Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Динамический протеомных и Мирна анализ Polysomes от изолированных мыши сердца после Langendorff перфузии

8.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/58079

⸱

29 августа 2018 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1The Smidt Heart Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 2Advanced Clinical Biosystems Research Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 3Institute of Analytical Chemistry of the Czech Academy of Sciences

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол для выполнения профилирования на изолированной перфузии мыши сердце Полисома. Мы описываем методы перфузия сердца, Полисома профилирования и анализа Полисома фракций в отношении мРНК, адаптивной и Полисома протеома.

Аннотация

Исследования в динамических изменений в переводе белка требуют специальных методов. Здесь мы рассмотрели изменения в недавно синтезированных белков в ответ ишемии и реперфузии, используя изолированной перфузии мыши сердце, в сочетании с Полисома профилирования. Для более глубокого понимания динамических изменений в переводе белка, мы характеризуется мРНК, которые были загружены с цитозольной рибосом (полирибосомы или polysomes) и также восстановлены митохондриальной polysomes и сравнили мРНК и белка распределения в высокая эффективность дроби (многочисленные прилагается к мРНК рибосомы), низкий эффективность (меньше рибосомы прилагается) которая также включала митохондриальных polysomes и -перевод дробей. интерферирующим можно также связать с мРНК, которые переводятся, тем самым снижая эффективность перевода, мы исследовали распределение адаптивной различных фракций. Распределение мРНК, адаптивной и белков был рассмотрен условиях базальной перфузии, в конце 30 мин глобальной ишемии потока нет и после 30 минут реперфузии. Здесь мы представляем методы, используемые для выполнения такого анализа — в частности, не был описан подход к оптимизации добычи белка из сахарозы градиента, как это раньше — и предоставить некоторые представитель результаты.

Введение

Сердце реагирует к ушибу ишемии (I) и реперфузии (R) в динамических моды. Однако есть меньшюю проницательность в острой изменения в синтезе белков во время ответа. Для решения этой проблемы, мы воспользовались устоявшихся метода профилирования1 для выявления изменений в изобилии белков, которые отражают перераспределение рибосомы и трансляционная регуляторные факторы от цитозоль для polysomes, Полисома и увеличение вновь синтезируемых белков (ПСУ). В обстановке я / R, увеличение синтеза новых белков происходит в сроки, что является несовместимым с транскрипцией новой мРНК2; Кроме того отсутствие согласованности между уровнями выражение mRNA и изобилие белка был сообщил3. По этим причинам мы решили проанализировать изменения в динамических протеома как отражение переводом белка. Чтобы сделать это, мы количественно мРНК в Полисома фракций и анализировать состав белка в Полисома фракции. Наконец, потому что микроРНК (Мирс) регулирования доступности мРНК для перевода и может мешать эффективности белка перевод4,5, мы исследовали распределение Мирс в Полисома фракций, сосредоточив внимание на ответ на я / R.

Мы решили использовать модель изолированных мыши Langendorff перфузии и заготовленной ткани в базальных условиях непрерывной перфузии, после 30 мин глобального потока нет ишемии и после 30 минут ишемии, следуют 30 мин реперфузии. Затем мы солюбилизирован ткани сердца и разделенные polysomes над градиентом сахарозы, следуют протеомного анализа и селективного выявления мРНК и адаптивной ПЦР и microarray дна, соответственно. Это сочетание методов представляет собой мощный подход к пониманию динамический протеом, позволяя одновременного обнаружения мРНК, Мирна, и Энни, а также перераспределения регуляторных белков, Мирна и мРНК nontranslating фракции, низкая эффективность polysomes и polysomes высокой эффективности (см. Рисунок 1). Понимание динамического регулирования этого процесса будет расширен путем дальнейшего анализа фосфорилирования ключевых регулирующих факторов, таких как eIF2α или mTOR. Теперь эти отдельные шаги описаны в деталях.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все исследования на животных были выполнены в соответствии с институциональных руководящих принципов и одобрены институциональный уход животных и использование Комитета медицинский центр Седарс-Синай.

1. Langendorff перфузия сердца мыши

  1. Langendorff перфузия сердца мыши с ишемии и реперфузии
    1. Администрировать внутрибрюшинного Пентобарбитал натрия 70 мг/кг для взрослых мышь (8-недельных, мужчина, C57BL6/j). Подтвердите глубокий наркоз, отсутствие вывода до пят пинча.
    2. Anticoagulate с внутрибрюшинного гепарина 500 U/кг.
    3. Откройте сундук через грудной разрез. Открыть диафрагму и разрезать вдоль прибрежной границы передней подмышечной оси. Затем вырежьте оси передней подмышечной до передних конечностей, чтобы полностью открыть грудной клетки. После Визуализация сердца, зажим восходящей части аорты с щипцами и быстро акцизных сердце. Смерть обусловлена обескровливания. Место сердце в холодных Кребс (NaCl 6,9 г/Л, KCl 0,35 г/Л, NaHCO3 2.1 г/Л, KH2PO4 0,16 г/Л, MgSO4 0.141 г/Л, глюкозы 2 г/Л и CaCl2 0.373 г/Л).
    4. Иглу аорты с тупой кончик иглы и perfuse сердца retrogradely растворе Кребса в режиме постоянного давления.
    5. После периода стабилизации 15 мин подлежащих сердце глобального потока нет ишемии для 30 мин после реперфузии за 30 мин.
    6. Собирать сердца после перфузии базовых 15 мин, 30 мин ишемии или после реперфузии 30 мин. Обрезать предсердия и оснастки замораживания тканей в жидком азоте.
    7. Хранить при температуре-80 ° C до использования

2. ткани гомогенизации, солюбилизация и плотность сахарозы градиента осаждения

  1. Градиент подготовка
    1. Готовить 2 решения (15% и 50%), 100 мл сахарозы, смешивания 4 мл NaCl 2,5 М;
      0,8 мл MgCl2 1,25 М; 1 мл трис-HCl 1 M, рН 7,5; 15 g или 50 г сахарозы (15% и 50%, соответственно); сверхчистой воды до 100 мл; и cyanol (0,02 мг/мл) ксилол цвета раствор 15%
    2. Фильтр для каждого решения (0.22 мкм фильтры)
    3. День, когда градиент будет использоваться, подготовить 40 мл каждого раствора сахарозы и добавьте циклогексимида каждого решения для достижения конечной концентрации 100 мкг/мл
      1. Используйте градиент чайник подготовить смесь между 15% и 50% сахарозы решения
      2. Заполнить левую отделение с 5 мл 15%-ая сахароза градиента
      3. Заполните правый отсек с 50%-ая сахароза градиента
      4. Откройте кран и включите насос, чтобы перемешать в два небольших отсеках с магнитной мешалкой
      5. Использование трубки связаны с второй нажмите Разрешить смешанных сахарозы решение поступать в ультра центрифугирования трубки с тонкими стенками. Окончательный объем будет около 10 мл.
    4. Сохранить градиенты на 4 ° C (на ночь, если это необходимо, но не более)
  2. Гомогенизация ткани сердца
    1. Однородный свежие или замороженные сердце с Политрон отфильтрованных литического буфера (изменено для градиента фракционирование сахарозы) содержащий 100 мм KCl, 20 мм трис рН 7,5, 5 мм2MgCl 0,4% NP-40. Включать циклогексимида 100 мкг/мл для поддержания структуры Полисома, 0.1 битор РНКазы U и ингибитор протеазы коктейль (1 таблетка за 50 мл).
    2. Инкубировать lysate на льду 15 мин.
    3. Центрифуга на 18 000 х g 15 мин при температуре 4 ° C для удаления нерастворимых материалов и собирать супернатант.
    4. Заповедник 50 мкл для определения белков, РНК изоляции и анализ целостности РНК (см. Рисунок 2).
    5. Слой супернатант (500-100 мкл) поверх градиенты и сбалансировать трубки с буфера lysis.
  3. Седиментации и сбора фракций
    1. Выполните ultracentrifugation для 120 мин на 37 000 об/мин при 4 ° C в размахивая ведро ротора. По словам производителя это соответствует 228,000 x g на максимальный радиус.
    2. Собирать каждый градиент как 17 дроби (около 600 мкл фракция) microcentrifuge пробирки с непрерывный мониторинг поглощения в 254 Нм (254OD).
    3. Программа коллектор фракций следующим образом:
      1. Отбросить первые 3 мин коллекции (соответствующий жидкость, содержащуюся в трубы перед градиент)
      2. От 4 до 19 мин сбора фракций со скоростью 1 мл/мин в 17 фракций.
    4. Место фракций на льду, как только каждый собирается. Замораживание образцов при температуре-80 ° C, если они не обрабатываются немедленно. Типичный УФ денситометрических трассировки градиента как она собирается это показано на рисунке 1.

3. изоляция и анализ мРНК Полисома и Nontranslating фракций

  1. Извлечение mRNA
    1. Оттепель дроби на льду, если они были флэш замороженные после сбора
    2. Передать свежие трубу 200 мкл каждой фракции
      Примечание: На этом шаге, два или более последовательных фракций могут быть объединены вместе. Это должно быть сделано тщательно после анализа графа254 ОД, таким образом, чтобы не получить смешанные Полисома и не Полисома фракции.
    3. Добавить 10 нг Люцифераза РНК как внутреннего контроля для каждого образца для нормализации цели.
      Примечание: Люцифераза грунтовки должны использоваться в качестве внутреннего контроля нормализовать результаты.
    4. Добавьте 700 мкл Реагента РНК добыча (монофазные раствор фенола и гуанидина Изотиоцианаты; см. Таблицу материалов) к каждой трубе. Хорошо перемешайте и инкубировать трубы для 5 мин на RT (комнатной температуры).
    5. Добавить 140 мкл хлороформе и вихрь для 15 s. инкубировать на 2-3 мин на RT.
    6. Центрифугуйте образцы на 15 мин на 12000 x g при 4 ° C.
    7. Тщательно передать новой трубки верхняя водной фазе.
    8. Так как РНК содержание фракций не высока, добавьте 10 мкг гликогена как несущая каждой трубы.
    9. Добавьте 350 мкл изопропанола в каждую пробирку. Хорошо перемешайте и инкубировать в-20 ° C в течение 1 ч для повышения урожайности.
    10. Центрифуги для 15 мин на 12000 x g при 4 ° C.
    11. Отменить супернатант и добавить 700 мкл этанол 75% чтобы помыть лепешка РНК.
    12. Центрифуги для 5 мин при 7,500 x g при 4 ° C.
    13. Удаление этанола и пусть Пелле воздух сухой для 10 – 15 мин.
      Примечание: Чрезмерное сушки гранул РНК будет препятствовать его полной ПАВ в воде.
    14. Ресуспензируйте Пелле РНК в 50 мкл бесплатно РНКазы сверхчистого H2O.
    15. Проинкубируйте образцы для 10 мин при температуре 55 ° C.
    16. Использовать 2 мкл каждого образца измеряют качество и количество извлеченных РНК и хранить остаток-80 ° c.
  2. Обратная транскрипция и ПЦР
    1. Используйте 4 мкл синтеза cDNA обратной транскрипции Кит (см. Таблицу материалы) для 20 мкл реакции. Подготовьте Супермикс согласно количество выборок. Передавать необходимый объем каждой трубы и добавить 5 мкл ввода РНК в каждую пробирку. Этот объем может быть исправлено актуальны для ряда условий труда полимеразы Taq.
    2. Проинкубируйте труб в тепловая велосипедист с следующие программы, рекомендованные производителем: 5 мин при 25 ° C, 20 мин обратной транскрипции для 20 минут 46 ° C и обратная транскриптаза инактивации за 1 мин на 95 ° C.
    3. Запустите ПЦР с программой оптимизации для каждой пары праймеров.
      Примечание: Чтобы обнаружить присутствие некоторых mRNAs в долях, равный объем от каждой фракции (из изолированных РНК) следует использовать для обратной транскрипции.
  3. Анализ результатов
    1. Используйте значение Ct заинтересованных гена и Люцифераза для вычисления значения Дельта Ct
    2. Экспресс каждой фракции Дельта Ct значение в процентах от общей стоимости мРНК, содержащиеся во всех фракциях, для визуализации распределения мРНК через различных фракций (Таблица 1)

4. изоляция и анализ интерферирующим Полисома фракций и Nontranslating фракций

  1. Извлечение mRNA и Мирна
    Примечание: Этот протокол следует инструкциям производителя, с некоторыми изменениями.
    1. Оттепель гликоген и Спайк в элемент управления. Держите на льду.
    2. Добавьте 700 мкл Реагента Мирна извлечения 200 мкл пуле образца.
    3. Добавить 1 мкг/мкл гликогена и однородности его с помощью пипетки. Инкубируйте 5 мин при комнатной температуре.
    4. 3.5 мкл 1.6 x 108 Спайк в управления и смешайте его.
    5. 200 мкл, хлороформе и вихревой его по крайней мере 15 сек.
    6. Инкубируйте 3 мин при комнатной температуре.
    7. Центрифуга на 12000 x g 15 мин при 4 ° C.
    8. С помощью пипетки, супернатанта передать новой 1,5 мл трубки. Отказаться от среднего и нижнего фаз.
    9. Добавить 1,5 x объем 100% этанола в надосадке и смешайте его.
    10. Трансфер 700 мкл этой смеси в столбце извлечения Мирна и центрифуги на полной скорости для 15 s в RT и отмены потока через; Повторите этот шаг с любых оставшихся образца.
    11. 700 мкл буфера 1 в столбце и центрифуги на полной скорости для 15 s в РТ; отказаться от потока через.
    12. Добавьте 500 мкл буфера 2 столбца и центрифуги на полной скорости для 15 s в РТ; отказаться от потока через.
    13. Добавить 500 мкл 80% этанола в столбце и центрифуги на полной скорости на 2 мин на RT; отказаться от потока через.
    14. Передача в столбце для новой 2 мл контаминированных трубки, откройте крышку и центрифуги на RT на 5 минут на полной скорости; отказаться от потока через.
    15. Мкл 16 РНКазы свободной воды для столбца и центрифуги на полную скорость 1 мин в RT. держать элюата на льду или хранить при температуре-80 ° C для будущего анализа.
      Примечание: Две микролитров каждый образец может использоваться для анализа ОД.
  2. Обратная транскрипция
    1. Готовить на льду. Для каждого 20 мкл ПЦР-реакции добавьте 4 мкл буфера RT Мирна, 2 мкл нуклеиновых кислот, 9 мкл всего РНК, 2 мкл фермента и 3 мкл РНКазы свободной воды; смешать и спина его вниз кратко.
    2. Установите тепловой Cycler следующим образом:
      37 ° C 60 мин;
      95 ° C за 5 мин;
      4 ° C провести.
    3. Удаление трубы из тепловая велосипедист и 200 мкл РНКазы свободной воды. Хранить при температуре от-20 ° C или перейти к ПЦР в реальном времени.
  3. ПЦР в реальном времени
    Примечание: Этот протокол следует 96 формат хорошо пластины. Подготовьте смесь реакции на льду.
    1. Подготовка смесь реакции PCR и добавить cDNA (от адаптивной выше) в соответствии с диапазоном, принят протокол. Несколько реакций могут быть подготовлены в пакете.
    2. Добавьте в общей сложности 25 мкл ПЦР микс + cDNA в каждой скважине.
    3. Уплотнение пластину с помощью оптические пластины печать.
    4. Центрифуга пластину за 1 мин на 1000 x g при комнатной температуре.
    5. Программа в реальном времени циклователь следующим образом:
      Первоначальной активации шаг при 95 ° C 15 мин;
      3-ступенчатый Велоспорт: Денатурация при 94 ° C 15 s; отжиг при температуре 55 ° C за 30 сек; расширение при 70 ° C за 30 s (выполнить сбор данных флуоресценции); добавить 40 циклов;
      Плавки кривой по умолчанию cycler.
  4. Сравнительный анализ
    1. Пример нормализации (см. таблицу 2):
      1. Вычислить минимальное значение SCM.
      2. Нормализовать все значения SCM этот минимум.
      3. Вычитание этого значения из значения Ct интерферирующим интерес (МВД) и ссылка гена (REF).
      4. Анализируйте данные с использованием формулы 2-ΔCt .

5. протеомного анализа

  1. Извлечение белков из Полисома фракции
    1. Объедините собранные сахарозы дроби на три фракции окончательный. Марк фракций как тяжелые (высокая эффективность polysomes в пуле фракций, 4, 5, 6 и 7 с самой высокой концентрацией сахарозы; нижней части градиента трубки), свет (низкая эффективность polysomes в пуле фракции 8, 9, 10 и 11; середины градиент трубки) и -перевод (пуле фракций 12, 13, 14 и 15 с низкой концентрацией сахарозы; верхней градиентной трубки). Выполните assay протеина на пуле фракций.
    2. Подготовка 100% запас трихлоруксусной кислоты (TCA) и хранить его на 4 ° C в темноте. Перемешать 0,5 мл пробы с 60 мкл, 100% ТСА и инкубировать при-20 ° C ночью в темноте.
      Примечание: Используйте 1,5 мл низкопротеиновое крепления трубы (см. Таблицу материалы).
    3. После ночи инкубации оттепель образца на льду и центрифуги на 15000 x g, 4 ° C на 30 мин удалить супернатант.
      Примечание: 100 мкг общего белка в образце дает видимый белка Пелле в нижней части трубки.
    4. Предварительно охладите ацетона в морозильной камере-20 ° С. Добавьте 0,5 мл холодного ацетона в Пелле белка и центрифуги на 15000 x g, 4 ° C на 15 мин удалить супернатант. Повторите этот шаг два раза.
    5. Воздух сухой гранулы. Ресуспензируйте гранулы в 360 мкл буфера Tris-HCl 50 мм (рН 8).
      Примечание: При необходимости, используйте sonicator импульса для Ресуспензируйте гранулы.
    6. 40 мкл 0,1 М Дитиотреитол (конечная концентрация 10 мм) и Инкубируйте на 55 ° C на шейкер для 45 мин добавьте 50 мкл 0,15 М iodoacetamide (конечная концентрация 17 мм) и инкубации при комнатной температуре на шейкер для 30 мин в темноте.
    7. Приготовляют раствор трипсина: Ресуспензируйте 20 мкг трипсина в 100 мкл бикарбонат аммония 50 мм. Добавить соответствующий объем раствора трипсина образца в 1:50 (w/w) соотношение трипсина: белка, убедитесь, что рН 8 и инкубировать на шейкер при 37 ° C на ночь.
      Примечание: Добавьте 1 М бикарбонат аммония довести рН до 8.
    8. После переваривания трипсином прохладный образца, центрифуги кратко в центрифуге скамейке, добавить 10% муравьиной кислоты рН 2-3 утолить активности трипсина, и перейти с образца обессоливания.
      Примечание: Используйте µ элюции пластины для обессоливания образца.
    9. Условие сорбента в лунках 96 также пластины с 200 мкл рабочего раствора метанола с помощью вакуума, следуют три раза в принадлежности по 200 мкл 0,1% муравьиной кислоты в три раза. Загрузить образец и выполните пример мыть с помощью 200 мкл 0,1% муравьиной кислоты в три раза. Элюировать дважды в низкопротеиновое удержания 0,5 мл пробирку образца с 100 мкл acetonitrile/0.1% 50% муравьиной кислоты.
      Примечание: Элюировать образца медленно сначала с помощью гравитации последовали низким вакуума.
    10. Испарится элюата образца к сухости, используя концентратор и либо непосредственно осуществлять анализ масс-спектрометрии или магазина-80 ° c до использования.
  2. Масс-спектрометрия анализ
    1. Воссоздать каждый Пелле (состоящий из tryptic пептидов) в 50 – 100 мкл и залить 1 мкл в масс-спектрометр.
      Примечание: Оптимизируйте растворения и инъекции томов для получения максимальной интенсивности сигнала LC/MS/MS. В нашем случае, максимальный сигнал (всего ионного тока; TIC) в самом сердце сканирования был в диапазоне от 1E8 до 2E9.
    2. Используйте столбец ловушку C18 (300 мкм i.d. x 5 мм, 5 мкм, 100Å) следуют пептид разделения с помощью C18 столбца (75 мкм i.d. x 250 мм, 2 мкм, 100Å) с параметром скорость потока на 300 нл/мин набор капиллярных температуры нано источник до 275 ° C и спрей напряжения до 2 кв.
    3. Примените линейный градиент 5-35% B 90 мин, 35 – 95% B за 3 мин, держа на 95% B 7 мин и уравновешивания на 5% B 25 мин (A: 0.1% муравьиной кислоты/вода и B: 0,1% муравьиной кислоты в ацетонитриле). Приобрести MS2 спектры для 15 ионов высокой интенсивности от каждого сканирования MS1 режиме на CID. Используйте 3 реплицирует масс-спектрометрии для каждого образца, проанализированы.
      Примечание: Оптимизировать и использовать экспериментальные условия и параметры, которые подходят для ваших образцов на инструменте частности масс-спектрометрии. Условия/параметры, упомянутые в разделе 5.2. были использованы и оптимизированы в нашей лаборатории.
  3. Белка идентификации/количественный
    1. После анализа масс-спектрометрии конвертировать файлы raw спектры в совместимых mzXML файлов с помощью программного обеспечения MSConvert (http://proteowizard.sourceforge.net/tools/msconvert.html).
    2. Представить преобразованные файлы в SEQUEST поисковая система с критерии поиска, например, UniProtKB/Swiss-Prot мыши базы данных (последними канонические обзор); хэш полу фермента трипсина (после KR /-); с до 2 пропущенных разобщенности; прекурсоров массового диапазон: 400-4500 Аму; статический модификации: carbamidomethyl (C) 57.021465 Аму; пептид массового терпимости: 50 ppm; фрагмент массы типа: monoisotopic.
      Примечание: Могут использоваться другие белка базы данных поиска двигатели и данных трубопроводов. При использовании базы данных для например крысу, которая является менее полным, чем базы данных для человека и мыши, может потребоваться поиск против мыши (или человека) баз данных для увеличения охвата протеома. В этом случае избыточности в белок имена нужно будет удалить.
    3. Выполните анализ после поиска. Настроить фильтры для просмотра данных. Например значение вероятности минимального белка (белок порог) как 95% или 99%, то есть, будет отображаться только белки, для которых Статистический анализ подразумевает 95% или 99% вероятность присутствия в образце. Установите фильтр для пептида порога (например, 95%), т.е. минимальную вероятность, который будет использоваться при определении ли спектра идентифицирует пептид. Выберите минимальное количество пептидов, которые будет определять, если белок присутствует (рекомендуется 2 пептидов как минимум для идентификации белков).
    4. Оценка выявленных белков для качества/количества. Убедитесь, что proteotypic пептидов, используются для количественной оценки. Если выявлено изоформы убедитесь, что это баз на наблюдении за tryptic пептид, состоящий из аминокислотной последовательности, уникальные для конкретных изоформы. Любой «подобный» или гипотетических белков должен пройти сравнения, чтобы увидеть, если наблюдаемые пептиды соответствуют известным белка.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

анализ мРНК
мРНК результаты могут быть выражены как распределение конкретных мРНК в каждой фракции (Рисунок 3А); для количественной оценки объединить polyribosomal перевод дробей и сравните-перевод дроби (рис. 3B), представляя соотношение мРНК изобилия в переводе на nontranslating фракции. Дополнительная информация получается путем изучения высокую эффективность Полисома фракций отдельно от низкой эффективности Полисо...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Полисома профиль анализ позволяет для изучения белков перевода, анализируя состояние трансляционная конкретные мРНК или весь транскриптом6,7. Это также большую помощь, когда местные перевода необходимо изучить такие синаптосомах8. Традиционно этот метод предполагает разделение моно - и полирибосомы и связанные mRNAs на градиент сахарозы, который может быть в сочетании с геномной или proteomic методы для получения желаемых результатов

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

P01 низ HL112730 (тряпка, JVE), низ R01 HL132075 (тряпка, JVE), центр сердца женщин Барбра Стрейзанд (тряпка, JVE), Дороти и э. Филипп Лион стул в молекулярной кардиологии (ветошь), Эрика Глейзер наделены стул в женском здоровье сердца (JVE) и Чешской академии наук Институциональная поддержка РВО: 68081715 (МС).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ПентобарбиталVortech Phamaceuticals9373для эвтаназии
HeparinSagent103424используется в щипцах для подготовки лангендорфа
Fine Science Tools91110-10используется для подвешивания сердца
Система ЛангендорфаRadnoti + домашняя н/д Система«четыре сердца», состоящая из изготовленного на заказ выдувного стекла, трубок и водяных бань
NaClSigmaS7653-5KGБуфер Кребса и градиент сахарозы
KClSigmaP5405Буфер Кребса и лизисный буфер
KH2PO42SigmaP-5504Буфер Кребса
MgSO4SigmaM7774-500GБуфер Кребса
Глюкоза SigmaG5767Буфер Кребса
CaCl2SigmaC1016-500GKrebs буфер
Сахарозный порошокSigmaS0389-1KGГрадиент сахарозы
MgCl2Sigma208337Сахарозный градиент и лизис буфер
Tris-baseSigmaT1503-1KGСахарозный градиент и лизисный буфер
Xylene CyanoleSigmaX-4126Градиент сахарозы
ЦиклогексимидSigma-aldrich239763градиент сахарозы и буфер для лизиса
РНКазаOUTLife TechnologiesC00019Ингибитор РНКазы для буфера лизиса
Igepal CA-360 (NP40)SigmaI3021Буфер для лизиса
Ингибитор протеазы Коктейль в таблетках, без ЭДТАRoche5056489001
Трубка, тонкостенная, ультрапрозрачная, 13,2 мл, 14 мм x 89 ммBeckman Coulter344059
ультрацентрифугаBeckmanLE-80KУльтрацентрифугирование градиентов
РоторBeckmanSW41Ультрацентрифугирование градиентов
Biologic LP (насос)Biorad731-8300Фракционирование градиентов
BioFracBiorad741-0002Фракционирование градиентов
микроцентрифужных пробирок Eppendorf RNA/DNA LoBind, пробирки 2 мл SigmaZ666513-100EAGradient fraction и экстракции РНК
TRIzol ReagentLife technologiesAM9738Экстракция РНК
Luciferase Control RNAPromegaL4561Экстракция РНК
ChloroformFisher ScientificC606-4РНК
экстракция Гликоген, РНК классаThermo Fisher ScientificR0551Экстракция РНК
ИзопропанолSigmaI9516Экстракция РНК
ЭтанолSigmaE7023-1LЭкстракция РНК
iScript cDNA Synthesis KitBioRad170-8891Обратная транскрипция
iTaq Universal SYBR Green SupermixBioRad175-5122Набор для количественной ПЦР
miRNeasy Micro Kit (50)Набор Qiagen217084для выделения общей РНК
miScript II RT Kit (50)Qiagen218161Набор для обратной транскрипции микроРНК
miScript Sybr Green PCR Kit (200)Qiagen218073Набор для анализа экспрессии микроРНК в реальном времени для ПЦР в реальном времени
Центрифуга 5424REppendorfДля центрифугирования пробирок объемом 1,5 мл или 2,0 мл при различных температурах. Максимальная скорость - 21130 x g
Центрифуга 5810REppendorfДля центрифугирования ПЦР-планшетов в режиме реального времени при различных температурах. Максимальная скорость - 2039 x
g My Cycler Thermal CyclerBio-RadДля обратной транскрипции
CFX96 Real-Time System/C1000 Touch Thermal CyclerBio-RadДля анализа ПЦР в реальном времени
miRNeasy Serum/Plasma Spike-in ControlQiagen219610Для контроля качества выделения РНК
Hard-Shell 96-Well PCR Plates, низкопрофильные, тонкостенные, с юбкой, зеленый/прозрачныйBio-RadHSP9641Для анализа ПЦР в реальном времени
Microseal 'B' Пленка для запайки ПЦР-планшетов, клей, оптическаяBio-RadMSB1001Для герметизации ПЦР-планшетов в реальном времени
Исследования плюс одноканальная пипетка, серая; 0,5-10 &; LEppendorfUX-24505-02Для пипетирования
PIPETMAN Classic Pipets, P20GilsonF123600Gдля пипетирования
PIPETMAN Classic Pipets, P200GilsonF144565для пипетирования
Rainin L-1000XLS Pipet-Lite XLS LTS Pipette 100-1000 &; LGilson17011782Для пипетирования
гликогена, РНК классаThermo Fisher ScientificR0551Повышает эффективность выделения общей РНК
Posi-Click 1,7 мл Пробирки, натуральный цветDenvilleC2170РНК выделение и хранение; смесь реагентов
Thermal Cycling Tubes -0,2 мл Individual Caps, стандартные 0,2 мл пробирки с оптическимDenvilleC18098-4 (1000910)Реакция обратной транскрипции
Sharp 10 Прецизионный барьерНаконечники DenvilleP1096-FRДля пипетирования
Sharp 20 Прецизионный барьерНаконечники DenvilleP1121Для пипетирования
Sharp 200 Прецизионный барьер НаконечникиDenvilleP1122Для пипетирования
Наконечники LTS 1 мл ФильтрRaininRT-L1000FДля пипетирования
miScript Primer Assay ( 200)Qiagen(он изменяется в зависимости от микроРНК)Для анализа ПЦР в реальном времени
Gradient Master ver 5.3 Model 108BioComp InstrumentsДля получения градиентов сахарозы
трихлоруксусная кислотаSigma AldrichT6399
ацетонSigma Aldrich650501
трис гидрохлоридAmrescoM108
дитиотреитолFisher ScientificBP172
йодоацетамидGbiosciencesRC-150
секвенирование модифицированный трипсин, свинойPromegaV5111
бикарбонат аммонияBDHBDH9206
муравьиной кислотой, метанол Optima LC/MSFisher ChemicalA117
Optima LC/MSFisher ChemicalA454
ацетонитрил, Optima LC/MSFisher ChemicalA996
Protein LoBind пробирки 0,5 млEppendorf AG22431064
пробирки Protein LoBind 1,5 млEppendorf AG22431081
HLB &; Элюирующая пластина 30 & микро; mOasis186001828BA
концентратор SpeedVacThermo ScientificSavant SPD2010
соникQsonicaOasis180
центрифугаThermo ScientificSorvall Legend микро 21R
LC колонна для ловушек PepMap 100 C18Thermo Scientific160454
LC сепарирующая колонна PepMap RSLC C18Масс-спектрометр Thermo Scientific164536
Масс-спектрометрThermoScientific Orbitrap Elite ионная ловушка
MSConvert программное обеспечениеProteoWizard Toolkit
Sorcerer-SEQUEST программное обеспечениеSage-N Research, Inc.
,

Ссылки

  1. Pourpirali, S., Valacca, C., Merlo, P., Rizza, S., D’Amico, S., Cecconi, F. Prolonged pseudohypoxia targets ambra1 mrna to p-bodies for translational repression. PLoS ONE. 10, e0129750(2015).
  2. Andres, A. M., Tucker, K. C., Thomas, A., Taylor, D. J., Sengstock, D., Jahania, S. M., Dabir, R., Pourpirali, S., Brown, J. A., Westbrook, D. G., Ballinger, S. W., Mentzer, R. M. Jr, Gottlieb, R. A. Mitophagy and mitochondrial biogenesis in atrial tissue of patients undergoing heart surgery with cardiopulmonary bypass. JCI Insight. 2, e89303(2017).
  3. Kislinger, T., Cox, B., Kannan, A., Chung, C., Hu, P., Ignatchenko, A., Scott, M. S., Gramolini, A. O., Morris, Q., Hallett, M. T., Rossant, J., Hughes, T. R., Frey, B., Emili, A. Global survey of organ and organelle protein expression in mouse: Combined proteomic and transcriptomic profiling. Cell. 125, 173-186 (2006).
  4. Kren, B. T., Wong, P. Y., Shiota, A., Zhang, X., Zeng, Y., Steer, C. J. Polysome trafficking of transcripts and micrornas in regenerating liver after partial hepatectomy. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 297, G1181-G1192 (2009).
  5. Gottlieb, R. A., Pourpirali, S. Lost in translation: Mirnas and mrnas in ischemic preconditioning and ischemia/reperfusion injury. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 95, 70-77 (2016).
  6. Coudert, L., Adjibade, P., Mazroui, R. Analysis of translation initiation during stress conditions by polysome profiling. Journal of Visualized Experiments. , (2014).
  7. Lorsch, J. Methods in enzymology. Laboratory methods in enzymology: Rna. Preface. Methods in Enzymology. 530, xxi(2013).
  8. Kuzniewska, B., Chojnacka, M., Milek, J., Dziembowska, M. Preparation of polysomal fractions from mouse brain synaptoneurosomes and analysis of polysomal-bound mrnas. Journal of Neuroscience Methods. 293, 226-233 (2018).
  9. He, S. L., Green, R. Polysome analysis of mammalian cells. Methods in Enzymology. 530, 183-192 (2013).
  10. Molotski, N., Soen, Y. Differential association of micrornas with polysomes reflects distinct strengths of interactions with their mrna targets. RNA. 18, 1612-1623 (2012).
  11. Maroney, P. A., Yu, Y., Fisher, J., Nilsen, T. W. Evidence that micrornas are associated with translating messenger rnas in human cells. Nature Structural and Molecular Biology. 13, 1102-1107 (2006).
  12. Paul, P., Chakraborty, A., Sarkar, D., Langthasa, M., Rahman, M., Bari, M., Singha, R. S., Malakar, A. K., Chakraborty, S. Interplay between mirnas and human diseases. Journal of Cellular Physiology. 233, 2007-2018 (2018).
  13. Rupaimoole, R., Slack, F. J. Microrna therapeutics: Towards a new era for the management of cancer and other diseases. Nature Reviews Drug Discovery. 16, 203-222 (2017).
  14. Nelson, P. T., Hatzigeorgiou, A. G., Mourelatos, Z. Mirnp:Mrna association in polyribosomes in a human neuronal cell line. RNA. 10, 387-394 (2004).
  15. Nottrott, S., Simard, M. J., Richter, J. D. Human let-7a mirna blocks protein production on actively translating polyribosomes. Nature Structural and Molecular Biology. 13, 1108-1114 (2006).
  16. Kim, J., Krichevsky, A., Grad, Y., Hayes, G. D., Kosik, K. S., Church, G. M., Ruvkun, G. Identification of many micrornas that copurify with polyribosomes in mammalian neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 360-365 (2004).
  17. Androsavich, J. R., Chau, B. N., Bhat, B., Linsley, P. S., Walter, N. G. Disease-linked microrna-21 exhibits drastically reduced mrna binding and silencing activity in healthy mouse liver. RNA. 18, 1510-1526 (2012).
  18. Kraushar, M. L., Thompson, K., Wijeratne, H. R., Viljetic, B., Sakers, K., Marson, J. W., Kontoyiannis, D. L., Buyske, S., Hart, R. P., Rasin, M. R. Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the rna-binding protein hu antigen r. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , E3815-E3824 (2014).
  19. McClatchy, D. B., Ma, Y., Liu, C., Stein, B. D., Martinez-Bartolome, S., Vasquez, D., Hellberg, K., Shaw, R. J., Yates, J. R. 3rd Pulsed azidohomoalanine labeling in mammals (palm) detects changes in liver-specific lkb1 knockout mice. Journal of Proteome Research. 14, 4815-4822 (2015).
  20. Schiapparelli, L. M., McClatchy, D. B., Liu, H. H., Sharma, P., Yates, J. R. 3rd, Cline, H. T. Direct detection of biotinylated proteins by mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 13, 3966-3978 (2014).
  21. Wiśniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature Methods. 6, 359-362 (2009).
  22. Rajalingam, D., Loftis, C., Xu, J. J., Kumar, T. K. Trichloroacetic acid-induced protein precipitation involves the reversible association of a stable partially structured intermediate. Protein Science. 18, 980-993 (2009).
  23. Fic, E., Kedracka-Krok, S., Jankowska, U., Pirog, A., Dziedzicka-Wasylewska, M. Comparison of protein precipitation methods for various rat brain structures prior to proteomic analysis. Electrophoresis. 31, 3573-3579 (2010).
  24. Sashital, D. G., Greeman, C. A., Lyumkis, D., Potter, C. S., Carragher, B., Williamson, J. R. A combined quantitative mass spectrometry and electron microscopy analysis of ribosomal 30s subunit assembly in e. Coli. Elife. 3, (2014).
  25. Liang, S., Bellato, H. M., Lorent, J., Lupinacci, F. C. S., Oertlin, C., van Hoef, V., Andrade, V. P., Roffé, M., Masvidal, L., Hajj, G. N. M., Larsson, O. Polysome-profiling in small tissue samples. Nucleic Acids Research. 46, e3(2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Полисомный профильэкстракция белковосаждение трихлоруксусной кислотойсахарозный градиентультрацентрифугированиеанализ мРНКишемия-реперфузия
Динамический протеомных и Мирна анализ Polysomes от изолированных мыши сердца после Langendorff перфузии
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.