELISA MAX Standard | BioLegend | 430801 | |
| раствор заменимых аминокислот | Gibco, Thermo Fisher Scientific | ||
| Пенициллин-стрептомицин | Gibco, Thermo Fisher Scientific | ||
| Фосфатно-солевой буфер 1x (PBS) pH 7,4 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | ||
| Буфер для лизиса эритроцитов (эритроцитов): BD Pharm Lyse | BD Bioscience | 555899 | |
| среде RPMI 1640, HEPES | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 52400025 | |
| β-Меркаптоэтанол | Gibco, Thermo Fisher Scientific | ||
| Коническая пробирка объемом 50 мл | Greiner bio-one | 227261 | |
| 96-луночная тканевая культуральная пластина | Greiner bio-one | 655180 | |
| Центрифуга: VWR Mega Star 600R | VWR | ||
| Cell siter 40 &микро; m | BD Bioscience | 352340 | |
| Infinite M200 Pro считыватель микропланшетов | Tecan | ||
| Одноразовый стерильный шприц 1 мл | Henry Schein Animal Health | 9003016 | |
| Стерильные хирургические инструменты (щипцы, предметные стекла) | |||
| <сильный>высокопроизводительная внутрибрюшинная модель | |||
| Анестезия: Кетамин (Кетамидор), Ксилазин (Ромпун) | Richter Pharma AG/Bayer HealthCare | ||
| Холодный стерилизатор: SafeSept Max | Henry Schein Animal Health | 9882765 | |
| этанол (70% об./об.) | VWR Chemicals | 93003.1006 | |
| Глазная мазь: VitA POS 5 г | Ursapharm | ||
| Mouse IL-1β ELISA Ready-SET-Go! | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 88-7013-88 | |
| Мышь IL-2 ELISA MAX Standard | BioLegend | 431001 | |
| мыши IL-4 ELISA MAX Standard | BioLegend | 431101 | |
| Фосфатно-солевой буфер 1x (PBS) pH 7,4 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | ||
| Раствор повидон-йода: Braunol 1000 мл | B. Braun | 3864154 | |
| Shandon Rapid-Chrome Kwik-Diff Staining Kit | Thermo Scientific | 9990700 | Для дифференциального подсчета клеток. |
| Нагревательная пластина: Physitemp | Rothacher Medical | TCAT-2LV | |
| Гемоцитометр: камера Нойбауэра | Carl Roth | PC72.1 | |
| Нерезорбируемый шовный материал: Ethibond Excel 4-0 | Ethicon | 6683H | |
| Резорбируемый шовный материал: Polysorb | Covidien | SL-5628 | |
| Шандонская центрифуга для циттопсина | Thermo Scientific | ||
| Одноразовый стерильный шприц 1 мл | Henry Schein Animal Health | 9003016 | |
| Стерильные марлевые тампоны | Henry Schein Animal Health | 220192 | |
| Стерильные иглы: иглы для подкожных инъекций RW 27 G x 3/4'' и 25 G | Henry Schein Animal Health | 9003340, 420939 | |
| Стерильные хирургические инструменты (скальпель, ножницы, щипцы, иглодержатель) | |||
| Раствор трипанового синего 0,4% | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| <сильная>Субхроническая подкожная модель | |||
| Анестезия: Кетамин (Кетамидор), Ксилазин (Ромпун) | Richter Pharma AG/Bayer HealthCare | ||
| Холодный стерилизатор: SafeSept Max | Henry Schein Animal Health | 9882765 | |
| этанол (70% об./об.) | VWR Chemicals | 93003.1006 | |
| Глазная мазь: VitA POS 5 г | Урсафарм | ||
| фосфатно-солевой буферный 1x (PBS) pH 7,4 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | ||
| Повидон йод раствор: Braunol 1000 мл | B. Braun | 3864154 | |
| Roti-Histofix 4,5% буферный формалин | Carl Roth | 2213.6 | |
| Нагревательная пластина: Physitemp | Rothacher Medical | TCAT-2LV | |
| Нерезорбируемый шовный материал: Ethibond Excel 4-0 | Ethicon | 6683H | |
| Средства индивидуальной защиты: хирургические перчатки, шапочка и маска, халат | Henry Schein Animal Health | 1045073, 1026614, 9009062, 370406 | |
| Одноразовый стерильный шприц 1 мл | Henry Schein Animal Health | 9003016 | |
| Стерильные марлевые тампоны | Henry Schein Animal Health | 220192 | |
| Стерильные инструменты (скальпель, ножницы, щипцы, иглодержатель) | |||
| Стерильная игла: иглы для подкожных инъекций RW 27 G x 3/4'' | Генри Шейн Ветеринарный | 9003340, 420939 |
Ссылки
- Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: mechanisms and interventions. Nature Reviews Rheumatology. 11 (1), 45-54 (2015).
- Marsell, R., Einhorn, T. A. The biology of fracture healing. Injury. 42 (6), 551-555 (2011).
- Cooper, G. M., et al.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
