Методическая статья

Характеристика MLKL-опосредованной плазматической мембраны разрыв в Necroptosis

DOI:

10.3791/58088

⸱

7 августа 2018 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Structural Biology, St. Jude Children's Research Hospital, 2Department of Chemical Biology and Therapeutics, St. Jude Children's Research Hospital, 3Department of Immunology, St. Jude Children's Research Hospital

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы приводим методы для характеризации MLKL-опосредованной плазматической мембраны разрыв в necroptosis, включая обычные и конфокальная микроскопия клеток изображений, сканирующей электронной микроскопии и привязки на основе ЯМР липидов.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Necroptosis это путь запрограммированной клеточной смерти вызваны активации рецептора, взаимодействующих киназу 3 (RIPK3), которая фосфорилирует и активирует смешанной родословной киназы как домен pseudokinase, MLKL, разрыв или разрушения плазматической мембраны . Necroptosis это воспалительные путь, связанный с несколькими патологий, включая аутоиммунные заболевания, инфекционные и сердечно-сосудистых заболеваний, инсульта, нейродегенеративные и рак. Здесь мы описываем протоколы, которые могут использоваться для характеристики MLKL как палач разрыв мембраны плазмы в necroptosis. Мы визуализировать процесс necroptosis в клеток с использованием клеток изображений с обычными и конфокальный флуоресцентной микроскопии и фиксированных ячеек с помощью электронной микроскопии, которые вместе показали перераспределения MLKL от цитозоль для плазмы мембрана до индукции больших отверстий в плазматической мембраны. Мы представляем в vitro ядерного магнитного резонанса (ЯМР) анализ с использованием липиды для выявления предполагаемых модуляторы MLKL-опосредованной necroptosis. На основе этого метода, мы определили как важнейших связующих MLKL, которые требуются для ориентации плазматической мембраны и permeabilization в necroptosis количественные липидов привязки предпочтений и фосфатидилхолин инозитол фосфаты (PIPs).

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Определение генетических компонентов necroptosis способствовало использование животных моделей для проверки причастности necroptosis в физиологии и болезни1,2,3,4,5. Нокаут RIPK3 или MLKL в мышах имеет минимальные последствия развития и взрослого гомеостаза, предполагая, что necroptosis не имеет важное значение для жизни3,6. Кроме того некоторые виды не содержат RIPK3 или MLKL генов, поддерживая роль неосновных necroptosis в животных,7,8. С другой стороны сложные нокаут животных моделей с различными патологиями, индуцированной в лаборатории показали важную роль necroptosis в воспаление и врожденный иммунитет, вирусные инфекции9,10, 11 , 12.

Necroptosis может быть активирован несколькими способами передачи сигналов через различные врожденного иммунитета датчики, все из которых приводят к активации RIPK31,,1314. Активные RIPK3 в свою очередь фосфорилирует и активирует MLKL3,4,5,6,,78,9,10 ,11,12,13,14,,1516,17,18. Наиболее изучены, и возможно наиболее сложные пути, ведущие к активации RIPK3 включает смерть рецептор перевязки, который может разветвлять каждой присваивать по течению состав тонального комплексов либо навести apoptosis или necroptosis1. Necroptosis наступает при сигнализации через RIPK1 благоприятствования и результаты участия RIPK319,20. Этот результат легко благоприятствования по фармакологическим ингибирования или генетических удаления caspase 8, предполагаемый эндогенных ингибиторов necroptosis, которая держит в страхе necroptosis. RIPK1 связывается и активирует RIPK3. Еще один способ, чтобы активировать necroptosis — через Толл подобные рецепторы TLR3/TLR4 сигнализации, который привлекает и активирует RIPK3 через МДП домен содержащих вызывая адаптер-интерферона β (TRIF)21. Еще еще один способ умереть от necroptosis является активация ДНК датчика DAI, который непосредственно занимается и активирует RIPK322.

MLKL — цитозольной белок состоит из N-терминальный спирали расслоение (NB) домена и домен pseudokinase C-терминал (psKD) соединены регулирования Брейс область3. В нормальных клетках MLKL находится в цитозоле, где он считается неактивного комплекса с RIPK314. Активация necroptosis вызывает фосфорилирование RIPK3 MLKL в петле активации psKD, и потенциально дополнительные сайты в NB и фигурная скобка3,15,23. Фосфорилирование вызывает конформационные изменения в MLKL, что приводит к диссоциации от RIPK314. Плохо понимали конформационные изменения версии скобу с psKD24. Брейс, которая содержит 2 спиралей, посредником олигомеризации MLKL в предполагаемый тример через C-терминала спирали25. N-терминальный спирали скобу подавляет NB домен, который имеет важное значение для мембраны permeabilization24,26. В изоляции NB домен достаточно, чтобы побудить плазматической мембраны permeabilization и necroptosis16,24,27. Про necroptotic активность NB была воссоздана в мыши эмбриональных фибробластов в MLKL (mlkl- / - MEFs). NB — это домен привязки липидов, что преимущественно занимается дифосфат фосфатидилинозитол 4,5 фосфолипидов (пункт2). Мы предложили поэтапного механизм активации MLKL, в котором Брейс олигомеризации облегчает набор MLKL к плазматической мембране через слабого взаимодействия NB с PIP2 полярные начальник группы24. В мембраны NB подвергается регулируемого воздействия дополнительного высокоспецифичные связывающие сайта для пункта2, который замаскированы скобу в неактивных MLKL. В целом несколько взаимодействий NB с PIP2 дестабилизировать плазматической мембраны, ведущих к ее разрыву, хотя молекулярный механизм этих событий не выяснены.

Здесь мы иллюстрируем конкретные методы, используемые для описания функции MLKL как палач necroptosis24. В частности мы сосредоточены на самых минимальных домен MLKL, NB и фигурной скобкой (НББ), который регулируется Брейс торможение и может быть активировано через насильственных димеризации побудить плазмы плодного и necroptosis. Мы описываем наши системы индуцибельной выражение в сочетании с насильственных наркотиков индуцированной FKBP-опосредованной димеризации для клеток и электронной микроскопии клетки проходят necroptosis. Кроме того мы показываем наши в vitro ЯМР анализ взаимодействия Нацбанка с phosphatidylinositols (PIPs).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. клонирование и клеточной линии поколения

  1. PCR усиливает НББ региона, соответствующий аминокислотных остатков 1-140 (140НББ), от человека MLKL cDNA для в кадр стандарта энзима ограничения based клонирование с олигомеризации домена 2 x FK506 белок (2xFKBP или 2xFV) и Венеры люминесцентные белка в доксициклин (Dox) - индуцибельной ретровирусной вектор pRetroX-TRE3G для получения НББ140- 2xFV-Венера (Таблица 1, цифры 1A-B).
  2. Основной mlkl- / - или ripk3- / - mlkl- / - мышь эмбриональных фибробластов (MEFs) получено от соответствующих доступных мышей в зеленый лаборатории переходных трансфекции с SV40-большой антигена увековечивают выражая плазмиды. Выберите увековечен клетки в ~ 1-2 недели и поддерживать в DMEM дополнена 10% плода бычьим сывороточным (ФБС), 2 мм L-глютамином, 100 ед/мл пенициллина и стрептомицина, пируват натрия 1 мм и заменимые аминокислоты при 37 ° C и 5% CO2 в стандартные ткани Культура инкубаторы.
  3. Передают SV40, увековечено mlkl- / - MEFs с обратной тетрациклин контролируется transactivator (rtTA)-содержащих ретровируса, выразил от плазмида, содержащие ген сопротивления blasticidin (наш модифицированных плазмида) и лечения для 1 Неделя с 5 мкг/мл blasticidin для выбора ячеек, стабильно выражая rtTA28.
  4. Передают rtTA выражая MEFs с Dox индуцибельной ретровирусной вектор, содержащий химерных MLKL (pRetroX НББ140-2xFV-Венера-puro) и выберите с помощью 4 мкг/мл puromycin для одной недели, 2 дня после трансдукции.

2. жить Cell микроскопии изображений MLKL-опосредованной Necroptosis

  1. Плита mlkl- / - MEFs, выражая НББ140-2xFV-Венера на плотности 50 000 ячеек на хорошо (1 мл/а) в 24 хорошо пластины и инкубировать на ночь (рисA). Использование клеток пятная для автоматизированного клеток подсчета (см. Таблицу материалы).
  2. Лечить клетки для 12 h с Dox (0,5 мкг/мл) чтобы побудить выражение НББ140-2xFV-Венера.
  3. Побудить necroptosis с 25 Нм FKBP dimerizer (дим) в дополнение к 25 Нм мембраны непроницаемый зеленый флуоресцентных красителей (см. Таблицу материалы) в стандартной среде DMEM (см. 1.2). Клетки проходят necroptosis накапливаться красителя, как их плазматической мембраны целостность нарушалась НББ140-опосредованной разрыв. Выполнение анализов в трех экземплярах или составленном.
  4. Для контроля за necroptosis, с помощью единого или двойного цвета тепловизионных систем (см. Таблицу материалы), место судов в соответствующих изображений блок, размещенный в инкубаторе млекопитающих культуры ткани.
  5. Открытое программное обеспечение (см. Таблицу материалы) и выберите вкладку Расписание предстоящих сканирует в списке задач.
    Примечание: этот протокол для изображений с помощью систем одного цвета, но аналогичное программное обеспечение доступно для двойной цвет систем.
  6. Выберите «лоток, судно, типы сканирования» и «Сканировать шаблон» вкладку «Физический макет» и «Быстро флуоресценции» на вкладке Свойства.
  7. Добавить «Сканирования время», нажав на окно «Временная шкала» и общее число моментов времени и частоты приобретения (обычно 1 приобретение каждые 0,5 ч до 1 ч для 6 ч до 12 ч, или каждые 5 минут для быстрого кинетика necroptosis) и начать получение изображения, выбрав «App ly» (красная кнопка).
  8. Количественно с помощью программного обеспечения для анализа изображения necroptosis (см. Таблицу материалы), выбрав из «Панели задач», «Объект подсчета новый анализ с фиксированным сегментации порог выше фонового уровня», который может определяться зависания курсор мыши над регионами фон в нескольких изображений, используемых в анализе.
  9. Изучить флуоресцентных объектов, выбрав Просмотр с использованием текущего изображения и соответствующим образом откорректируйте пороговых уровней.
  10. Интегрировать зеленой флуоресценцией графов, открыв вкладку «Запустить новый анализ», выберите «Диапазон времени», выберите скважин анализироваться, введите имя «задания анализ» и нажмите «OK».
  11. Доступ проанализированы данные из вкладки «Анализ работы», дважды щелкнув на имя соответствующего задания и экспорт из окна графика/экспорт для дополнительного анализа в внешнего графического программного обеспечения (см. Таблицу материалы).
  12. Quantitate данных как зеленая Флуоресценция положительный (+ ve) счетчики/мм2 или нормализовать отсчеты путем слияния и выражаем данные как зеленая Флуоресценция + ve графов/слияния.
  13. При необходимости, в экспериментальной конечной точке, запятнать клетки с 100 Нм мембраны permeant флуоресцентный зеленый краситель (см. Таблицу материалы). Нормализации данных для % necroptotic клетки как отношение флуоресценции зеленый/зеленый флуоресценции в конечной точке.

3. жить клеточной Confocal микроскопии изображений набора плазматической мембраны и Permeabilization по MLKL

  1. Плита mlkl- / - MEFs, выражая НББ140-2xFV-Венера на плотность 20 000 ячеек на колодец (0,5 мл/а) в стакане дно камеры 4-ну микроскопии, предварительно обработанных с 50 мкг/мл фибронектин в PBS при 37 ° C за 30 мин и проинкубируйте ~ 12 h ( Рисунок 2B).
  2. Лечить клетки с Dox (0,5 мкг/мл) для ~ 12 h побудить выражение НББ140-2xFV-Венера.
  3. Вызвать necroptosis, инкубации с свежими среднего (1 мл/а), содержащие 25 Нм Dim заставить Нацбанк140-2xFV-Венера активации и транслокации к плазматической мембраны.
  4. Разместите камеру на вращающийся диск лазерного сканирования конфокального микроскопа построен на Перевернутый стенд оборудован экологического контроля и 63 1.4 NA цель и начать изображений приобретение с помощью программного обеспечения по выбору (см. Таблицу материалы).
  5. Инициализировать программного обеспечения, выберите значок «Фокус» и рекламы ЯФП конфигурации фильтра (возбуждения волны 515 нм).
  6. Найдите поле зрения и фокальной плоскости и взаимодействовать с системой обслуживания фокус, используя вкладку «Определенный фокус».
  7. Чтобы начать приобретение, выберите вкладку «Захват», следуют назначения конфигурации фильтра, соответствующие EMCCD камеры воздействия времени и интенсификация выгоды и параметров промежуток времени приобретения, включая интервал и длина приобретения.
  8. Контролировать сотовой перераспределения флуоресцентные НББ140-2xFV-Венера белков во время necroptosis путем приобретения фото каждые 10 s EMCCD камеры с помощью 515 нм лазер (фильм 1).
    Примечание: Фотообесцвечивание является проблемой с изображениями флуоресцентный белок. Венера является одним из более устойчивы флуоресцентных белков Фотообесцвечивание29. Если используются флуоресцентные белки, которые более чувствительны к Фотообесцвечивание, изображения каждые 30 s или больше времени, чтобы разрешить восстановление сигнала между изображений моментами времени.
  9. Для мониторинга плазматической мембраны ассоциации НББ140-2xFV-Венера во время necroptosis, изображение каждые 10 s образца подготовленный 3.3 полное внутреннее отражение флуоресценции микроскопии (TIRF), с помощью микроскопа оснащен автоматической слайдер TIRF и 100 x 1.4 NA цель и EMCCD камера (фильм 2). Выполните шаги 3,5 — 3,7, но отрегулировать угол TIRF в закладке фокус TIRF согласно толщины стекла образца и нижней палаты микроскопии.
    Примечание: маркеры плазматическую мембрану например LCK-C-ППП может использоваться как элементы управления для локализации плазматической мембраны в анализе TIRF.
  10. Выполнение обработки для повышения качества, свертка с отрицательным нормализованных второй производной функцией Гаусса (Марр алгоритм) изображений.

4. Электронная микроскопия

  1. Плита mlkl- / - MEFs, выражая НББ140-2xFV-Венера на плотности тарелок 5 миллионов клеток в плазме покрытием 150 мм ячейку культуры блюдо и инкубировать в течение 12 ч (рис. 3).
  2. Лечить клетки с доксициклин (0,5 мкг/мл) чтобы побудить выражение NB1-140-2xFV-Венера в течение 12 ч.
  3. Заставить Нацбанк140-2xFV-Венера активации и транслокации к плазматической мембраны с 25 Нм homodimerizer 5 мин. Это время устанавливается из кинетика necroptosis наблюдается в клеток.
  4. Удалите средства массовой информации и исправить клеток с использованием 10 мл 2,5% глютаральдегид, 2% параформальдегида в 0,1 М натрия cacodylate буфер рН 7,4 (cacodylate буфер) предварительно нагревают при 37 ° C.
  5. Собирать образца соскабливания и спина образцы для 10 мин на 500 x g. Выбросите супернатант.
  6. Постфиксная образца для 1,5 h в снижение 2% осмия тетраоксид с 1,5% Ферроцианид калия в буфер cacodylate натрия 0,1 М. Осмия тетраоксид является агентом окрашивание, широко используется в ТЕА для обеспечения контраст. Мы использовали ТЕА как предварительный анализ до SEM клетки проходят necroptosis.
  7. Промойте образца 5 раз в ультрачистая вода для 5 мин на 500 x g, следуют полоскания в буфере (см. 4.6), воды и этанола на процессоре автоматический. Выбросите супернатант.
  8. Для SEM пятно ранее фиксированной образцы с 1% уранила ацетат и свинца аспартат пятно метал31.
  9. Обезвоживает образцы через серию градуированных алкоголя и пропилена оксида решений.
  10. Внедрите образца в32 жесткий смолы для получения блока смолой.
  11. Стрижки толщиной 0,5 мкм, чтобы определить правильную область анализа.
  12. Герб образцы с ультра-тонкой пленки электрически проведение металла (Iridium).
  13. Изображения и анализировать образцы (рис. 3). Для количественной оценки, низкий увеличение изображения поверхности блока смолы с открытой клетки сканируется на 5 кэВ, с помощью электронного микроскопа.
  14. Визуализировать клетки через отдельные изображения захвачен SEM или обработки изображений программное обеспечение может использоваться для объединения нескольких полей зрения в один непрерывный образ30. Примерно 100 клеток могут быть использованы для оценки доли клеток происходят necroptosis таким образом, создавая разрешением монтаж в программное обеспечение по выбору (см. Таблицу материалы).
    Примечание: Озвучивание некротические морфологии, SEM сравнивает нормальной клеточной функции с прогрессированием предварительно некротические или некротических фенотипов. Эти функции включают изменения плазматической мембраны, включая исчезновение микроворсинки, уплощение, разрывов в клетках, начиная от 10 Нм до 1 мкм в размер, или потере структуры органеллы через по крайней мере 30 – 40% от площади цитозольной ячейки.

5. липидов связывание MLKL методом спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР)

  1. Подготовка 15N-меченых НЛС1-156 стандартных белков и очищение как описано24.
  2. Растворите в 500 мкг 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol Аммониевая соль (18:0 PI) и 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol) соли аммония (18:1 PI) в 500 мкл ледяной КХКЛ3 каждый для окончательного концентрации 1 мг/мл.
  3. Sonicate 1 мг/мл 18:0 и 18:1 PI в водяной бане sonication за 1 мин при комнатной температуре или до 5 мин в ледяной воде смеси.
  4. 18:0 аликвота 1 мг/мл и 18:1 PI в чистые стекла флаконы для титрования серии отдельных ЯМР (рис. 4). Липиды передачи в органических растворителях с использованием стекла герметично шприцы.
    1. Аликвота 132 мкл 1 мг/мл 18:1 PI (молярная масса = 880.137 г/моль) в КХКЛ3 для окончательного ресуспендирования объемом 1200 мкл на 125 мкм концентрации.
      Примечание: Для трубок 5 мм ЯМР, подготовить серийный разрежения объемы > 1000 мкл и окончательный ЯМР образец объемы > 500 мкл. Для трубы 3 мм ЯМР, подготовить серийный разрежения тома > 300 мкл и окончательный ЯМР образец тома > 150 мкл.
  5. Аликвота 1 мг/мл свиного мозга соли аммония L-α-фосфатидилинозитол-4,5-Бисфосфат в 20:9:1 КХКЛ3/метанола/H2O (мозга PI (4,5) P2) в чистые стекла флаконы.
  6. Место флаконы под поток Газообразный аргон (Ar) или азота (N2) с умеренного потока для испарения органических растворителей без брызг против стеклянный флакон стены. Пяти до тридцати минут обычно достаточно для томов 10 – 200 мкл концентрированного органического растворителя.
  7. Организовать vial(s) стекла в нижней части Бюхнера или термос с помощью большого пинцета, печать с резиновой пробкой и придают пластиковые трубы, подключенный к вакуумной линии. Эвакуировать колбу под мягкий вакууме на ночь, чтобы удалить остаточные органические.
  8. Наложение аликвоты липидной пленки с инертным газом, печать с герметичной крышкой и хранить при температуре-20 ° C для использования в течение одного месяца или -80 ° C для долгосрочного хранения.
  9. Подготовить ЯМР пример буферов без моющих средств (-Det) содержащий 20мм NaxHyPO4 рН 6,8, 10% D2O и с моющим средством (+ Det), содержащий 20мм NaxHyPO4 рН 6,8, 10% D2O, 0,34 мм н додецил β-D-maltopyranoside (DDM).
  10. Добавить + Det буфер стеклянный флакон с липидной пленки для достижения желаемой концентрации и sonicate в водяной бане до 30 мин, чередуя sonication за 10 мин, затем путем визуального осмотра.
    Примечание: Sonication может согреть образца. Дайте прибору остыть до комнатной температуры за 15 мин до окончательного белка пример растворения.
  11. Выполните последовательный разрежения мицеллы липидов-моющее средство в + Det буфера с использованием sonication смесей, 1:1 для нужной концентрации серии. Начиная с 125 мкм концентрации липидов, трех повторений даст 62,5 мкм, мкм 31.3 и 15.6 мкм липидов в 0,34 мм DDM.
  12. Подготовить управления и ссылки на примеры ЯМР белков и добавок в - Det и + Det буферов, соответственно. Добавьте белка и добавки для каждого разведения липидов в + Det буфера.
    Примечание: Для 15N НББ156, белок добавляется конечная концентрация 40 мкм и дополнены Дитиотреитол 2 мм Транс сохранить остатки Cys сокращены.
  13. Передать соответствующий объем выборок 5 мм или 3 мм пробирки для NMR (см. Примечание в шаге 5.4).
  14. Вручную загрузить образцы в ЯМР инструмент или организовать в платформу автоматизации как загрузчик SampleCase.
  15. Приобрести составные NMR спектров с использованием стандартных пульс программ для 1H Протон спектры как контроль качества, либо в виде поперечной релаксации оптимизированный спектроскопии (TROSY) следуют 2D 1H -15N корреляции спектры или гетероядерных несколько квантовой согласованности (SOFAST-HMQC)33.
    Примечание: Использование трубы 3 мм ЯМР требует 64 сканирование для 1 H -15N TROSY (~ 3 h) или 1H -15N SOFAST-HMQC (~ 90 мин.). Проверка числа уменьшаются вдвое для трубок 5 мм ЯМР.
  16. Обработанные 2D NMR спектрами могут быть добавлены к Кара репозитория34 для анализа или другого программного обеспечения по выбору пользователя.
  17. Анализ программного обеспечения путем пометки 2D ЯМР резонансы на три хорошо дисперсных и решены вершины для каждого государства, белка. Запись для каждого из шести вершины для каждого условия буфер, содержащий НББ156 (рис. 5A) пик амплитуд.
    1. Используйте Кара подготовить список партии интеграции (нажмите Главное меню заголовок «спектр | ««Настройка пакетный список»...) всех спектров собраны и анализировать с помощью файла назначения один пик (нажмите Главное меню заголовок «пики | Импорт Peaklist».. .and выбрать определяемые пользователем .peaks файл с 6 всего пиков, 3 для каждого белка государства, определенные в).
    2. Настройки параметров («интегратор | ««Настройте пик модель»...) X-ширины 0,06 ppm и Y-ширина 0,30 ppm (главное меню, нажмите заголовок «интегратор | ««Настройте пик модель»...) перед записью конечный результат в два меню выбора (1. Щелкните заголовок главного меню «интегратор | Интегрировать пакетный список») (2. Щелкните заголовок главного меню «Peaks | Экспорт таблицы интеграции») (рис. 5B).
      Примечание: Костяк Амида резонансов для остатков M21, V53 и L105 были назначены для государства закрыты скобки156 НББ. Состояние открытых Брейс был назначен позвоночника Амида резонансы остатков G130 и А141 и Эпсилон Протон боковой цепи резонанс W133 с использованием 3D ЯМР эксперименты24.
  18. Нормализовать образцы для прямого сравнения из разных магнитов или примера условий путем усреднения три открытых Брейс амплитуд эталонных образцов и расчета коэффициента нормализации, касающиеся две ссылки. Вычислите масштабированных амплитуд НББ156 частотный диапазон с помощью нормализации фактор и установка негативные амплитуд до нуля (Таблица 2).
    Примеры: 1) сравнение образцов из разных магнитов: Магнит A, NBB156+ DDM и магнит B, NBB156+ DDM. 2) моющим средством сравнения: 0,34 мм DDM и 1,7 мм DDM.
  19. Рассчитать для каждого резонанс масштабированных дроби из закрытой - или открыть Брейс, разделив с диапазоном от минимальной до максимальной амплитуды всех спектров собранные содержащие соответствующие ссылки бесплатно НББ156 и полностью открыть скобка НББ156 в моющее средство.
  20. Участок нормализованных амплитуд ЯМР в зависимости от концентрации липидов и сравнить долю открыть скобка НББ156 в различных условиях (рис. 5 C).
    Примечание: Кроме того, анализ часть закрыть скобку конформации против концентрации липидов могут выполняться для сравнения Связывание липидов НББ156. Мы предпочитаем бывший анализ, потому что это быстрее и лучше доклады о фракции полностью нанятые липиды.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Визуализация исполнения регулируется necroptosis в живых клетках стало возможным благодаря индуцибельной выражение минимальный усеченная MLKL конструкции, NBB140-2xFV-Венера. Эта конструкция обеспечивает возможность побудить плазматической мембраны permeabilization и активируется через Dim индуцированной олигомеризации FKBP кассеты (2xFV). Мы наблюдать и количественно necroptosis, клеток микроскопии изображений, мониторинг кинетически (каждые 5 мин) поглощение красителя привязк...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы предоставляем протоколы для методов, которые мы объединили причастны MLKL как предполагаемый палач плазматической мембраны разрыв24. В дополнение к расшифровке регулирования сети, которая регулирует MLKL-опосредованной necroptosis, эти методы может использоваться самостоятельно для характеристики других подходящих биологических систем. Практически говоря, эти методы являются средне низкой пропускной обнаружения инструментов.

Мы регулярно использовали клеток изображен...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Клонирование и генерация клеточных линий
pRetroX-TRE3GClontech631188
Tet-On трансактиватор плазмидыLlambi et al., 2016
Мышиные эмбриональные фибробласты (MEFs) mlkl-/-Dillon et al., 2014
Бластицидина S гидрохлоридThermo Fisher ScientificBP2647100 CAS#3513-03-9
Quantification of cell death and live-cell microscopy
DoxycyclineClontech631311 CAS# 24390-14-5
B/B Гомодимеризатор AP20187Takara635059 CAS# 195514-80-8
SYTOX GreenThermo Fisher ScientificS7020
Syto16Thermo Fisher ScientificS7578
NMR
15 N Хлорид аммонияКембриджские изотопные лабораторииNLM-467-10 CAS# 12125-02-9
Дейтерированный DTTКембриджские изотопные лабораторииDLM-2622-1
Оксид дейтерияSigma Aldrich617385-1 CAS# 7789-20-0
n-додецил-&бета;-D-мальтопиранозидAnatrace D310 CAS# 69227-93-6
L-α-фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфат (мозг, свинья) (соль аммония)Avanti Polar Lipids840046X CAS# 383907-42-4
1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоинозитол (соль аммония) (18:0 PI)Avanti Polar Lipids850143 CAS# 849412-67-5
1,2-диолеол-sn-глицеро-3-фосфо-(1'-мио-инозитол) (соль аммония) (18:1)Avanti Polar Lipids850149 CAS# 799268-53-4
Specialized Equipment
IncuCyte FLR или ZOOMEssen BioScience, Inc.Микроскопия живых клеток
Helios NanoLab 660 DualBeam;электронный микроскопThermo Fisher
Software
IncuCyte 2011A Rev2 v20111.3.4288 (FLR)Essen BioScience, Inc.http://www.essenbioscience.comАнализ изображений
FEI MAPSThermo Fisher Scientifichttps://www.fei.com/software/maps/ЭМ анализ,
TopSpin v3.2Bruker BioSpinhttp://www.bruker.comсбор данных ЯМР
CARA v1.9.1.7http://cara.nmr.ch/ Анализ данных ЯМР
Slidebook3i (Инновации в области интеллектуальной визуализации)https://www.intelligent-imaging.com/slidebookКонфокальная микроскопия
Научный , ,

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Weinlich, R., Oberst, A., Beere, H. M., Green, D. R. Necroptosis in development, inflammation and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (2), 127-136 (2017).
  2. Kaiser, W. J., et al. RIP3 mediates the embryonic lethality of caspase-8-deficient mice. Nature. 471 (7338), 368-372 (2011).
  3. Murphy, J. M., et al. The pseudokinase MLKL mediates necroptosis via a molecular switch mechanism. Immunity. 39 (3), 443-453 (2013).
  4. Oberst, A., et al. Catalytic activity of the caspase-8-FLIP(L) complex inhibits RIPK3-dependent necrosis. Nature. 471 (7338), 363-367 (2011).
  5. Zhang, H., et al. Functional complementation between FADD and RIP1 in embryos and lymphocytes. Nature. 471 (7338), 373-376 (2011).
  6. He, S., et al. Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha. Cell. 137 (6), 1100-1111 (2009).
  7. Dondelinger, Y., Hulpiau, P., Saeys, Y., Bertrand, M. J. M., Vandenabeele, P. An evolutionary perspective on the necroptotic pathway. Trends in Cell Biology. 26 (10), 721-732 (2016).
  8. Newton, K., Manning, G. Necroptosis and Inflammation. Annual Review of Biochemistry. 85, 743-763 (2016).
  9. Kaiser, W. J., Upton, J. W., Mocarski, E. S. Viral modulation of programmed necrosis. Current Opinion in Virology. 3 (3), 296-306 (2013).
  10. Newton, K., et al. RIPK3 deficiency or catalytically inactive RIPK1 provides greater benefit than MLKL deficiency in mouse models of inflammation and tissue injury. Cell Death & Differentiation. 23 (9), 1565-1576 (2016).
  11. Kearney, C. J., Martin, S. J. An Inflammatory Perspective on Necroptosis. Molecular Cell. 65 (6), 965-973 (2017).
  12. Pasparakis, M., Vandenabeele, P. Necroptosis and its role in inflammation. Nature. 517 (7534), 311-320 (2015).
  13. Sun, L., Wang, X. A new kind of cell suicide: mechanisms and functions of programmed necrosis. Trends in Biochemical Sciences. 39 (12), 587-593 (2014).
  14. Grootjans, S., Vanden Berghe, T., Vandenabeele, P. Initiation and execution mechanisms of necroptosis: an overview. Cell Death & Differentiation. 24 (7), 1184-1195 (2017).
  15. Sun, L., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase. Cell. 148 (1-2), 213-227 (2012).
  16. Wang, H., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein MLKL causes necrotic membrane disruption upon phosphorylation by RIP3. Molecular Cell. 54 (1), 133-146 (2014).
  17. Cai, Z., et al. Plasma membrane translocation of trimerized MLKL protein is required for TNF-induced necroptosis. Nature Cell Biology. 16 (1), 55-65 (2014).
  18. Chen, X., et al. Translocation of mixed lineage kinase domain-like protein to plasma membrane leads to necrotic cell death. Cell Research. 24 (1), 105-121 (2014).
  19. Dillon, C. P., et al. RIPK1 blocks early postnatal lethality mediated by caspase-8 and RIPK3. Cell. 157 (5), 1189-1202 (2014).
  20. Rickard, J. A., et al. RIPK1 regulates RIPK3-MLKL-driven systemic inflammation and emergency hematopoiesis. Cell. 157 (5), 1175-1188 (2014).
  21. Kaiser, W. J., et al. Toll-like receptor 3-mediated necrosis via TRIF, RIP3, and MLKL. Journal of Biological Chemistry. 288 (43), 31268-31279 (2013).
  22. Upton, J. W., Kaiser, W. J. DAI Another Way: Necroptotic Control of Viral Infection. Cell Host & Microbe. 21 (3), 290-293 (2017).
  23. Tanzer, M. C., et al. Necroptosis signalling is tuned by phosphorylation of MLKL residues outside the pseudokinase domain activation loop. Biochemical Journal. 471 (2), 255-265 (2015).
  24. Quarato, G., et al. Sequential Engagement of Distinct MLKL Phosphatidylinositol-Binding Sites Executes Necroptosis. Molecular Cell. 61 (4), 589-601 (2016).
  25. Davies, K. A., et al. The brace helices of MLKL mediate interdomain communication and oligomerisation to regulate cell death by necroptosis. Cell Death & Differentiation. , (2018).
  26. Su, L., et al. A plug release mechanism for membrane permeation by MLKL. Structure. 22 (10), 1489-1500 (2014).
  27. Dondelinger, Y., et al. MLKL compromises plasma membrane integrity by binding to phosphatidylinositol phosphates. Cell Reports. 7 (4), 971-981 (2014).
  28. Llambi, F., et al. BOK Is a Non-canonical BCL-2 Family Effector of Apoptosis Regulated by ER-Associated Degradation. Cell. 165 (2), 421-433 (2016).
  29. Malkani, N., Schmid, J. A. Some secrets of fluorescent proteins: distinct bleaching in various mounting fluids and photoactivation of cyan fluorescent proteins at YFP-excitation. PLoS One. 6 (4), 18586(2011).
  30. Perez, A. J., et al. A workflow for the automatic segmentation of organelles in electron microscopy image stacks. Frontiers in Neuroanatomy. 8, 126(2014).
  31. Walton, J. Lead aspartate, an en bloc contrast stain particularly useful for ultrastructural enzymology. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 27 (10), 1337-1342 (1979).
  32. Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biology. 2 (11), 329(2004).
  33. Rossi, P., Xia, Y., Khanra, N., Veglia, G., Kalodimos, C. G. 15N and 13C- SOFAST-HMQC editing enhances 3D-NOESY sensitivity in highly deuterated, selectively [1H,13C]-labeled proteins. Journal of Biomolecular NMR. 66 (4), 259-271 (2016).
  34. Keller, R. The computer aided resonance assignment tutorial. Cantina Verlag. , (2004).
  35. Chen, W., et al. Diverse sequence determinants control human and mouse receptor interacting protein 3 (RIP3) and mixed lineage kinase domain-like (MLKL) interaction in necroptotic signaling. Journal of Biological Chemistry. 288 (23), 16247-16261 (2013).
  36. Tanzer, M. C., et al. Evolutionary divergence of the necroptosis effector MLKL. Cell Death & Differentiation. 23 (7), 1185-1197 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

MLKL NecroptosisLive cell ImagingNuclear Magnetic ResonanceLipid Binding AnalysisConfocal MicroscopyElectron MicroscopyNecroptosis InductionMLKL TranslocationPhosphatidyl inositol Phosphates

Похожие статьи