Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

В пробирке Дифференциация мыши гранулоцитарно макрофагального колониестимулирующий фактор (ГМ КСФ)-производящ клетки T вспомогательный (THGM)

6.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/58087

⸱

10 сентября 2018 г.

 ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 2Immunology Programme, Life Sciences Institute, National University of Singapore, 3Cancer Science Institute of Singapore, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол дифференцировать мышиных granulocyte-macrophage-colony-stimulating-factor-producing T (THGM) хелперы из клеток CD4 + T наивно, включая изоляции наивно CD4 + Т-клеток, дифференциация THGM, и анализ дифференцированных клеток THGM. Этот метод может применяться для изучения положения и функции клеток THGM.

Аннотация

Гранулоцитарно макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ)-производство клеток T вспомогательный (THGM) является подмножеством недавно выявленных вспомогательные клетки T, что преимущественно выделяет ГМ-КСФ без производства Гамма интерферон (ИФН) или интерлейкина (IL) -17 и оказывается играть важную роль в аутоиммунных neuroinflammation. Метод изоляции клеток CD4 + T наивно от одноклеточного приостановления splenocytes и поколения клетки THGM от наивного CD4 + Т-клеток было бы полезным методом в исследовании T клеточный иммунитет и аутоиммунных заболеваний. Здесь мы описываем метод, который отличает мыши наивно CD4 + Т-клеток в клетки THGM, пропагандируемые IL-7. Итоги дифференциация оценивалась путем анализа выражения цитокинов, с использованием различных методов, включая внутриклеточных цитокинов, пятнать в сочетании с проточной цитометрии, количественных реального времени полимеразной цепной реакции (ПЦР), и энзим соединенный иммуноферментного анализа (ИФА). Используя протокол дифференциация THGM как описано здесь, около 55% клеток выразил ГМ-КСФ с минимальным выражением IFNα или ил-17. Преобладающим выражение ГМ-КСФ клетками THGM далее подтверждается анализ экспрессии и ГМ-КСФ, IFNα, Ил-17 уровня мРНК и белка. Таким образом, этот метод может использоваться для различения наивно клеток CD4 + T THGM клеток в пробирке, которые будут полезны в изучении биологии клетки THGM.

Введение

Хелперы CD4 + T (TH) являются важнейшими компонентами иммунной системы, что решающую роль в принимающей обороны против патогенных микроорганизмов, наблюдения рак и аутоиммунные заболевания1,2,3. После активации клеток T рецептор (TCR) наивно CD4 + Т-клеток могут быть дифференцированы в TH1, T 2H, TH 17, или регулирования T (Treg) клеток под влиянием различных цитокинов кругах2,4, 5. Недавно, новый подмножество клеток TH , который преимущественно производит ГМ-КСФ, определены и назвал THGM6. Дифференцировка клеток THGM обусловлено IL-7 путем активации сигнала датчика и активатор транскрипции 5 (STAT5). Эти клетки выразить большое количество ГМ-КСФ имея низкий выражение других TH-клетки подпись цитокинов, таких как IFNγ и IL-176. Было установлено, что ГМ-КСФ играть решающую роль в развитии CD4 + Т клеток опосредованной neuroinflammation7,8. По сравнению с IFNγ - или ил-17-выражая аутореактивная Т-клеток, ГМ-КСФ выражая T клетки передана одичал тип (WT) мышей вызвало ранее заболевания и более высокой тяжести заболевания. Кроме того клетки T Csf2- / - не побудить Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (EAE) после восприимчивую передается WT получателям, тогда как Т-клетки, не хватает IFNγ или ил 17а сохранили способность посредником ЕАЕ7. Кроме того блокада ГМ-КСФ использование нейтрализующих антител смягчены ЕАЕ болезни тяжести8. Кроме того дефицит STAT5 в Т-клетки мышей привело в уменьшилось поколения THGM и, следовательно, сопротивление мышей ЕАЕ развития6. Эти выводы подчеркивают важность ГМ-КСФ выражая TH клеток в neuroinflammatory аутоиммунных заболеваний. Таким образом установление метода дифференцировать ГМ-КСФ выражая TH клетки от наивного CD4 + Т-клеток было бы важно в изучении патогенеза аутоиммунного neuroinflammation и T клеточного иммунного ответа. Однако протокол, эффективно создает THGM клетки из мышиных наивен, что CD4 + установлено не было.

Здесь мы представляем метод, который отличает мышиных THGM клетки от наивного CD4 + Т-клеток. Этот протокол описывает всю процедуру, включая извлечение хандры от мыши, подготовка одноклеточных подвеска, выбор положительный CD4, активируемых флуоресценции клеток, сортируя (FACS) и клеток TH дифференциация и анализа. Дифференцированные Т-хелперы анализируются внутриклеточных цитокинов, пятнать в сочетании с проточной цитометрии определить выражение cytokine на уровне одной ячейки, Количественная ПЦР в реальном времени чтобы определить выражение cytokine на уровне мРНК, и по ELISA оценить выражение cytokine уровня белка. Этот метод может применяться для исследования биологии клетки THGM в различных условиях, таких как ЕАЕ, где ГМ-КСФ играет важную роль в патогенезе.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все мыши, используемые в настоящем протоколе были на фоне генетических C57BL/6 и размещается в определенных условиях свободной от возбудителя в национальном университете Сингапура. Все эксперименты проводились с использованием протоколов, одобренных институциональный уход животных и использование Комитета из национального университета Сингапура.

1. реагента и подготовка

  1. Подготовка 500 мл фосфат амортизированное saline (PBS), содержащий 2% плода бычьим сывороточным (ФБС) и 1 мм Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА).
    Примечание: Сохраняйте буфер на льду на протяжении всей процедуры для получения оптимальных результатов.
  2. Подготовка 50 мл полного RPMI носителя, содержащего RPMI 1640, 10% FBS и 1% пенициллин стрептомицином. Используйте полный RPMI СМИ, содержащие 50 мкм β-меркаптоэтанол для дифференцировки клеток THGM. Добавьте β-меркаптоэтанол зонта.
  3. Подготовьте 7,5 мл смеси антитела анти CD3e путем разбавления анти CD3e в основном складе 3 мкг/мл в PBS. Слой пластины 48-хорошо, добавив 150 мкл антител смеси для каждой скважины и инкубировать пластины при 37 ° C по меньшей мере 1 h, или на 4 ° C на ночь.
  4. Стерилизовать пару ножниц и щипцы и держать их в 70% этанол между вскрытия.

2. Подготовка мышиных Splenocytes

  1. Усыпить мыши (по 6-8 недель) с помощью институционально утвержденного CO2 удушья или шейки матки дислокации. Спрей мышь с 70% этанола и смонтировать его на полистирола блок на своей спине. Передать мыши биологической безопасности кабинета выполните следующие действия.
  2. Придерживайте кожу с помощью пары щипцов и вырезать кожу чуть ниже грудной клетки на левой стороне для около 4 см, используя ножницы. Откройте перитонеальный sac подвергать селезенки и использовать стерильные щипцы для извлечения селезенки.
  3. Поместите стрейнер ячейки 70 мкм на 50 мл трубки и предварительно смочить его с 2 мл буфера. Селезенки на ячейки фильтра (2-3 селезенки для одной ячейки фильтра) и размякнуть их с помощью конца поршень шприца 5 мл.
  4. Промойте ситечко и трубка несколько раз с 1-2 мл ячейки изоляции буфера до тех пор, пока все ячейки сбрасываются в трубу. Отменить ячейки сита и центрифуги клетки на 350 x g 5 мин при 4 ° C. Выбросите супернатант.
  5. Ресуспензируйте клетки лепешка с 5 мл холодной (4 ° C) аммония хлорид-калия (ACK) лизировать буфер (150 мм NH4Cl, 10 мм KHCO3, 0,1 мм Na2ЭДТА; рН 7,2 – 7,4) и осторожно перемешать добавить 10 мл 2 мин полный RPMI СМИ для нейтрализации ACK буфер и немедленно центрифуга клетки на 350 x g 5 мин при 4 ° C. Отбросить надосадке после центрифугирования.

3. изоляция CD4 + T клетки с помощью магнитных CD4 микрошарики и столбец разделения клетки

  1. Ресуспензируйте Пелле клеток в 5 мл буфера изоляции клеток. Фильтрации суспензии клеток, используя фильтр разделительный (30 мкм) в новый 15-мл пробирку для удаления любого мусора.
  2. Возьмите 10 мкл суспензии клеток и сделать 10 x разрежения, добавив 90 мкл буфера. Взять 10 мкл суспензии клеток разреженных и смешайте его с 10 мкл Трипановый синий для подсчета клеток. Подсчитать ячейки в Горяева для определения урожайности жизнеспособных клеток.
  3. Центрифуга клетки на 350 x g 5 минут при температуре 4 ° C и удалить супернатант.
  4. Ресуспензируйте клетки в 90 мкл буфера за 107 клеток. Добавьте 10 мкл магнитных CD4 микрошарики за 107 клеток. Инкубировать клетки для 15 мин при 4 ° C. Для получения оптимальных результатов перемешать суспензию клеток нежно каждые 5 минут во время инкубации.
  5. В то время как инкубации клеток, место столбец разделения на магнитную подставку. Предварительно Намочите столбец с 2 мл буфера.
  6. В конце инкубации клеток/шарик вымыть клетки с 5 мл буфера и центрифуги их на 350 x g 5 мин при 4 ° C. Выбросите супернатант.
  7. Ресуспензируйте клеток в 1 мл буфера, загрузить образец в столбце разделения клетки и пусть она потока через. Используйте 15-mL пластиковых пробирок для сбора фракция CD4-клеток. Добавьте 1 mL буфера мыть резервуар, прежде чем это сухой. Повторите шаг 2 x стиральная.
  8. Удалите столбец разделения клетки из магнитного стенд и поместите его на новых пластиковых пробирок 15мл. Добавить 2 мл буфера изоляции клеток в столбце разделение ячеек и применить поршень прочно для того, чтобы заставить клетки из столбца.
  9. Центрифуга дроби на 350 x g 5 минут при температуре 4 ° C для получения CD4 + клеток. Выбросите супернатант.

4. Очистка наивный CD4 + Т-клеток (CD4+CD25–CD44ЛоCD62LПривет) активирована флуоресценции сортировки клеток и THGM дифференциация

  1. Ресуспензируйте полученные гранулы CD4 + клеток в 500 мкл буфера. Смешать клетки с флуоресцентных конъюгированных антител смеси, содержащей CD4-PerCp (2,8 мкг/мл), CD44-APC (2,4 мкг/мл), CD25-PE (2 мкг/мл) и CD62L-FITC (10 мкг/мл) (Таблица 1). Инкубируйте клетки на льду для 20-30 мин, защищая их от света.
    Примечание: Ранее оптимизированы концентрации антител в лаборатории. Количество антител в списке является для клетки от 1 – 2 мышей.
  2. После инкубации вымыть клетки с 5 мл буфера и центрифуги клетки на 350 x g 5 мин при 4 ° C.
  3. Отменить супернатант и Ресуспензируйте клетки в 500 мкл буфера. Фильтр снова используя нейлоновая сетка клетки.
  4. Суспензию клеток передавать СУИМ трубка для сортировки клеток. Precoat коллекции СУИМ трубы с 500 мкл буфера.
  5. Получения CD4+CD25–CD44ЛоCD62LПривет населения (наивных CD4+ T клетки) сортируя СУИМ. Ворота на CD4+CD25– первый, а затем выберите CD44ЛоCD62LПривет клетки от этого населения.
  6. Собирать наивно CD4+ T клетки фракций в новом 15-mL пластиковых пробирок. Центрифуга клетки на 350 x g 5 минут при температуре 4 ° C и удалить супернатант.
  7. Ресуспензируйте наивно CD4 + Т-клеток в концентрации 106 клеток/мл в полной RPMI СМИ, содержащие 50 мкм β-меркаптоэтанол.
  8. Аспирационная антител анти CD3e, используется для намывного в 48-ну пластины. Семя 0,25 млн (250 мкл) клетки в каждой скважине с ил-7 (2 нг/мл), анти CD28 (1 мкг/мл) и анти IFNγ (10 мкг/мл) (Таблица 1).
    Примечание: Концентрации цитокинов и антитела были оптимизированы ранее в лаборатории для дифференцировки клеток THGM.
  9. Инкубируйте клетки при 37 ° C с 5% CO2 на 3 дня. Не изменяйте носитель во время инкубации.

5. Анализ клеток мыши THGM сгенерирована In Vitro

  1. С помощью микроскопа, проверьте дифференцировки клеток 3 d после дифференциации. Урожай клетки и центрифуги их на 350 x g 5 мин при 4 ° C. Вымыть клетки 2 x с полным RPMI СМИ.
    Примечание: Дифференцированных клеток больше по размеру, чем наивно CD4 + Т-клеток.
  2. Ресуспензируйте клеток в 1 мл полного RPMI средств массовой информации. Возьмите 10 мкл суспензии клеток и смешать его с 10 мкл Трипановый синий для определения количества клеток с Горяева. Разделите на три зелья рестимуляции и анализа дифференцированных клеток.
    Примечание: Пятнать внутриклеточных цитокинов и ELISA assays требуют ≥0.5 миллионов клеток, и ПЦР анализ требует ≥ 1 миллион клеток.
  3. Для окрашивания внутриклеточных цитокинов, активизации клеток с phorbol 12-миристат 13-ацетат (PMA) (100 нг/мл) и ionomycin (1 мкг/мл) в присутствии ингибитор транспортного белка (1 мкл/мл) для 4-6 ч.
    1. Урожай клетки и пачкает их с антитела анти CD4 (PerCP спрягаются, 0,2 мг/мл, 1: 100 разрежения; или FITC-спрягаются, 0.5 мг/мл, разведение 1: 100) за 30 мин.
    2. Исправьте клетки с 200 мкл буфера фиксации для 20 – 60 мин. После фиксации, вымыть клетки 2 x с 1 мл permeabilization буфера.
    3. Выполните внутриклеточных окрашивание с антителами против ГМ-КСФ (PE-спрягаются, 0,2 мг/мл, разбавления 1: 100), IL-17а (FITC-спрягаются, 0.5 мг/мл, разведение 1: 100; APC-conjugated, 0,2 мг/мл, разведение 1: 100), Ил-4 (APC-спрягаются, 0,2 мг/мл, разведении 1: 100), а IFNγ (APC-спрягаются, 0,2 мг/мл, разведение 1: 100; PE-conjugated, 0,2 мг/мл, разведение 1: 100) за 30 мин в темноте.
  4. Для ПЦР анализ экспрессии генов цитокинов, дифференцированных клеток Активируйте клетки с привязкой к пластине анти CD3e (3 мкг/мл) (грунтовочный пластины, как описано в шаге 1.3). В 3 ч после стимуляции урожай клетки, чтобы изолировать всего РНК с помощью фенола РНК добыча реагент для подготовки cDNA ПЦР. Грунты и программа, используемая для ПЦР, перечислены в таблицах 2 и 3, соответственно.
  5. Для анализа белка секрецию цитокинов путем дифференцированных клеток активизации клеток с привязкой к пластине анти CD3e (3 мкг/мл) на 24 часа (грунтовочный пластины, как описано в шаге 1.3). Урожай клеточной культуры супернатанта для Ил-17 и ГМ-КСФ ELISA для определения их концентрации.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Наивный CD4 + Т-клеток, изолированных от двух 8-недельных самцов мышей C57BL/6 были разделены на три части. Одна часть клеток была дифференцированной в клетки THGM после описанных протокол. Другая часть была культивированный под условие THGM присутствии антитела анти Ил-4 (10 мкг/мл) для проверки влияния Ил-4 блокады в дифференциации THGM. Последняя часть была культивировали при условии TH17 дифференциации (3 мкг/мл анти CD3e, 1 мкг/мл анти CD28...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Здесь мы описали протокол в vitro THGM дифференциации от мыши наивно CD4 + клеток, следуют анализ дифференцированных клеток для проверки метода. Следует отметить селезенке и лимфатических узлах может использоваться для наивного CD4 + Т-клеток очистки и THGM дифференциации. Выражение cytokine, определяется внутриклеточных цитокинов окрашивания, в сочетании с проточной цитометрии, показали, что около 55% клеток были вынуждены стать ГМ-КСФ выражая клеток в условиях THGM (

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Это исследование было поддержано субсидий из национального университета здравоохранения системы Сингапура (T1-2014-Окт-12 и 10 сентября T1-2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
RPMI 1640BiowestL0500-500
FBS ТермоинактивированныйCapricornFBS-HI-12A
Пенициллин-стрептомицинGibco15140122
10xPBS 1st BaseBUF-2040-10Разведенный до 1x PBS в стерильной воде
EDTA1st BaseBUF-1053-100ml-pH8.0
10x ACK буферBiolegend420301разведенный в стерильной воде
Клеточный фильтрSPL Life Sciences93070
CD4 микрогранулыMiltenyi Biotec130-049-201
2-меркаптоэтанолSigmaM7522
LS колонкаMiltenyi Biotec130-042-401
магнитный стендMiltenyi Biotec130-042-303
Шприц 1 млTerumoSS+01T
ЦентрифугаEppendorfEppendorf 5810R
Сортировщик клеток Sony SY3200Сортировщикклеток Sony Sony SY3200
Коническая центрифуга 50 мл Коническая центрифугаGreiner Bio-One210261
15 мл Коническая центрифугаGreiner Bio-One188271
FACS пробиркаCorning352054
24 лунки клеточная культуральная пластинаGreiner Bio-One662160
антимышиный CD4 PerCP-eFluor 710eBioscience46-0041-82
PE конъюгированный антимышиный CD25 (IL-2Ra, p55)eBioscience12-0251-82
античеловеческий/мышиный CD44 APCeBioscience17-0441-82
антимышиный CD62L FITCeBioscience11-0621-85
Улучшенная счетная камера NeubauerMarienfeld640010
Hyclone Trypan Blue SolutionGE здравоохранение Медико-биологические наукиSV30084.01
МикроскопNikonNikon Elipse TS100
Purified  антимышиный CD3e  антителоBiolegend100314
Очищенный хомяк антимышиный CD28BD Biosciences553295
Очищенная крыса  антимышиный ИФН&гамма;  eBioscience16-7312-85
Очищенное антитело к мышиному IL-4Biolegend504102
рекомбинантный мышиный белок IL-7R& D system407-ML
рекомбинантный человеческий TGF-betaR& D система240-B-010
PMAMerck Millipore19-144
ИономицинSigmaI0634
Ингибитор переноса белка GolgiPlugBD Biosciences51-2301KZ
Внутриклеточная фиксация и Набор буферов для пермеабилизацииeBioscience88-8824-00
антимышиный GM-CSF PEeBioscience12-7331-82
FITC антимышиный IL-17ABiolegend506908
APC антимышиный ИФН-гаммаBiolegend505810
GO Taq qPCR мастер-миксPromegaA6002
мышь GM-CSF ELISA Ready-SET-Go!invitrogen88-7334-88
Мышь IL-17A Uncouted ELISAinvitrogen88-7371-22

Ссылки

  1. Zhu, J., Paul, W. E. CD4 T cells: fates, functions, and faults. Blood. 112, 1557-1569 (2008).
  2. Kara, E. E., et al. Tailored immune responses: novel effector helper T cell subsets in protective immunity. PLoS Pathogens. 10, e1003905(2014).
  3. Bou Nasser Eddine, F., Ramia, E., Tosi, G., Forlani, G., Accolla, R. S. Tumor Immunology meets...Immunology: Modified cancer cells as professional APC for priming naive tumor-specific CD4+ T cells. Oncoimmunology. 6, e1356149(2017).
  4. Dong, C. TH17 cells in development: an updated view of their molecular identity and genetic programming. Nature Reviews. Immunology. 8, 337-348 (2008).
  5. Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., Kuchroo, V. K. IL-17 and Th17 Cells. Annual Review of Immunology. 27, 485-517 (2009).
  6. Sheng, W., et al. STAT5 programs a distinct subset of GM-CSF-producing T helper cells that is essential for autoimmune neuroinflammation. Cell Research. 24, 1387-1402 (2014).
  7. Codarri, L., et al. RORgammat drives production of the cytokine GM-CSF in helper T cells, which is essential for the effector phase of autoimmune neuroinflammation. Nature Immunology. 12, 560-567 (2011).
  8. El-Behi, M., et al. The encephalitogenicity of T(H)17 cells is dependent on IL-1- and IL-23-induced production of the cytokine GM-CSF. Nature Immunology. 12, 568-575 (2011).
  9. Ivanov, I. I., et al. The orphan nuclear receptor RORgammat directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells. Cell. 126, 1121-1133 (2006).
  10. Zhang, J., et al. A novel subset of helper T cells promotes immune responses by secreting GM-CSF. Cell Death and Differentiation. 20, 1731-1741 (2013).
  11. Croxford, A. L., Spath, S., Becher, B. GM-CSF in Neuroinflammation: Licensing Myeloid Cells for Tissue Damage. Trends in Immunology. 36, 651-662 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

GMCD4GM CSF
В пробирке Дифференциация мыши гранулоцитарно макрофагального колониестимулирующий фактор (ГМ КСФ)-производящ клетки T вспомогательный (THGM)
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.