Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Высокая производительность жидкостной хроматографии измерение Кинуренин и Кинуреновая кислота: касающиеся биохимии познания и сна у крыс

10.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/58129

⸱

19 августа 2018 г.

 ,  ,  , 
1Maryland Psychiatric Research Center, Department of Psychiatry, University of Maryland School of Medicine, 2Department of Pharmacology, University of Maryland School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Изменения в нейроактивный метаболитов Кинуренин путь (КП) вовлечены в психиатрических болезней. Расследование функциональные результаты изменены Кинуренин путь метаболизма в естественных условиях в грызунов может помочь прояснить новые терапевтические подходы. Текущий протокол сочетает в себе биохимических и поведенческих подходов для изучения последствий острых Кинуренин вызова крыс.

Аннотация

Кинуренин путь (КП) триптофан деградации были причастны психических расстройств. В частности, экзоцитоз производные метаболит Кинуреновая кислота (KYNA), антагонист на обоих N-метил-d-аспартат (NMDA) и рецепторов α7 никотиновых ацетилхолиновых (α7nACh), был вовлечен в когнитивных процессов в здоровье и болезни. Как KYNA уровни повышаются в мозгах пациентов с шизофренией, неисправности на глутаматергические и холинергических рецепторов считается каузально связаны с когнитивной дисфункции, основной домен психопатологии болезни. KYNA могут играть pathophysiologically важную роль в людей с шизофренией. Это позволяет поднять эндогенного KYNA грызунов мозга, лечение животных с прямой bioprecursor Кинуренин, и доклинические исследования на крысах показали, что острый фасады в КИНА могут влиять на процессы обучения и памяти. Текущий протокол описывает этот экспериментальный подход в деталях и сочетает) биохимический анализ крови Кинуренин и мозг формирования КИНА (с помощью высокой производительности жидкостной хроматографии), b) поведенческое тестирование зонда гиппокампа зависимых контекстной памяти (пассивный избежания парадигмы) и c) Оценка поведения сон бодрствование [телеметрической записей, сочетание электроэнцефалограммы (ЭЭГ) и сигналы электромиограммы (ЭМГ)] в крыс. Взятые вместе, изучается связь между повышенной КИНА, сна и познание, и этот протокол описывает подробно экспериментальный подход к пониманию результатов функции высоты Кинуренин и KYNA образование в естественных условиях в крыс. Результаты, полученные через вариации этого протокола будет проверить гипотезу, что КП и KYNA выполнять ключевую роль в модуляции сна и познания в здоровье и болезни Штатах.

Введение

КП отвечает за унижающего достоинство почти 95% незаменимые аминокислоты триптофан1. В мозге млекопитающих Кинуренин в астроциты метаболизируется в малые молекулы нейроактивный КИНА главным образом фермента Кинуренин (АЛТ) (кат) II2. KYNA действует как антагонист на NMDA и α7nACh рецепторы в мозге2,3,4, и также целей сигнализации рецепторов, включая арил углеводородов рецептор (ААР) и G-белок сочетании рецептор 35 (GPR35)5 ,6. В экспериментальных животных фасады в мозге КИНА показали бы нарушить их когнитивных функций в массив поведенческих анализы2,,78,9,10 . Новые гипотеза предполагает, что КИНА играет важную роль в модуляции когнитивные функции, влияющие на поведение сна11, таким образом дальнейшей поддержки роли экзоцитоз производные молекул в модуляции нейробиологии сна и Познание12.

Клинически фасады в KYNA были найдены в спинномозговой жидкости и посмертные мозговой ткани от пациентов с шизофренией13,14,,1516, изнурительных психическое расстройство характеризуется когнитивные расстройства. Пациентов с шизофренией также часто страдают от расстройства сна, которые могут усугубить болезнь17. Понимание роли КП метаболизма и KYNA в модуляции отношения между сна и познания, особенно между учить и память, могут привести к развитию Роман терапии для лечения этих неблагоприятных исходов в шизофрении и других психические заболевания.

Надежного и последовательного метода для измерения КП метаболитов важно заверить, что исследования, выходящих из различных учреждений могут быть интегрированы в научное понимание биологии КП. В настоящее время мы описываем методологии оценки Кинуренин в плазме крови крыс и KYNA в мозге крыс высокопроизводительных жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Настоящий Протокол, который делает использование обнаружения Флуориметрическое присутствии Zn2 +, был впервые разработан Сибата18 и более недавно адаптирована и оптимизирована для derivatize с 500 мм ацетат цинка как реагент после столбца, позволяющие Обнаружение эндогенные, наномолярных количество КИНА в мозг11.

Чтобы стимулировать выработку эндогенного KYNA de novo , как описано в настоящем Протоколе, прямой bioprecursor Кинуренин вводили внутрибрюшинно (и.п.) у крыс. В сочетании с биохимической оценки для определения степени KYNA производства воздействия Кинуренин вызов памяти гиппокампа зависимые (пассивный избежания парадигмы) и архитектура сон бодрствование (сигналы ЭЭГ и ЭМГ) также исследованы11. Сочетание этих методов позволяет для исследования биохимических и функциональных последствий Кинуренин вызов в естественных условиях в крыс.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Наши экспериментальные протоколы были одобрены Комитетом использования и университета штата Мэриленд институционального ухода за животными и последовал за национальные институты здравоохранения руководство для ухода и использования лабораторных животных.

Примечание: Взрослых самцов крыс Wistar (250-350 g) были использованы в всех экспериментов. Отдельный когорты животных были использованы для биохимический анализ, поведенческими экспериментов и сон бодрствование записей. Животные были размещены в контролируемой температурой объекта в Мэриленд психиатрическом исследовательском центре. Они держали на 12/12 h цикла свето тени, с огнями в zeitgeber время (ZT) 0 и выключенным ZT 12. В ходе экспериментов животных получил ad libitum доступ к продовольствию и воде. Объект был полностью аккредитованных Американской ассоциацией для аккредитации лабораторных животных уход.

1. внутрибрюшинного Кинуренин администрации для крыс

Примечание: В настоящем Протоколе, Кинуренин осуществлялось на ZT 0 (начало этапа света) и собранные на ZT 2 и ZT 4, чтобы определить время курс для Кинуренин метаболизма тканей. Солевой раствор вводят животные были использованы в качестве элемента управления. Например если крысы весит 500 g и желаемого доза-100 мг/кг, крысы должны получить 5 мл инъекционного раствора 10 мг/мл Кинуренин.

  1. Весят, L-Кинуренин сульфат («Кинуренин») и поместите его в стеклянный флакон 20 мл. Убедитесь в том сохранить Кинуренин на льду во все времена.
  2. Добавление физиологического раствора для достижения желаемой концентрации и отрегулировать pH 7.6, используя 1 N гидроокиси натрия (NaOH). Вортекс и sonicate решения, пока полностью не растворится Кинуренин.
    Предупреждение: Выполните все рекомендации меры предосторожности при обращении с NaOH.
    1. Например чтобы добиться решения 10 мг/мл, весят из 200 мг Кинуренин и поместите его в стеклянный флакон. Добавить 15 мл физиологического раствора и вихревые и sonicate (20 кГц для 5-10 сек, 1/8 дюйма диаметр microtip) его распустить. С использованием NaOH, скорректировать рН раствора. Наконец используйте физиологического раствора для регулировки громкости до 20 мл.
  3. Вес каждой экспериментальной крыса и вычислить объем каждой инъекции, исходя из массы тела животного и желаемого лечения дозу. Тщательно удалить животное от его дома Кейдж, внутрибрюшинно внедрить решение и вернуть животное к своей клетке.

2. Кинуренин измерений с помощью высокопроизводительных жидкостной хроматографии

  1. Коллекция тканей
    Примечание: В настоящем Протоколе, Кинуренин осуществлялось на ZT 0 (начало этапа света) и собранные на ZT 2 и ZT 4, чтобы определить время курс для Кинуренин метаболизма тканей. Солевой раствор вводят животные были использованы в качестве элемента управления.
    1. Используйте углекислого газа, чтобы усыпить животных. После признаки дыхания прекратились за 1 мин, выполните метод вторичного эвтаназии, обезглавливание.
    2. Для сбора крови весь ствол, место одноразовые воронки в 15 мл трубку, содержащую 20 мкл K3-ЭДТА (0,5 М). Позволяют крови стечь из тела в трубу. Инвертируйте трубки несколько раз, чтобы убедиться, что ЭДТА смешивается во всем.
    3. Ножницами, вырежьте кожу на верхней части головы вниз midline подвергать черепа. Удалите любые излишки шеи мышц на задней части черепа и на открытии для спинного мозга, прорваться через череп от задней к передней.
      1. Осторожно потяните обе стороны черепа открытым подвергать мозга, а затем тщательно удалить мозга с щипцами, чтобы не повредить его. Удаление обонятельные луковицы с лезвием бритвы и вырезать мозг пополам вниз по средней линии. С помощью щипцов, вскрыть hemibrain в регионы интереса (то есть, гиппокамп и коры).
    4. Поместите все части расчлененных мозга на алюминиевой фольги на сухой лед. После того, как полностью замороженные ткани, передача его в пластиковый флакон 20 мл и храните его при температуре-80 ° C.
    5. Центрифуга крови весь ствол на 300 x g 10 минут удалить супернатант (плазмы) и перевести его на новую пробирок до их хранение при температуре-80 ° C.
  2. Подготовка образца
    1. Плазма: собранные из обработанных животных
      1. Оттепель замороженных трубка с плазмы (см. шаг 2.1 для коллекции ткани) на мокрый лед.
      2. В новых пластиковых пробирок разбавляют образца с ультрачистая вода (1:2 Кинуренин, 1:10 для KYNA). Для 100 мкл разбавленного образца добавьте 25 мкл 6% хлорной кислоты.
        Предупреждение: Выполните все рекомендации меры предосторожности при обращении с хлорной кислоты.
      3. Вихревой все образцы, затем центрифуга их на 12000 x g за 10 мин. После завершения удаления 100 мкл супернатант (из пробирки) и поместите их в небольшой 0,25 мл microcentrifuge трубки для Кинуренин или KYNA определение.
    2. Мозг: собранные из обработанных животных
      1. Место труб с образцами замороженного мозга (см. шаг 2.1 для коллекции ткани) на сухой лед. Индивидуально, весят каждый образец мозга на точные аналитические весы. Вернуть его к трубе и снова поместите ее на сухой лед.
      2. После того, как все образцы были взвешены, перемещение трубы на мокрый лед. Разбавить каждый образец 1:10 w/v с ультрачистая вода и их с помощью sonicator (20 кГц для 5-10 s, microtip диаметр 1/8 дюйма). Например для 100 мг мозговой ткани, добавьте 900 мкл ультрачистая вода.
      3. Аликвота 100 мкл каждого разбавленный образец новой трубки и подкисляет с 25 мкл 25% хлорной кислоты. Вортекс, затем центрифуги на 12000 x g за 10 мин.
      4. После центрифугирования удалите 100 мкл супернатант и поместите его в небольшой 0,25 мл microcentrifuge трубок для определения KYNA.
  3. ВЭЖХ Установка и запуск
    1. 50 мм натрия ацетата мобильных фаза подготовки. Растворите 6,81 g Тригидрат ацетата натрия в 1 Л ультрачистая вода. Отрегулируйте пэ-аш до 6.2 с использованием уксусной кислоты кристаллизированной и затем вакуум фильтр его в чистой посуды. Передача этапа мобильных ацетата натрия в чистой стеклянной бутылки 1 Л.
    2. Подготовьте ацетат цинка 500 мм. Растворите 54.88 g ацетат цинка в 500 мл ультрачистая вода, то вакуум фильтр. Передача его в чистый 500 мл стеклянной бутылке. Заполните бутылка 1 Л с ультрачистая вода и бутылка 500 мл с ВЭЖХ класс ацетонитриле.
    3. Место приема труб от ВЭЖХ машины отдельно в мобильных фазы, ультрачистая вода и ацетонитриле 100%. Насос цинка ацетата раствор отдельно через Перистальтический насос, который сочетает в себе с мобильных этап после столбца и перед деривации.
    4. С помощью панели управления на компьютере, программа для запуска, Ацетонитрил 5% и 95% сверхчистого воды при 0,5 мл/мин разрешить его запуск на 20 – 30 мин для достижения стабильного давления и базовых.
    5. После установления стабильных исходных, измените состав решения Ацетонитрил 5% и 95% натрия ацетата подвижная фаза. Сбалансировать за 30 мин.
    6. Включите лампу в детектор флуоресценции и позволить ему согреться.
    7. В то же время также включите насос после столбца скорость потока 0,1 мл/мин позволяют ему достичь стабильного давления приблизительно 500 psi после примерно 20 минут.
    8. Подготовка стандартов.
      1. Для KYNA, начать с 1 мм Стоковый раствор и разбавить его подготовить 5 стандартных концентрации (т.е., 10 Нм, 5 Нм, 2,5 Нм, 1 Нм и 500 м).
        Примечание: Это будет производить калибровочной кривой от 200 fmoles до 10 fmoles на 20 мкл инъекцию.
      2. Для Кинуренин, начать с 1 мм Стоковый раствор и разбавить его подготовить 5 стандартных концентрации (т.е., 10 мкм, 5 мкм, 2,5 мкм, 1 мкм и 500 Нм).
        Примечание: Это будет производить калибровочной кривой от 200 pmoles до 10 pmoles на 20 мкл инъекцию.
    9. Настройка ВЭЖХ системы программного обеспечения для контроля параметров последовательности образца и autoinjections нескольких образцов.
      1. Когда на экране «Запуск образца», нажмите «Файл» и перетащите «Создать новый набор образца». Когда откроется новое окно, выберите «Пустой». Индивидуально, список всех стандартов (см. шаг 2.3.8) или образцов в порядке, в котором они должны выполняться.
      2. В столбце «Функция» определить стандарты и образцы. Стандарты должны быть assayed в начале и в конце последовательности. Впрыскивают воду между каждые 5 образцов.
      3. Установите время запуска для каждого образца для 15 мин Inject 20 мкл пример из стандартов и плазменные подготовке или инъекционные 30 мкл образца от мозга подготовки огневки.
      4. Набор длин волн возбуждения и выбросов (в зависимости от оцениваемой соединения) для Кинуренин для возбуждения: 365 Нм, выбросов: 480 Нм и время хранения: ~ 6 мин и для KYNA для возбуждения: 344 Нм, выбросов: 398 Нм и время хранения: ~ 11 мин.
      5. После того как все параметры были установлены, и машина достижение равновесного уровня, запустите последовательность.
      6. Для количественной оценки данных, перейдите на экране «Обзор проекта». На вкладке «Образец наборы» дважды щелкните на образце присвоено быть количественно. Из списка всех инъекций выделите все стандарты и щелкните правой кнопкой мыши. В новом окне, выберите «Процесс», а затем использовать раскрывающееся меню для выбора «Калибровки и Quantitate» рядом с «Как»:.
      7. Выделите все стандарты снова, щелкните правой кнопкой мыши и выберите «Обзор». При открытии хроматограм, используйте кнопки в верхней для «Интеграции» и затем «калибровать» каждого стандарта; Это позволит автоматически создать калибровочной кривой.
      8. Вернитесь на вкладку «Образец наборы» и дважды щелкните на образце набора. Далее выделите все стандарты. Повторите процесс, приведенным выше, но вместо этого, выбрав «Quantitate» из раскрывающегося меню. Выделите все образцы снова, затем щелкните правой кнопкой мыши и выберите «Обзор». Когда хроматограммы открыт, используйте кнопки в верхней, чтобы «Включить» и затем «Quantitate» каждого образца.
        Примечание: Это будет выводить концентрация каждого образца, на основе ранее созданной калибровочной кривой.

3. пассивные избежания парадигма

Примечание: Эти поведенческие эксперименты были разработан на основе нашей биохимические выводы с проблемой острого Кинуренин. Для максимального увеличения в мозге КИНА, Кинуренин (100 мг/кг) осуществлялось на ZT 0, 2 часа до тренировки в пассивной избежания парадигмы для тестирования гиппокампа опосредованной обучения, которое произошло на ZT 2. Аппарат состоит из 2 одинаковых по размеру отсеков (21.3 см высотой, 20,3 см в ширину и 15,9 см в глубину) разделенных дверью гильотинные и содержится внутри Звукоизолированные окна. Два отсека тестирования аппарата называются «светлая сторона» и «темную сторону». Стены стороне света ясны, и в ходе судебного разбирательства, загорится для дальнейшего освещают этот отсек. Стены темный отсек полностью покрыты сохранить условие плотными.

  1. День 1: учебные суда
    1. До начала испытаний, очищайте аппарат с 70% этиловом спирте.
    2. Принесите животных для тестирования номер.
    3. Осторожно поместите экспериментальных животных в стороне света аппарата и закрыть и защелки дверь аппарат и звукоизолированные окна.
    4. С помощью соответствующего программного обеспечения, начните судебный процесс. От домашнего экрана выберите «Файл» и затем «Открытой сессии» из раскрывающегося меню. В новом окне убедитесь, что выбраны правильные процедуры и аппарат и нажмите кнопку «Закрыть». Далее выберите «Настройки» и затем «Сигналы». В новом окне выберите правильный аппарат и нажмите кнопку «Вопроса».
      Примечание: Программное обеспечение будет инициировать свет, чтобы включить в стороне света аппарата и открыть дверь гильотинные между двумя средами. Таймер будет начата.
    5. Когда животное полностью входит в темной стороне аппарата, гильотинные закроется на дверь и неизбежное ног шок (0,56 мА на 1 s) будут доставлены.
    6. Запись времени, которое прошло, прежде чем животное вошел темный отсек.
    7. После того, как животное получил шок, позволяют 30 s время восстановления перед удалением животное из аппарата.
    8. Место животных обратно в свои дома клетке.
    9. Перед началом судебного разбирательства с следующее животное, протрите аппарат следует протереть влажным полотенцем и распоряжаться любой фекальные пеллеты.
    10. После того, как прошли все животные, верните их в объекте животных.
  2. День 2: тестирование суда
    1. Верните животных в тестирования номер 24 ч после подготовки судебного разбирательства. Начните процесс тестирования для первого животного, поместив его в легкой стороне аппарата, закрытия и защелки дверь и звукоизолированные окна.
    2. Инициировать процесс тестирования, используя те же команды программного обеспечения как в предыдущий день; свет будет включаться в стороне света аппарата и откроется дверь гильотинные между двумя средами. Таймер будет начата.
    3. Когда животное входит темный отсек, гильотинные дверь закроется. Рекордное время прошло.
      Примечание: Судебный процесс будет прекращено через программное обеспечение после максимум 300 s если животное остается на стороне света тестирования аппарата.
    4. Место животных обратно в свои дома клетке и очистите аппарат (как описано в шаге 3.1.9) до начала судебного разбирательства с следующее животное.

4. Сон анализ

  1. Хирургической имплантации беспроводной передатчик ЭЭГ/ГРП
    Примечание: Телеметрические передатчики должны стерилизовать и подготовлен до хирургии.
    1. С помощью лезвия бритвы, аккуратно удалите небольшой длины пластикового покрытия раскрыть что провод ведет. Поместите приемник в 50 мл Конические трубки заполнены с стерилизации решение [например, Wavecide (2,65% глютаральдегид)].
      1. Оставьте в противовоспалительное решение для по крайней мере 12 h передатчики. Затем до операции, перенесите решение контейнер для отходов. Промойте передатчика с стерильного физиологического раствора.
    2. В день операции вес животного до помещения в камеру анестезии. Побудить 3 – 5% изофлюрановая с 100% O2.
    3. После успешного анестезии удалите животного и тщательно побриться, с помощью электрической бритвой, в верхней части головы и шеи, а также небольшой участок волос на задней части тела, чуть слева и ниже грудной клетки.
    4. Администрирование carprofen (5 мг/кг) подкожно для послеоперационного обезболивания.
    5. Место термостатируемым теплой воды грелку набор при 37 ° C под животное для поддержания температуры тела животного во время операции.
    6. В стереотаксической рамы поместите животное на носовой конус для поддержания анестезии состояния и место уха баров для стабилизации голову. Стерилизуйте бритой кожи путем чередования тампоны Бетадин скраб и 70% этанола. Применять мазь opthalamic на глаза, чтобы смазать их.
    7. Для обеспечения адекватной анестезии до первого разреза, используйте тест мыс пинча.
    8. С помощью стерильным скальпель, надрезают от позади глаз до задней части шеи. Череп и спинной шейки матки шеи мышц должны быть доступны.
    9. При необходимости подвергать черепа, используйте ватным наконечником аппликаторы для удаления любых мембраны. Микро бульдог зажимы могут использоваться для держать кожу от черепа. Найдите и отметьте положение bregma. 2 заусенцев-отверстия и вставить металлические винты 2.0 мм передней / + 1,5 мм бокового и 7,0 мм задняя / 1,5 мм бокового по отношению к bregma. Полный 2 витков затяните винты. Покрытия подвергаются черепа с куском марли.
    10. Используя стерильные хирургические ножницы, надрезать в полость тела, чуть ниже ребер.
    11. На листе хирургические убедитесь, что запись серийного номера передатчика чтобы быть имплантированы.
    12. Вставьте стерильную передатчик внутри полости тела. Провода должны быть вне тела.
    13. Используйте рассасывающиеся швы шов мышц стенки, обеспечивая собраны в один конец разреза все приводит.
    14. Удалить марлю из головы и поднимите вверх кожу чуть ниже разреза. Запустите пару давно стерильные hemostats под кожу от головы разрез в разрез в сторону. Держите давление на кожу таким образом, чтобы свести к минимуму любой травмы.
      1. После hemostats видны вблизи тела разрез, клип мембраны, которая может покрыть их с Ножницы хирургические и захватить четыре передатчика ведет с hemostats. Медленно нарисуйте hemostats, так что провода лежал под кожу и подбежал к черепу.
    15. Указать, что 2 приводит будет подключен к черепу. С помощью щипцов, Возьмите конец проволоки с одной стороны и чуть ниже конца пластиковые ножны с другой. До тех пор, пока отдельные циклы могут быть сделаны просто тяните провод.
    16. Плотно оберните подвергаются проволоку вокруг одной из металлических винтов 3 – 4 x. После безопасной, затяните винт, чтобы предотвратить распад провод и клип от любых дополнительных проводов. Повторите это с второй свинца и винт.
    17. Тяните провода оба ЭЭГ от полости тела, так что они уютно сидят против черепа.
    18. Использование зубной цемент для покрытия винты и коры приводит, создавая колпачок над подвергаются черепа. Убедитесь, что нет стоматологического цемента прилипает к коже или мышц и создана без острых углов. Разрешить стоматологического цемента высохнуть.
      Примечание: Колпачок должен быть достаточно небольшим, что кожа может быть зашивается над верхней.
    19. Для ГРП приводит понять конец проволоки и пластиковые ножны, как описано в шаге 4.1.15. Протянуть провод до тех пор, пока отдельные циклы явно заметной.
    20. Запустите иглой 22 G под мышцы шеи на правой стороне для 2-3 мм перед позволяя ему выйти. Использование nonabsorbable швы, место одного, свободные швом вокруг встроенного иглы.
    21. Провод нить ГРП в иглу и вытяните иглы, позволяя ГРП провод нить под мышцу. Затяните шовный материал для обеспечения провод остается на месте и клип дополнительные провода, которые могут возникнуть из мышцы.
    22. Повторите шаги 4.1.20 и 4.1.21 для второго ГРП свинца, около 1 мм вниз от первого свинца.
    23. Тяните оба ГРП ведет от полости тела, так что они уютно сидят против мышцы.
    24. Используйте nonabsorbable стежков, чтобы закрыть разрез головы и шеи. Уложить все дополнительные провода под кожу тела и использовать рану клипов, чтобы закрыть разрез тела.
    25. Применять мазь лидокаина для обоих разрез сайтов для оказания помощи животное с послеоперационной боли.
    26. Вернуть животное домой клетку, позволяя клетке, чтобы сидеть на грелку, до тех пор, пока животное оправился от анестезии.
      Примечание: Животное должно восстановить 7 – 10 дней до начала записи.
  2. Запись ЭЭГ/ГРП
    Примечание: В настоящем Протоколе, мы ведении физиологического раствора или Кинуренин на ZT 0 и затем записал животного сна бодрствования моделей за 24 ч.
    1. Завершите все записи сна в назначенный номер, где животных не будет прерван на время записи.
    2. Место дома клетка животного (с учетом имплантированных передатчик ЭЭГ/ГРП) на приемник. Включите хирургически имплантированных передатчик с помощью магнита.
      Примечание: Свет должен появиться на приемник при включении передатчика.
    3. Настройка записи данных ЭЭГ/ГРП с использованием соответствующего программного обеспечения.
      1. Выберите из раскрывающегося меню «Эксперимент» и нажмите «Создать». Имя эксперимент, а затем сохраните его. Далее выберите «Оборудование» и нажмите «Редактировать MX2 конфигурация».
      2. В новом окне выберите все передатчики, используемые в эксперименте и указать, какие получения площадку в паре с. Когда все готово, начать запись, нажав «Начать все непрерывное».
    4. На прекращение экспериментов выберите «Остановить все непрерывное» в соответствующее программное обеспечение и выключить приемник, с помощью магнита.
    5. Усыпить животных CO2 удушение следуют прокол сердца. Осторожно снимите передатчика, открытие разрез вдоль верхней части головы с Ножницы хирургические и резки провода от стоматологического цемента и шеи мышц.
    6. Далее откройте полости тела, найдите передатчика и медленно извлеките его из организма.
  3. Анализ ЭЭГ/ГРП
    1. Используйте соответствующее программное обеспечение для анализа данных сон бодрствование. Откройте программу и выберите «Добавить новое расположение». В новом окне выберите данные для импорта в скоринга программного обеспечения.
      Примечание: Это создаст новый файл в рамках программного обеспечения, содержащий все сырье сигналов, собранные в ходе эксперимента.
    2. Вручную Оценка государства проявлять бдительность для желаемого экспериментов. После забив, анализировать такие параметры, как общая продолжительность, количество схваток и Средний бой продолжительности различных бдительности государств [быстрое движение глаз (REM), не - REM NREM и Звонок].
      Примечание: Анализ может быть выполнена над всей записи или сокращен до определенного времени точек интереса. Здесь был проведен анализ для записи период между ZT 0 ZT 2.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Чтобы проверить использование внутрибрюшинного Кинуренин инъекции как метод поднять мозга КИНА, был проведен анализ ВЭЖХ ткани. Стандартные кривые (рис. 1) были построены с использованием соответствующего программного обеспечения и для количественного определения образцов ткани. Представитель хроматограммы для Кинуренин и KYNA представлены на рисунке 2. Кинуренин наблюдалось во время удержания 6 мин, и KYNA время удержания 11 мин...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Для надежной оценки КИНА в мозге после периферических Кинуренин администрации важно сочетать и интерпретировать биохимических и функциональных экспериментов. Здесь мы представляем подробный протокол, который позволяет новым пользователям устанавливать эффективные методы для измерения Кинуренин плазмы и мозг КИНА крыс. Измерение Кинуренин в плазме подтвердил Точная инъекция и измерение метаболит KYNA подтверждает de novo синтеза в головном мозге. Существует несколько преимуществ описанных флуориметрический метода...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Настоящее исследование было частично финансируется национальных институтов здравоохранения (R01 NS102209) и пожертвование от Клэр E. Форбс доверять.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
КрысыWistar Charles River Laboratoriesвзрослый самец, 250-350 г
L-кинуренинасульфата Sai Advantium
ReproSil-Pur C18 колонка (4 мм x 150 мм)Dr. Maisch GmbH
EZ ClipsStoelting Co.59022
Монтажные материалы винтовPlasticsOne00-96 X 1/16
Нерассасывающиеся шовные материалыMedRep Express699BCP Medical Monomid Black Nylon Шовные материалы, 4-0, P-3, 18", КОРОБКА из 12
рассасывающихся шовных материаловEthiconJ310H4-0 Покрытый викрил фиолетовый 1X27'' SH-1
Стоматологический цементStoelting Co.51458
СверлоStoelting Co.5145510,45 мм
Название<strong>Company>Каталожный номерКомментарии
Alliance HPLC system
E2695 модуль разделенияВода176269503
2475 флуоресцентный детекторВоды
менеджер по реагентам после колонкиУотерс725000556
Lenovo компьютерWaters668000249
программное обеспечение EmpowerWaters
NameCompany>Catalog NumberКомментарии
<сильный>Пассивный бокс для крыс
Сверхвысокий шкаф из МДФ для шумоизоляцииMedAssociatesENV-018MDИнтерьер: 22" (Ш) x 22" (В) x 16" (D)
Модулятор центрального канала челночная камера камераMedAssociatesENV-010MC
Решетчатый пол из нержавеющей стали для крысMedAssociatesENV-010MB-GF
Автоматическая гильотинная дверьMedAssociatesENV-010B-S
Быстроразъемная сетка шаттла напольного жгута для крысMedAssociatesENV-010MB-QD
Стимульный свет, 1" белая линза, установленная на модульной панелиMedAssociatesENV-221M
Модуль Sonalert с регулятором громкости для крысиной камерыMedAssociatesENV-223AM
SmartCtrl 8 вход/16 выходовMedAssociatesDIG-716P2
8-канальное ИК-управление для челночных боксовMedAssociatesENV-253C
Инфракрасный источник и массив детекторовMedAssociatesENV-256
Настольный интерфейсный шкаф, 120 В 60 ГцMedAssociatesSG-6080C
Двухдиапазонный модуль аверсивной стимуляции постоянным токомMedAssociatesENV-410B
Твердотельная решетка напольного скремблераMedAssociatesENV-412
Двойной модуль контроля удара A/BMedAssociatesENV-415
2' 3-контактный мини-молекс удлинительMedAssociatesSG-216A-2
10' Выходной кабель удара, DB-9 M/FMedAssociatesSG-219G-10
Шаттл ударопрочный кабель 15', 6MedAssociatesSG-219SA
Малый настольный шкаф и блок питания, 120 В 60 ГцMedAssociatesSG-6080D
PCI интерфейсный пакетMedAssociatesDIG-700P2-R2
Шаттл бокс утилита обходаMedAssociatesSOF-700RA-7
Name< strong>CompanyНомер в каталоге>Comments
>Оборудование для мониторинга сна и бодрствования
Ponehmah softwareData Sciences International (DSI)PNP-P3P-610
MX2 8 Интерфейс сбора данныхData Sciences International (DSI)PNM-P3P-MX204
Компьютер Dell, Optiplex 7020, Windows 7, 64-разрядныйData Sciences International (DSI)271-0112-013
Dell 19-дюймовый компьютерный мониторData Sciences International (DSI)271-0113-001
Приемники для пластиковых клеток, 8xData Sciences International (DSI)272-6001-001
Cisco RV130 VPN маршрутизаторData Sciences International (DSI)RV130
Matrix 2.0Data Sciences International (DSI)271-0119-001
Сетевой коммутаторData Sciences International (DSI)SG200-08P
Программное обеспечение Neuroscore DataSciences International (DSI)271-0171-CFG
Передатчик двух биопотенциальных каналов, модель TL11M2-F40-EETData Sciences International (DSI)270-0134-001
186247500 176706100

Ссылки

  1. Leklem, J. E. Quantitative aspects of tryptophan metabolism in humans and other species: a review. The American Journal of Clinical Nutrition. 24 (6), 659-672 (1971).
  2. Pocivavsek, A., Notarangelo, F. M., Wu, H. Q., Bruno, J. P., Schwarcz, R. Astrocytes as Pharmacological Targets in the Treatment of Schizophrenia: Focus on Kynurenic Acid. Modeling the Psychophathological Dimensions of Schizophrenia - From Molecules to Behavior. Pletnikov, M. V., Waddington, J. L. , Elsevier, Academic Press. London, San Diego, Waltham, Oxford. 423-443 (2016).
  3. Hilmas, C., et al. The brain metabolite kynurenic acid inhibits alpha7 nicotinic receptor activity and increases non-alpha7 nicotinic receptor expression: physiopathological implications. Journal of Neuroscience. 21 (19), 7463-7473 (2001).
  4. Perkins, M. N., Stone, T. W. An iontophoretic investigation of the actions of convulsant kynurenines and their interaction with the endogenous excitant quinolinic acid. Brain Research. 247 (1), 184-187 (1982).
  5. DiNatale, B. C., et al. Kynurenic acid is a potent endogenous aryl hydrocarbon receptor ligand that synergistically induces interleukin-6 in the presence of inflammatory signaling. Toxicological Sciences. 115 (1), 89-97 (2010).
  6. Wang, J., et al. Kynurenic acid as a ligand for orphan G protein-coupled receptor GPR35. The Journal of Biological Chemistry. 281 (31), 22021-22028 (2006).
  7. Alexander, K. S., Wu, H. Q., Schwarcz, R., Bruno, J. P. Acute elevations of brain kynurenic acid impair cognitive flexibility: normalization by the alpha7 positive modulator galantamine. Psychopharmacology (Berlin). 220 (3), 627-637 (2012).
  8. Chess, A. C., Landers, A. M., Bucci, D. J. L-kynurenine treatment alters contextual fear conditioning and context discrimination but not cue-specific fear conditioning. Behavioural Brain Research. 201 (2), 325-331 (2009).
  9. Chess, A. C., Simoni, M. K., Alling, T. E., Bucci, D. J. Elevations of endogenous kynurenic acid produce spatial working memory deficits. Schizophrenia Bulletin. 33 (3), 797-804 (2007).
  10. Pocivavsek, A., et al. Fluctuations in endogenous kynurenic acid control hippocampal glutamate and memory. Neuropsychopharmacology. 36 (11), 2357-2367 (2011).
  11. Pocivavsek, A., Baratta, A. M., Mong, J. A., Viechweg, S. S. Acute Kynurenine Challenge Disrupts Sleep-Wake Architecture and Impairs Contextual Memory in Adult Rats. Sleep. 40 (11), (2017).
  12. Halassa, M. M., et al. Astrocytic modulation of sleep homeostasis and cognitive consequences of sleep loss. Neuron. 61 (2), 213-219 (2009).
  13. Erhardt, S., et al. Kynurenic acid levels are elevated in the cerebrospinal fluid of patients with schizophrenia. Neuroscience Letters. 313 (1-2), 96-98 (2001).
  14. Linderholm, K. R., et al. Increased levels of kynurenine and kynurenic acid in the CSF of patients with schizophrenia. Schizophrenia Bulletin. 38 (3), 426-432 (2012).
  15. Sathyasaikumar, K. V., et al. Impaired kynurenine pathway metabolism in the prefrontal cortex of individuals with schizophrenia. Schizophrenia Bulletin. 37 (6), 1147-1156 (2011).
  16. Schwarcz, R., et al. Increased cortical kynurenate content in schizophrenia. Biological Psychiatry. 50 (7), 521-530 (2001).
  17. Pocivavsek, A., Rowland, L. M. Basic Neuroscience Illuminates Causal Relationship Between Sleep and Memory: Translating to Schizophrenia. Schizophrenia Bulletin. 44 (1), 7-14 (2018).
  18. Shibata, K. Fluorimetric micro-determination of kynurenic acid, an endogenous blocker of neurotoxicity, by high-performance liquid chromatography. Journal of Chromatography. 430 (2), 376-380 (1988).
  19. Buzsaki, G. Memory consolidation during sleep: a neurophysiological perspective. Journal of Sleep Research. 7, 17-23 (1998).
  20. Graves, L. A., Heller, E. A., Pack, A. I., Abel, T. Sleep deprivation selectively impairs memory consolidation for contextual fear conditioning. Learning & Memory. 10 (3), 168-176 (2003).
  21. Yamashita, M., Yamamoto, T. Tryptophan circuit in fatigue: From blood to brain and cognition. Brain Research. 1675, 116-126 (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

KYNA
Высокая производительность жидкостной хроматографии измерение Кинуренин и Кинуреновая кислота: касающиеся биохимии познания и сна у крыс
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.