Методическая статья

Изоляция и определение внесосудистой иммунных клеток сердца

DOI:

10.3791/58114

⸱

23 августа 2018 г.

 ,  , 
1Toronto General Hospital Research Institute, University Health Network (UHN), 2Dept of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto, 3Dept of Immunology, University of Toronto, 4Peter Munk Cardiac Centre, 5Ted Rogers Centre for Heart Research

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол предоставляет простой и эффективный метод, чтобы изолировать, выявлять и количественно иммунные клетки, проживающих в миокарде мышей при установившемся или воспаления. Протокол сочетает в себе ферментативные и механических пищеварение для поколения подвеска одну ячейку, которая может быть далее проанализирован подачей cytometry.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Иммунная система является важным компонентом здорового сердца. Миокарда является домом для богатых населения различных иммунных клеток подмножеств с функциональной сегментации, как при стационарном, так и в ходе различных форм воспаления. До недавнего времени, исследование иммунных клеток в самом сердце требует использование микроскопии или слабо развита пищеварение протоколы, которые представили достаточно чувствительности во время тяжелое воспаление, но смогли уверенно выявить небольшие — но ключа — население клетки в стационарном состоянии. Здесь мы рассмотрим простой метод комбинирования ферментативный (коллагеназа, гиалуронидаза и DNAse) и механических переваривания мышиных сердца предшествует внутрисосудистого администрации дневно помечены антител к дифференцировать малые но неизбежным внутрисосудистые клеток загрязнений. Этот метод создает подвеска изолированных жизнеспособных клеток, которые могут быть проанализированы проточной цитометрии для идентификации, фенотипа и количественной оценки, или Далее очищенный с сортировки активирован флуоресценции клеток или разделения магнитный шарик для транскрипционный анализ анализ или в пробирке исследования. Мы включить пример анализа гранулярных пошаговые потока дифференцировать ключевых макрофаги и дендритные клетки населения сердца. Для среднего размера эксперимента (10 сердца) завершение процедуры требует 2-3 ч.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Различные формы миокарда стресса или травмы, включая ишемического (ишемии-реперфузии или инфаркт миокарда) и не связанная с ИБС (гипертонии или миокардит), поощрять набор воспалительных клеток с репаративные и защитные, но и патогенные свойства. Еще в 1891 Ромберга впервые описал наличие клеточных инфильтратов в миокарде больных, инфицированных тифа и скарлатина1. Однако детальное изучение сердца иммунных клеток требует разработки методов более продвинутые Иммунофенотипирование. Как следствие только недавно мы начали понимать, что разнообразие населения иммунных клеток с важным поддержание роли при установившемся находится в миокарде.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этика заявление: этот протокол был рассмотрен и утвержден Комитетом по уход животных на университетской сети здравоохранения (Торонто, Канада) и в соответствии с канадского Совета по лечению животных.

1. буфер подготовка

  1. Подготовьте ГБД буфера (Хэнка сбалансированный соли раствора (HBSS), 2% тепла инактивированная бычьим сывороточным, 0,2% альбумина bovine сыворотки). Добавьте 10 мл тепла инактивированная бычьим сывороточным и 1 g бычьим сывороточным альбумином в 500 мл HBSS. Фильтр стерилизовать через фильтр 0.2 мкм и хранить при 4 ° C.
  2. Подготовка буфера СУИМ (фосфат буфер солевой раствор (PBS), 2% тепла инактивированна....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

На сегодняшний день, не хороший метод был разработан для изолировать иммунных клеток от других компонентов сердечной клетки, например кардиомиоцитов. Следовательно анализ сердца одноклеточного подвеска подачей cytometry требует предварительно стробирования с CD45 для идентификации населения иммунных клеток, следуют одной ячейки и малый размер исключения шлюзовые (рис. 1A). Кроме того жизнеспособность пятнать может выполняться исключить мертвы.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Воспаление миокарда или миокардит, функция наиболее сердечно-сосудистых заболеваний. Однако миокард не лишена своих собственных иммунной компонентов в государствах, не болезнь. При устойчивом состоянии многие иммунные клетки находятся в миокарде и играть существенно важную роль поддержания и защиты. Характеристика этих различных популяциях клеток не было бы возможным без такие методы, как в настоящем Протоколе.

Сочетание механических и ферментативного пищеварения миокарда позволяет изолировать.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана канадской институтов медицинских исследований (148808 и 148792), SE был поддержан сердца и инсульта Фонда, персонала награду от администрация провинции Онтарио, марта Dimes, Тед Роджерс центр исследований сердца и Питер Мунк Сердечный центр. XCC проводит КНИИЗ Banting стипендий. LA проводит сердца и инсульта/Ричард Lewar студенчество премии.

....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Фосфатный буферный растворWisent311-010-CL1x PBS
21 G x 1 1/2 (0,8 мм x 40 мм) Игла PrecisionGlide BD305167
Hank' s Сбалансированный солевой растворWisent311-511-CL1x HBSS
Бычья сыворотка альбуминSigma-AldrichA4503-50G Бычья
сывороткаSigmaB9433
0,5 М Этилендиаминтетрауксусная кислотаBioShopEDT111
Вакуумный фильтр, 0,2 &микро; m Filtropur V50Sarstedt83.1823.001
28 G 1/2 1 cc инсулиновый шприцBD329424
шприц 60 млBD309653
Dulbecco's Modified Eagle MediumWisent 319-005-CL1x DMEM с 4,5 г/л глюкозы и L-глутамина и пирувата натрия
коллагеназы ISigmaC0130из Clostridium histolyticum
Гиалуронидаза типа I-SSigmaH3506
DNase-ISigmaD4513для клеток поджелудочной железы крупного рогатого скота
, 40 & микро; m НейлонFalcon352340
Аммоний-хлорид-калий (ACK) лизисный буферLonza10-546E
Alexa Fluor 700 антимышиный/человеческий CD11bBiolegend1012221:250 разведение
APC/Cy7 антимышиный Ly-6cBiolegend1280251:250 разведение
APC антимышиный CD103Biolegend1214141:250 разведение
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11cBiolegend1173341:250 разведение
PE anti-mouse Ly-6GBiolegend1276071:250 разведение
Pacific Blue anti-mouse I-AbBiolegend1164221:250 разведение
FITC anti-mouse CD64 (FcgRI)Biolegend1393151:250 разведение
PE/Cy7 anti-mouse CD45Biolegend1031131:250 разведение
PerCP/Cy5.5 против мыши CD45Biolegend1031321:40 разведение
TruStain fcX (против мыши CD16/32)Biolegend1013201:100 разведение
True-Stain Блокатор моноцитовBiolegend4261011:20 разведение
FlowJo V10TreeStar Inchttps://www.flowjo.com/solutions/flowjo
Мышь: Batf3-/-Лаборатория ДжексонаJAX: 013755
из сетчатого фильтра

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Marboe, C. C., Fenoglio, J. J. Pathology and natural history of human myocarditis. Pathology and Immunopathology Research. 7 (4), 226-239 (1988).
  2. Epelman, S., et al. Embryonic and adult-derived res....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Cardiac Immune CellsFlow CytometryEnzymatic DigestionMechanical DigestionIntravascular LabelingCell IsolationFluorescence activated Cell SortingMagnetic Bead SeparationSingle Cell SuspensionImmunophenotyping

Похожие статьи