Method Article

Изоляция, характеристика и микроРНК основе генетической модификации человека Стоматологическая фолликула стволовых клеток

DOI:

10.3791/58089

⸱

November 16th, 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), Department of Cardiac Surgery, Rostock University Medical Center, 2Department Life, Light and Matter of the Interdisciplinary Faculty at Rostock University, 3Department of Operative Dentistry and Periodontology, Rostock University Medical Center

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает переходных генной инженерии Стоматологическая стволовых клеток, извлеченные из человеческих зубов фолликула. Прикладной-вирусных модификации стратегия может стать основой для улучшения продуктов терапевтического стволовых клеток.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

На сегодняшний день, несколько типов стволовых клеток на разных этапах своего развития находятся в центре внимания для лечения дегенеративных заболеваний. Тем не менее некоторые аспекты, такие как первоначальный массивные клеточной смерти и низкий терапевтический эффект, нарушение их широкого клинического перевод. Генной инженерии стволовых клеток до трансплантации возникла как перспективный метод для оптимизации эффекты терапевтического стволовых клеток. Однако по-прежнему отсутствуют гена безопасных и эффективных систем доставки. Таким образом разработка подходящих методов могут обеспечить подход к решению текущих проблем в терапии на основе стволовых клеток.

Настоящий Протокол описывает добычи и характеристика человека Стоматологическая фолликула стволовых клеток (hDFSCs) а также их не вирусная генетическая модификация. Послеродовой Стоматологическая фолликула обнародовал как источник перспективных и легко доступны для уборки Multipotent с экстрактами стволовых клеток обладающих высоким распространением потенциал. Процедуре описано изоляции представляет простой и надежный способ для сбора hDFSCs от Ретинированные зубы мудрости. Также этот протокол включает методы для определения характеристик стволовых клеток изолированных клеток. Для генной инженерии hDFSCs оптимизированный Катионный липидных трансфекции стратегия представлен стимулирующей внедрение высокоэффективных микроРНК не вызывая цитотоксических эффектов. МикроРНК, подходящих кандидатов для манипуляции переходных клеток, эти небольшие поступательные регуляторов управления судьбу и поведением стволовых клеток без опасности стабильной генома интеграции. Таким образом этот протокол является безопасной и эффективной процедуры для техники hDFSCs, которые могут оказаться важными для оптимизации их терапевтической эффективности.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Человеческих зубов фолликула это рыхлой соединительной ткани, ectomesenchymally производные, окружающих развивающихся зуба1,2. Помимо своей функции по координации osteoclastogenesis и Остеогенез для процесса извержения зуба эта ткань затаивает стволовых и прогениторных клеток, особенно для развития периодонт3,4,5. Таким образом Стоматологическая фолликула рассматривается как альтернативного источника для сбора стволовых клеток человека взрослых6,7.

Несколько исследований показали, что человека Стоматологическая фолликула стволовых клеток (hDFSCs) способны дифференцироваться в линии пародонта, включая остеобластов, связки фибробластов и cementoblasts8,9,10 . Кроме того, эти клетки были показаны для соответствия всех характеристик мезенхимальных стромальных клеток (МСК) включая самостоятельного обновления потенциала, пластиковые присоединения, выражения конкретных поверхностных маркеров (например, CD73, CD90, CD105) также как остеогенные, адипогенном и хондрогенном дифференциация потенциальных11,12,13. Другие исследования также показали нейронных дифференциация потенциал hDFSCs2,14,,1516,17,18.

Благодаря их перспективных свойств и легкий доступ hDFSCs стала недавно соответствующие ткани инженерных19,,2021. Первые исследования сосредоточены на потенциал DFSCs для регенерации костей, пародонта и зуб корни,19,,2223,24,25,26 27,28,29,30. Знание нейрогенный возможности hDFSCs их применение в качестве потенциальных лечение нейродегенеративных заболеваний после исследованы31,,3233. HDFSCs также приобрели важное значение в связи с регенерации других тканей (например, эпителий роговицы)34,35. Терапевтический потенциал hDFSC основан не только на их потенциал прямых дифференциации, но и на их ответные действия. Недавно было показано hDFSCs выделяют множество биологически активных факторов, таких как матрицы металлопротеиназ (MMPs), инсулин подобный фактор роста (IGF), Сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), основные фибробластический фактор роста (bFGF) и роста гепатоцитов фактор (HGF), которые играют решающую роль по ангиогенез, иммуномодуляция, Ремоделирование дополнительных клеточных матриц и репаративные процессы36.

Однако широкого клинического перевод стволовых клеток до сих пор препятствует ряд проблем, таких, как массовые первоначальная клеточная смерть и низкой выгодно стволовых клеток эффекты37,38. Генной инженерии обеспечивает перспективные стратегии для решения этих проблем и поэтому могут значительно повысить терапевтическую эффективность стволовых клеток38,,3940. Для манипуляции переходных клеток микроРНК (Мирс) являются подходящими кандидатами, как эти небольшие поступательные регуляторов управления судьбу и поведением стволовых клеток без опасности стабильным геномом интеграции41,42, 43. до настоящего времени, были определены несколько полезных Мирс, поощрение распространения стволовых клеток, выживание, головка самонаведения, паракринными деятельность, а также их дифференцировку в несколько линий44. К примеру мир 133а инженерии MSCs, показало увеличение выживаемости и приживления в сердцах infarcted крысы, что приводит к улучшению функции сердца, по сравнению с неизмененной MSCs45. Кроме того мир 146А избытком MSCs были продемонстрированы секретировать VEGF, который в свою очередь привело к расширенной терапевтическую эффективность при ишемии ткани46большее количество.

Эта рукопись представляет подробный протокол для селективного извлечения и генной инженерии hDFSCs. Для этой цели мы описали, сбора урожая и ферментативные пищеварения человека Стоматологическая фолликулов, а также последующие изоляции hDFSCs. Для того чтобы характеризовать изолированных клеток, были включены в соответствии с руководящими принципами международного общества для клеточной терапии13важные инструкции для проверки свойств MSC. Кроме того мы предоставляем подробное описание для поколения мир модифицированных hDFSCs, применяя стратегию Катионный липидных transfection и оценки эффективности transfection и цитотоксичность.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HDFSCs изолированы от стоматологических фолликулов предоставляемые Департаментом оральных и челюстно-лицевой пластической хирургии медицинского центра Университета Ростока зубов мудрости. Осознанного согласия и письменное согласие было получено от всех больных. Это исследование было санкционировано местными Этический Комитет университета г. Росток (разрешение № A 2017-0158).

1. изоляция hDFSCs

Примечание: Для предотвращения бактериального загрязнения, зубы мудрости не быть вспыхнули до извлечения

  1. Подготовка необходимых решений
    1. Подготовить фосфат амортизированное saline (PBS) / пенициллин-стрептомицином-глютамин (P-S-G) решение: смешать 495 мл PBS с 5 мл раствора P-S-G. Хранить аликвоты 50 мл при 4 ° C.
    2. Подготовка hDFSC питательной среды: микс 445 мл базальной среды с 5 мл антибиотик агента и 50 мл плода бычьим сывороточным (ФБС). Хранить при 4 ° C.
    3. Подготовить коллагеназы типа я складе раствор (30 мг/мл): разбавлять 300 мг коллагеназы типа я в 10 мл базальной среды дополняется 1% антибиотиков агента. Энергично mix решение. Фильтр решения с помощью фильтра 0,2 мкм. Магазин аликвоты 500 мкл коллагеназы типа я Стоковый раствор при температуре-20 ° C.
    4. Подготовить раствор Dispase II (40 мг/мл): разбавлять 40 мг в 10 мл базальной среды с 1% антибиотиков агент по Dispase II. Энергично mix решение. Фильтр решения с помощью фильтра 0,2 мкм. Хранить аликвоты 500 мкл Dispase II Стоковый раствор при температуре-20 ° C.
  2. Хирургическая процедура
    1. Придать достаточное количество (максимум: 2 мл) из местного анестетика.
    2. Создание и приподнять клапан 3 сторонняя mucoperiosteal. Повышение лингвальные заслонки не требуется.
    3. Защищайте языковой аспект с периостальная Лифт.
    4. Аккуратно стана Щечной и дистальных костей с круглой жесткий металлический заусенцев.
    5. Ослабьте ткань фолликула с периостальная Лифт. Осторожно удалите полный зуба (зародыш) и фолликул, потянув из короны (и фолликула) с задней (третьего моляра) щипцами.
    6. Предотвращать и орошать сокета тщательно раствором NaCl.
    7. Замените клапан mucoperiosteal Викрил швов (см. Таблицу материалы).
    8. Удаление зуба фолликул из ротовой полости и поместите их в Алиготе 50 мл раствора PBS/P-S-G.
      Примечание: Образец может храниться при температуре 4 ° C до дальнейшей обработки.
  3. Ферментативный пищеварения фолликула зуба
    1. Предварительно теплой hDFSC питательной среды и PBS/P-S-G решения до комнатной температуры (RT).
    2. Оттепель один Алиготе каждого коллагеназы типа I и Dispase II акций решения. Приготовляют раствор пищеварение 3 мг/мл коллагеназы типа I и 4 мг/мл Dispase II, добавив 500 мкл каждого коллагеназы типа I и Dispase II раствор до 4 мл базальной средних содержащий 1% антибиотиков агента.
    3. Место извлечения фолликула в стерильных Петри и добавить 10 мл раствора PBS/P-S-G мыть извлеченные ткани. Повторите этот шаг Стиральная дважды.
    4. Фарш извлеченные фолликула на кусочки около 1 мм x 1 мм с стерильным скальпель в пределах Петри, содержащие 10 мл раствора PBS/P-S-G.
    5. Передача фарш из ткани и PBS/P-S-G решение от Петри в 50 мл конические пластиковых пробирок. Вымойте Петри с 10 мл раствора PBS/P-S-G и передача решения в том же трубку.
    6. Центрифуга конические пластиковых пробирок для 10 мин на 353 x g в RT и удалить супернатант.
    7. Добавьте 5 мл раствора пищеварение гранулированных ткани. Аккуратно перемешать решения и ткани. Инкубируйте смеси при 37 ° C и 5% CO2 на 2 ч в тряску инкубатора.
    8. Центрифуга переваривается ткани клеток подвеска на 353 x g 10 мин на RT. удалить супернатант и вновь приостановить полученные гранулы в 6 мл hDFSC питательной среды.
    9. Суспензию клеток семян в 25 см2 клетки культуры колбу и инкубации клеток при 37 ° C, 5% CO2 и 20% O2.
      Примечание: Если ткань не усваивается полностью, передать колбу культуры клетки также оставшиеся ткани.
    10. Изменения среднего тщательно 24 ч после заполнения ячейки. После изменения среднего каждые три дня до confluency.
      Примечание: HDFSCs должно быть пластик сторонник 24 ч после посева клеток и может быть отделена от non сторонник клетки и компонентов крови, просто изменив носитель.
  4. Клетки для сбора урожая
    1. Предварительно теплой hDFSC питательной среды, PBS/P-S-G решения и трипсина/Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) решение RT.
    2. Отменить супернатант от культуры колбу и мыть вырожденная клетки с 5 мл раствора PBS/P-S-G.
    3. Добавить 1 мл раствора трипсина/ЭДТА в колбу культуры и Инкубируйте 3 мин при 37 ° C. Остановите процесс пищеварения, добавления культуры флакон 3 мл hDFSC питательной среды.
    4. Передача суспензию клеток в 15 мл конические центрифуги и центрифуги подвеска для 10 мин на 353 x g на RT. удалить супернатант и вновь приостановить гранулы в соответствующее количество hDFSC питательной среды.
    5. Подсчитать ячейки: осторожно смешать 10 мкл суспензии клеток с 10 мкл раствора Трипановый синий. Применить 10 мкл в Счетной палате и подсчитать количество ячеек hDFSC.

2. характеристика hDFSCs

  1. Иммунофенотипирование
    1. Подготовка для анализа потока гранулярных клеток
      1. Подготовка необходимых решений
        1. Подготовить PBS/ЭДТА (2 мм): смешать 996 мл PBS с 4 мл ЭДТА (0,5 М).
        2. Подготовить окрашивание буфера: смешать 995 мл PBS/ЭДТА (2 мм) с 5 г BSA. Фильтр решения с помощью блок фильтра 0.22 мкм и хранить при 4 ° C до использования.
        3. Подготовить раствор параформальдегида (PFA) (4%): разбавляют 4 g ПФА в 100 мл PBS и тепла решение до 80 ° C. Mix решение и отрегулируйте значение рН 7.3. Алиготе получил решение ПФА в соответствующих сумм (1,5 мл) и хранить при температуре от-20 ° C до использования.
          Предупреждение: Потому что ПФА газы являются токсичными, подготовьте решение ПФА в вентилируемых зонта.
      2. После уборки урожая (1.4) ячейки передача 14 образцов 5 х 104 клеток в 1,5 мл пробирок microcentrifuge. Центрифуга для подвески на 300 x g 10 мин при 4 ° C. Выбросите супернатант.
        Примечание: Выполните следующие работы в комнате довольно тени. Держите клетки и реагенты на льду, если не указано иное.
      3. Вновь приостановить клетки в определённых количествах окрашивание буфера (4 ° C) и добавить FcR блокирование реагента (4 ° C), как указано в таблице 1.
      4. Добавьте следующие антител на внутренней стороне соответствующих образцов, как указано в таблице 1: аллофикоцианин (APC) мыши против человека CD29; APC мыши элемент управления изотипа IgG1 κ; Peridinin хлорофилл белка (PerCP)-Cyanine5.5 мышь борьбе человека CD44; PerCP-Cyanine5.5 мышь IgG2b κ изотипа управления; V500 мыши античеловеческие CD45; V500 мыши элемент управления изотипа IgG1 κ; Фикоэритрин (PE) мыши античеловеческие CD73; PE мыши элемент управления изотипа IgG1 κ; PerCP-Cyanine5.5 мышь борьбе человека CD90; PerCP-Cyanine5.5 мышь элемента управления изотипа IgG1 κ; мышь антинародным CD105: Alexa Fluor (AF) 488; отрицательный контроль IgG1 мыши: AF488; PE-Cyanine7 мышь борьбе человека CD117; PE-Cyanine7 мышь IgG1, κ изотипа управления. После того, как антитела были добавлены для каждого образца, спина вниз антител и осторожно перемешать. Инкубировать решения для 10 мин при 4 ° C.
      5. Добавьте 1 mL PBS (4 ° C) и Центрифугуйте образцы на 300 g x 10 мин при 4 ° C. Выбросите супернатант.
      6. Вновь приостановить клетки в 100 мкл PBS (4 ° C) и 33 мкл PFA (4%). Смешать решения и хранить на льду или на 4 ° C до гранулярных анализ потока.
    2. Измерение расхода гранулярных клеток
      Примечание: Выполните следующие работы в комнате довольно тени. Держите клетки на льду до измерения.
      1. Для изучения экспрессии поверхностных антигенов, передачи образцов в трубы, пригодные для измерения расхода гранулярных.
      2. Мера по крайней мере 2 х 104 события с помощью проточный цитометр. Проанализируйте, как показано на рисунке 2.
  2. Потенциал Multipotent с дифференциации hDFSCs
    1. Используйте коммерчески доступных человека мезенхимальных стволовых клеток функциональную идентификации комплект для подтверждения адипогенном, остеогенные и хондрогенном дифференциация потенциал hDFSCs. Применить осла анти козье AF488 вторичное антитело для окрашивания белок, связывающий жирные кислоты 4 (FABP4) и Аггрекан а также осел анти мыши AF488 вторичное антитело для окрашивания остеокальцина. Для окрашивания ядер, используйте монтажа средних с 4', 6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI).
      Примечание: Подготовка образцов без первичного антитела как негативный контроль для микроскопического анализа.
    2. Проанализировать экспрессию белков лазерная сканирующая конфокальная микроскопия. Микроскопия параметры: 40 x цель с погружения нефти; возбуждения лазерный 488 нм (для AF488) и 405 нм (для DAPI).

3. transfection hDFSCs

  1. После сбора урожая (1.4) ячейки семена hDFSCs на плите культуры клеток 24-Ну за 24 часа до transfection.
    Примечание: Начиная плотность клеток является примерно 4 х 104 клетки на хорошо. Клетки должны достичь слияния ~ 80% на день transfection.
    Примечание: Семя один образец дополнительные ячейки как элемент управления для анализа гранулярных потока.
  2. Подготовка трансфекции комплексов
    Примечание: Для предотвращения загрязнения от полиадениновый, очистите область непосредственно перед приготовлением трансфекции комплексов с помощью РНКазы обеззараживания решения. Используйте только РНКазы бесплатные материалы и решения.
    Примечание: Выполните следующие работы в комнате довольно тени.
    1. Подготовить раствор (50 мкм) мир: вновь приостановить Cy3-помечены прекурсоров мир (5 нмоль) в 100 мкл нуклеиназы свободной воды. Алиготе получил мир Стоковый раствор в соответствующих количествах (5 мкл) и хранить в темноте при температуре-20 ° C до использования.
    2. Разбавьте 40 пмоль мир (0,8 мкл раствора Фондовый мир 50 мкм) в 66,7 мкл сокращение сыворотке среды. Осторожно перемешать раствор
    3. Разбавьте 0,67 мкл Реагента Катионный липидных трансфекции в 66,7 мкл сокращение сыворотке среды. Mix решение осторожно и инкубировать в течение 5 мин на RT.
    4. После инкубации добавьте предварительно разбавленного трансфекции реагент предварительно разбавленного мир. Mix решение осторожно и Инкубируйте 15 мин на RT.
  3. Добавьте подготовленные трансфекции комплексы каплям непосредственно питательной среды на клетки. Смешайте нежно покачиваясь пластину культуры клеток 24-ну взад и вперед.
  4. Инкубируйте клетки при 37 ° C, 5% CO2и 20% O2 за 24 ч.

4. анализ Transfection

Примечание: Выполните следующие работы в комнате довольно тени.

  1. Уборка после transfection клетки
    Примечание: Соберите все ячейки решения одного образца в же 15 мл конические пластиковых пробирок.
    1. 24 ч после трансфекции, собирать супернатант образцов в соответствующих пробирок.
    2. Вымыть клетки с 1 мл раствора PBS, передача PBS в соответствующих пластиковых пробирок и 500 мкл трипсина/ЭДТА (RT) клеток. Инкубировать решения для 3 мин при 37 ° C.
    3. Остановите trypsinization, добавив 1 мл питательной среды (RT) клетки и передачи решения в соответствующих пластиковых пробирок. Центрифуга клетки на 300 x g 10 мин при 4 ° C.
      Примечание: От этого времени держите клетки и реагенты на льду, если не указано иное.
  2. Подготовка для анализа потока гранулярных клеток
    1. Выбросите супернатант. Вновь приостановите клетки в 100 мкл буфера окрашивание (4 ° C) и передачи ячейки решения пробки microcentrifuge 1,5 мл.
    2. Добавьте 0.5 мкл Амин реактивной красителя образцы для того, чтобы различать живые и мертвые клетки. Аккуратно перемешать раствор и проинкубируйте втечение 10 мин при 4 ° C.
    3. Добавьте 1 mL PBS (4 ° C) в клетки и центрифуги на 300 x g 10 мин при 4 ° C. Выбросите супернатант.
    4. Вновь приостановить клетки в 100 мкл PBS (4 ° C) и 33 мкл PFA (4%). Смешать решения и хранить на льду или на 4 ° C до гранулярных анализ потока.
  3. Измерение расхода гранулярных клеток
    Примечание: Выполните следующие работы в комнате довольно тени. Держите клетки на льду до измерения.
    1. Передача образцов в трубы, пригодные для измерения расхода гранулярных.
    2. Изучите жизнеспособность клеток и эффективность поглощения мир с помощью проточный цитометр. Мера4 события по крайней мере 2 x 10. Использование стробирования стратегия, изображенные на рисунке 4.
      Примечание: Используйте untransfected клетки как отрицательный контроль устроить стробирования для позитивных клеток Cy3 и гибели клеток, вызванные transfection вычисления.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем подробную изоляции инструкция урожай hDFSCs из ткани человека Стоматологическая фолликула. Из-за легкий доступ Стоматологическая фолликул во время обычной операции это перспективный источник для извлечения стволовых клеток.

Изолированные hDFSCs показал все характеристики, описанные для определения MSCs13. В самом деле, клетки были пластик сторонник под описаны условия, культуру и ото...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Взрослые стволовые клетки в настоящее время в фокусе для лечения ряда дегенеративных заболеваний. В частности, костного мозга (BM)-стволовые клетки, включая гемопоэтических стволовых клеток (СКК) и MSCs, находятся под интенсивным клиническое исследование47. Однако BM уборки инвазивные процедуры, вызывая боль в месте введения пожертвование и может привести к48неблагоприятные события. Недавно послеродовой зубной ткани стал Роман и легко доступного источника для стволовых клет...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана программа FORUN медицинский центр университета Ростока (889018) и Фондом влажной (2016-11). Кроме того, часов и р.д. поддерживаются BMBF (VIP + 00240).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Антитело к человеческому CD105 у мыши: Alexa Fluor 488Bio-RadMCA1557A488клону SN6, моноклональное
мыши IgG1 отрицательное контрольное антитело: Alexa Fluor 488Bio-RadMCA928A488моноклональное
APC Mouse Anti-Human CD29 антителоBD Biosciences559883клон MAR4, моноклональный
APC Mouse IgG1, κ Контроль изотипа антителаBD Biosciences555751клон MOPC-21, моноклональный
PE мышь против человека CD73 антителоBD Biosciences550257клон AD2, моноклональный
PE мышь IgG1, κ Антитела контроля изотипаBD Biosciences555749клона MOPC-21, моноклонального
мышиного антитела PE-Cy7 против человеческого CD117BD Biosciences339217клона 104D2, моноклонального
мышиного PE-Cy7 IgG1, κ Антитело контроля изотипаBD Biosciences557872клон MOPC-21, моноклональный
PerCP-Cy5.5 мышиный античеловеческий CD44 антителоBD Biosciences560531клон G44-26, моноклональный
PerCP-Cy5.5 мышиный IgG2b, κ Контроль изотипа антителаBD Biosciences558304клон 27-35, моноклональный
PerCP-Cy5.5 мышиный CD90  АнтителоBD Biosciences561557клон 5E10, моноклональный
PerCP-Cy5.5 мышиный IgG1, κ Контроль изотипа АнтителоBD Biosciences55095Клон MOPC-21, моноклональный
V500 Мышиный античеловеческий CD45 АнтителоBD Biosciences560777клон HI30, моноклональный
V500 Мышь IgG1, κ Контроль изотипа антителаBD Biosciences560787клон X40, моноклональный
реагент блокировки FcR, человеческийMiltenyi Biotec130-059-901
UltraPure EDTAThermo Fisher Scientific15575-0200,5M, pH 8,0
SteritopMerck MilliporeSCGPT05RE0,22 &микро; m, радиостерилизованный, полиэфирсульфон
BSASigma-AldrichA7906
PFAMerck Millipore1040051000
набор функциональной идентификации мезенхимальных стволовых клеток человекаR& D SystemsSC006
раствор для обеззараживания РНКазы; РНКазаZap РНКаза Раствор для обеззараживанияThermo Fisher ScientificAM9780
Cy3-меченый предшественник miR; Cy3 меченый красителем Pre-miR Negative Control #1Thermo Fisher ScientificAM171205 нмоль
Pre-miR miRNA Precursor Negative Control #1Thermo Fisher ScientificAM171105 нмоль
катионный реагент на основе липидов; Липофектамин 2000 Реагент для трансфекцииThermo Fisher Scientific11668019
Восстановленная сывороточная среда; Opti-MEM I Восстановленная сывороткаMedium Thermo Fisher Scientific31985070
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Перекрестно-адсорбированное вторичное антитело, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-11055поликлональное
Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) с высокой перекрестной адсорбцией вторичное антитело, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-21202поликлональная
монтажная среда; Флюорощит с DAPISigma-AldrichF6057-20MLгистологический монтажный носитель
ELYRA PS.1 LSM 780 конфокальный микроскопZeiss
BD FACS LSRII проточный цитометрBD Biosciences
BD FACSDiva Software 6.1.2BD Biosciences
ZEN2011 решениеZeiss
Trypsin/EDTA (0,05%/ 0,02%)BiochromL2143в PBS, в/н: Ca2+, Mg2+
аминоспособный краситель; ЖИВОЙ/МЕРТВЫЙ&ТОРГОВЛЯ; Фиксируемый набор для окрашивания мертвых клеток в ближнем инфракрасном диапазонеThermo Fisher ScientificL10119
PBS (1x)Thermo Fisher Scientific10010023pH: 7,4; в/о: Ca и Mg
P-S-G (100x)Thermo Fisher Scientific10378016
базальная среда; Модифицированная смесь питательных веществ Dulbecco's Eagle F-12Thermo Fisher Scientific11039021
антибиотик, ZellShieldBiochromW 13-0050
FBSThermo Fisher Scientific10500064
коллагеназой типа IThermo Fisher Scientific17100017
Dispase IIThermo Fisher Scientific17105041
Фильтр, шприцевой фильтр Sterifix 0.2 & микро; mBraun4099206
50  mL коническая центрифужная пробиркаSarstedt62,547,254
15 мл коническая центрифужная пробиркаSarstedt62,554,502
Колба для клеточных культур 75 см<суп>2Sarstedt833,910,002
Колба для клеточных культур, 25 см<суп>2Sarstedt833,911,002
Замораживающая среда, биофризаBiochromF 2270
КриопробиркиThermo Fisher Scientific3772671,8 мл
раствора трипанового синегоSigma-AldrichT81540,4 %
Счетная камераPaul Marienfeld
Местный анестетик, Ксилоцитин (лидокаина гидрохлорид) 2% с эпинефрином (адреналином) 0,001%Mibe
NaCl растворBraun0.9 %
Викрил сатуры, Викрил рапидEthicon3 - 0
антитело антитело

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Potdar, P. D., Jethmalani, Y. D. Human dental pulp stem cells: Applications in future regenerative medicine. World journal of stem cells. 7 (5), 839-851 (2015).
  2. Lima, R. L., et al. Human dental follicle cells express embryonic, mesenchymal and neural stem cells markers. Archives of oral biology. 73, 121-128 (2017).
  3. Wise, G. E. Cellular and molecular basis of tooth eruption. Orthodontics & craniofacial research. 12 (2), 67-73 (2009).
  4. Baykul, T., Saglam, A. A., Aydin, U., Başak, K. Incidence of cystic changes in radiographically normal impacted lower third molar follicles. Oral surgery, oral medicine, oral pathology, oral radiology, and endodontics. 99 (5), 542-545 (2005).
  5. Wise, G. E., Frazier-Bowers, S., D'Souza, R. N. Cellular, molecular, and genetic determinants of tooth eruption. Critical reviews in oral biology and medicine : an official publication of the American Association of Oral Biologists. 13 (4), 323-334 (2002).
  6. Ten Cate, A. R. The development of the periodontium: A largely ectomesenchymally derived unit. Periodontology 2000. 13 (1), 9-19 (1997).
  7. Park, B. -W., et al. In vitro and in vivo osteogenesis of human mesenchymal stem cells derived from skin, bone marrow and dental follicle tissues. Differentiation; research in biological diversity. 83 (5), 249-259 (2012).
  8. Sowmya, S., et al. Periodontal Specific Differentiation of Dental Follicle Stem Cells into Osteoblast, Fibroblast, and Cementoblast. Tissue engineering. Part C, Methods. 21 (10), 1044-1058 (2015).
  9. Kémoun, P., et al. Human dental follicle cells acquire cementoblast features under stimulation by BMP-2/-7 and enamel matrix derivatives (EMD) in vitro. Cell and tissue research. 329 (2), 283-294 (2007).
  10. Morsczeck, C., et al. Isolation of precursor cells (PCs) from human dental follicle of wisdom teeth. Matrix biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 24 (2), 155-165 (2005).
  11. Hieke, C., et al. Human dental stem cells suppress PMN activity after infection with the periodontopathogens Prevotella intermedia and Tannerella forsythia. Scientific reports. 6, 39096(2016).
  12. Kumar, A., et al. Molecular spectrum of secretome regulates the relative hepatogenic potential of mesenchymal stem cells from bone marrow and dental tissue. Scientific reports. 7 (1), 15015(2017).
  13. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  14. Ullah, I., et al. In vitro comparative analysis of human dental stem cells from a single donor and its neuronal differentiation potential evaluated by electrophysiology. Life sciences. 154, 39-51 (2016).
  15. Völlner, F., Ernst, W., Driemel, O., Morsczeck, C. A two-step strategy for neuronal differentiation in vitro of human dental follicle cells. Differentiation; research in biological diversity. 77 (5), 433-441 (2009).
  16. Morsczeck, C., et al. Comparison of human dental follicle cells (DFCs) and stem cells from human exfoliated deciduous teeth (SHED) after neural differentiation in vitro. Clinical oral investigations. 14 (4), 433-440 (2010).
  17. Kadar, K., et al. Differentiation potential of stem cells from human dental origin - promise for tissue engineering. Journal of physiology and pharmacology: An official journal of the Polish Physiological Society. 60, Suppl 7. 167-175 (2009).
  18. Heng, B. C., et al. Decellularized Matrix Derived from Neural Differentiation of Embryonic Stem Cells Enhances the Neurogenic Potential of Dental Follicle Stem Cells. Journal of endodontics. 43 (3), 409-416 (2017).
  19. Honda, M. J., Imaizumi, M., Tsuchiya, S., Morsczeck, C. Dental follicle stem cells and tissue engineering. Journal of Oral Science. 52 (4), 541-552 (2010).
  20. Liu, J., et al. Concise reviews: Characteristics and potential applications of human dental tissue-derived mesenchymal stem cells. Stem cells. 33 (3), Dayton, Ohio. 627-638 (2015).
  21. Morsczeck, C., Reichert, T. E. Dental stem cells in tooth regeneration and repair in the future. Expert opinion on biological therapy. 18 (2), 187-196 (2018).
  22. Rezai-Rad, M., et al. Evaluation of bone regeneration potential of dental follicle stem cells for treatment of craniofacial defects. Cytotherapy. 17 (11), 1572-1581 (2015).
  23. Handa, K., et al. Progenitor Cells From Dental Follicle Are Able to Form Cementum Matrix In Vivo. Connective Tissue Research. (2-3), 406-408 (2009).
  24. Tsuchiya, S., Ohshima, S., Yamakoshi, Y., Simmer, J. P., Honda, M. J. Osteogenic Differentiation Capacity of Porcine Dental Follicle Progenitor Cells. Connective Tissue Research. 51 (3), 197-207 (2010).
  25. Honda, M. J., et al. Stem cells isolated from human dental follicles have osteogenic potential. Oral surgery, oral medicine, oral pathology, oral radiology, and endodontics. 111 (6), 700-708 (2011).
  26. Guo, W., et al. Dental follicle cells and treated dentin matrix scaffold for tissue engineering the tooth root. Biomaterials. 33 (5), 1291-1302 (2012).
  27. Yang, B., et al. Tooth root regeneration using dental follicle cell sheets in combination with a dentin matrix - based scaffold. Biomaterials. 33 (8), 2449-2461 (2012).
  28. Bai, Y., et al. Cementum- and periodontal ligament-like tissue formation by dental follicle cell sheets co-cultured with Hertwig's epithelial root sheath cells. Bone. 48 (6), 1417-1426 (2011).
  29. Guo, S., et al. Comparative study of human dental follicle cell sheets and periodontal ligament cell sheets for periodontal tissue regeneration. Cell transplantation. 22 (6), 1061-1073 (2013).
  30. Lucaciu, O., et al. Dental follicle stem cells in bone regeneration on titanium implants. BMC biotechnology. 15, 114(2015).
  31. Li, X., et al. A therapeutic strategy for spinal cord defect: Human dental follicle cells combined with aligned PCL/PLGA electrospun material. BioMed research international. , 197183(2015).
  32. Yang, C., Li, X., Sun, L., Guo, W., Tian, W. Potential of human dental stem cells in repairing the complete transection of rat spinal cord. Journal of neural engineering. 14 (2), 26005(2017).
  33. Kanao, S., et al. Capacity of Human Dental Follicle Cells to Differentiate into Neural Cells In Vitro. Stem Cells International. 2017, 8371326(2017).
  34. Sung, I. -Y., et al. Cardiomyogenic Differentiation of Human Dental Follicle-derived Stem Cells by Suberoylanilide Hydroxamic Acid and Their In Vivo Homing Property. International journal of medical sciences. 13 (11), 841-852 (2016).
  35. Botelho, J., Cavacas, M. A., Machado, V., Mendes, J. J. Dental stem cells: Recent progresses in tissue engineering and regenerative medicine. Annals of medicine. 49 (8), 644-651 (2017).
  36. Dou, L., et al. Secretome profiles of immortalized dental follicle cells using iTRAQ-based proteomic analysis. Scientific reports. 7 (1), 7300(2017).
  37. Lee, S., Choi, E., Cha, M. -J., Hwang, K. -C. Cell adhesion and long-term survival of transplanted mesenchymal stem cells: A prerequisite for cell therapy. Oxidative medicine and cellular longevity. 2015, 632902(2015).
  38. Lemcke, H., Voronina, N., Steinhoff, G., David, R. Recent Progress in Stem Cell Modification for Cardiac Regeneration. Stem Cells International. 2018 (2), 1-22 (2018).
  39. Nowakowski, A., Walczak, P., Janowski, M., Lukomska, B. Genetic Engineering of Mesenchymal Stem Cells for Regenerative Medicine. Stem cells and development. 24 (19), 2219-2242 (2015).
  40. Nowakowski, A., Walczak, P., Lukomska, B., Janowski, M. Genetic Engineering of Mesenchymal Stem Cells to Induce Their Migration and Survival. Stem Cells International. 2016, 4956063(2016).
  41. Gulluoglu, S., Tuysuz, E. C., Bayrak, O. F. miRNA Regulation in Dental Stem Cells: From Development to Terminal Differentiation. Dental Stem Cells. Stem Cell Biology and Regenerative Medicine. #350;ahin, F., Doğan, A., Demirci, S. , Springer International Publishing. (2016).
  42. Hammond, S. M. An overview of microRNAs. Advanced drug delivery reviews. 87, 3-14 (2015).
  43. Jakob, P., Landmesser, U. Role of microRNAs in stem/progenitor cells and cardiovascular repair. Cardiovascular research. 93 (4), 614-622 (2012).
  44. Clark, E. A., Kalomoiris, S., Nolta, J. A., Fierro, F. A. Concise Review: MicroRNA Function in Multipotent Mesenchymal Stromal Cells. Stem cells. 32 (5), 1074-1082 (2014).
  45. Dakhlallah, D., et al. MicroRNA-133a engineered mesenchymal stem cells augment cardiac function and cell survival in the infarct heart. Journal of cardiovascular pharmacology. 65 (3), 241-251 (2015).
  46. Seo, H. -H., et al. Exogenous miRNA-146a Enhances the Therapeutic Efficacy of Human Mesenchymal Stem Cells by Increasing Vascular Endothelial Growth Factor Secretion in the Ischemia/Reperfusion-Injured Heart. Journal of vascular research. 54 (2), 100-108 (2017).
  47. Trounson, A., McDonald, C. Stem Cell Therapies in Clinical Trials: Progress and Challenges. Cell stem cell. 17 (1), 11-22 (2015).
  48. Siddiq, S., et al. Bone marrow harvest versus peripheral stem cell collection for haemopoietic stem cell donation in healthy donors. The Cochrane database of systematic reviews. (1), CD006406(2009).
  49. Karamzadeh, R., Eslaminejad, M. B. Dental-Related Stem Cells and Their Potential in Regenerative Medicine. Regenerative Medicine and Tissue Engineering. Andrades, J. A. , InTech. (2013).
  50. Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (25), 13625-13630 (2000).
  51. Honda, M. J., et al. Side population cells expressing ABCG2 in human adult dental pulp tissue. International endodontic journal. 40 (12), 949-958 (2007).
  52. Seo, B. -M., et al. Investigation of multipotent postnatal stem cells from human periodontal ligament. The Lancet. 364 (9429), 149-155 (2004).
  53. Miura, M., et al. SHED: stem cells from human exfoliated deciduous teeth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (10), 5807-5812 (2003).
  54. Sonoyama, W., et al. Characterization of the apical papilla and its residing stem cells from human immature permanent teeth: a pilot study. Journal of endodontics. 34 (2), 166-171 (2008).
  55. Nollet, E., Hoymans, V. Y., van Craenenbroeck, A. H., Vrints, C. J., van Craenenbroeck, E. M. Improving stem cell therapy in cardiovascular diseases: the potential role of microRNA. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 311 (1), H207-H218 (2016).
  56. Müller, P., et al. Magnet-Bead Based MicroRNA Delivery System to Modify CD133+ Stem Cells. Stem cells international. 2016, 7152761(2016).
  57. Schade, A., et al. Magnetic Nanoparticle Based Nonviral MicroRNA Delivery into Freshly Isolated CD105(+) hMSCs. Stem cells international. 2014, 197154(2014).
  58. Bulbake, U., Doppalapudi, S., Kommineni, N., Khan, W. Liposomal Formulations in Clinical Use: An Updated Review. Pharmaceutics. 9 (2), (2017).
  59. Xue, H. Y., Liu, S., Wong, H. L. Nanotoxicity: a key obstacle to clinical translation of siRNA-based nanomedicine. Nanomedicine. 9 (2), London, England. 295-312 (2014).
  60. Nguyen, L. T., Atobe, K., Barichello, J. M., Ishida, T., Kiwada, H. Complex formation with plasmid DNA increases the cytotoxicity of cationic liposomes. Biological & pharmaceutical bulletin. 30 (4), 751-757 (2007).
  61. Omidi, Y., Barar, J., Akhtar, S. Toxicogenomics of cationic lipid-based vectors for gene therapy: impact of microarray technology. Current drug delivery. 2 (4), 429-441 (2005).
  62. Hausburg, F., et al. Defining optimized properties of modified mRNA to enhance virus- and DNA- independent protein expression in adult stem cells and fibroblasts. Cellular physiology and biochemistry: International journal of experimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology. 35 (4), 1360-1371 (2015).
  63. Cardarelli, F., et al. The intracellular trafficking mechanism of Lipofectamine-based transfection reagents and its implication for gene delivery. Scientific reports. 6, 25879(2016).
  64. Kirschman, J. L., et al. Characterizing exogenous mRNA delivery, trafficking, cytoplasmic release and RNA-protein correlations at the level of single cells. Nucleic acids research. 45 (12), e113(2017).
  65. Li, L., Nie, Y., Ye, D., Cai, G. An easy protocol for on-chip transfection of COS-7 cells with a cationic lipid-based reagent. Lab on a chip. 9 (15), 2230-2233 (2009).
  66. Chang, K., Marran, K., Valentine, A., Hannon, G. J. RNAi in cultured mammalian cells using synthetic siRNAs. Cold Spring Harbor protocols. 2012 (9), 957-961 (2012).
  67. Sakurai, K., Chomchan, P., Rossi, J. J. Silencing of gene expression in cultured cells using small interfering RNAs. Current protocols in cell biology. , Chapter 27, Unit 27.1.1-28 (2010).
  68. Hoelters, J., et al. Nonviral genetic modification mediates effective transgene expression and functional RNA interference in human mesenchymal stem cells. The journal of gene medicine. 7 (6), 718-728 (2005).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Dental Follicle Stem CellsStem Cell IsolationEnzymatic DigestionMicroRNA TransfectionCationic Lipid TransfectionFlow Cytometry AnalysisStem Cell CharacterizationMesenchymal Stromal CellsCell Culture ProtocolGenetic Modification

Related Articles