Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Использование трансплантации гемопоэтических стволовых клеток для оценки происхождения миелодиспластический синдром

9.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/58140

⸱

3 октября 2018 г.

 ,  ,  , 
1Genetics Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 2LGI Flow Cytometry Core Facility, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health

В этой статье

Краткое содержание

Мы описывают использование трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК) для оценки злокачественным потенциалом генетически модифицированные гемопоэтические клетки. ТГСК полезен для оценки различных злокачественных гемопоэтических клеток в естественных условиях , а также создание большой когорты мышей с лейкозом или миелодиспластические синдромы (MDS) для оценки Роман терапии.

Аннотация

Миелодиспластические синдромы (MDS) представляют собой разнородную группу расстройств гемопоэтических стволовых клеток, которые определяются неэффективными кроветворения, периферической крови цитопении, Дисплазия и склонность для преобразования острый лейкоз. NUP98-HOXD13 (NHD13) трансгенных мышей пилки человека MDS с точки зрения периферической крови цитопении, Дисплазия и преобразование, острый лейкоз. Ранее мы показали, что MDS могут быть переданы от генетически мышь с MDS одичал тип получателей путем трансплантации клеток костного мозга тому MDS (BMNC). Более четко понимать MDS ячейке происхождения, мы разработали подходы к пересадке конкретных, immunophenotypically определены гемопоэтических подмножеств. В этой статье мы описываем процесс изоляции и пересадка конкретных популяций гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток. После трансплантации мы описаны подходы к оценке эффективности трансплантации и сохранение клеток донора MDS.

Введение

Миелодиспластические синдромы (MDS) представляют собой разнообразный набор клоновых крови расстройства характеризуются неэффективным кроветворения, морфологических доказательств дисплазии и склонность для преобразования острый миелоидный лейкоз (ОМЛ)1,2 ,3,4. Неэффективные кроветворения признан созревания арест в костный мозг и результаты в периферической крови цитопении несмотря на костный мозг hypercellular1,3. Распространенность MDS различно оценивается как 2-12 случаев на 100 000 человек ежегодно в Соединенных Штатах, и заболеваемость MDS увеличивается с возрастом, что является важным условием, чтобы понять с учетом старения населения США3, 5. Хотя в большинстве случаев MDS имеют без четких этиологии, некоторых случаях MDS считается вследствие воздействия известных генотоксичным агентам, включая растворители например, бензол и химиотерапии рака6.

MDS пациентов обычно приобрели мутаций в клетках MDS7. Хотя сравнительно редко, число больных MDS приобрели сбалансированного хромосомные транслокации, с участием генов, например, NUP98, EVI1, RUNX1 и МРОТ (http://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman). Наша лаборатория имеет давнюю заинтересованность в транслокации хромосом, которые включают гена NUP988. Трансгенных мышей, что Экспресс, NUP98-HOXD13 (NHD13) трансген регулируется Vav1 промоутер и усилитель элементы отображения всех ключевых особенностей MDS, включая периферической крови цитопении, морфологических доказательств дисплазии, и преобразование к бод9 .

Хотя MDS были признаны за более чем 60 лет10и считаются расстройство клоновых стволовых клеток, усилия привить клеток человека MDS иммунодефицитных мышей были во многом неудачными, потому что клетки MDS угодный плохо11, 12,13,14 и мышей не развиваются клинические заболевания. В попытке определить, какие кроветворные клетки могут передавать MDS, мы обратились к NHD13 модели и показал, что мы могли привить MDS как болезнь субъект, который показал все кардинальные особенности человека MDS, в том числе периферической крови цитопении, дисплазии, и преобразование к бод15. В настоящем докладе мы представляем технические детали этих экспериментов, а также подходы к дальнейшей фракционировать гемопоэтических стволовых и клеток-предшественников (HSPC), в целях выявления MDS-инициирование клетки.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Животных процедуры, описанные в этой статье были утверждены в национальном институте рака в Bethesda животное уход и использование Комитета и соответствуют политики, содержащихся в политике службы общественного здравоохранения на гуманного ухода и использования лабораторных животных, Закон о защите животных и руководство для ухода и использования лабораторных животных.

1. Подготовка клетки

  1. Заготовка ядерных клеток костного мозга (BMNC)
    1. Используйте только стерильные материалы. Стерилизуйте повторно используемых инструментов, с помощью паровой автоклав. Покупка, иглы, шприцы и пластиковая посуда в одноразовых стерильных контейнеров. Выполните все манипуляции животного и клетки в класс II, типа A2 биологической безопасности кабинета.
    2. Подготовка BMNCs в 14 мл круглая труба внизу, содержащие 3 мл HF2 (Хэнк сбалансированный дополнена плода бычьим сывороточным 2% раствор соли).
    3. Усыпить C57Bl6 доноров мышей (положительное для CD45 аллеля CD45.2), возраст обычно 2-6 месяцев, используя камеру CO2 .
    4. Стерилизуйте мыши туши путем распыления на 70% спирте по всему телу с спрей бутылку. Очистите кожу от ноги, от таза до лодыжки.
    5. Удалите из каркаса, используя стерильные ножницы (прямой, острый/Шарп, 11,5 см) и щипцы (Грефе, зубчатые, ширина 0,8 мм кончик) бедра и голени. Трим прилагаемый мышцы ясно.
    6. Вырежьте проксимальных и дистальных концов голени с ножницами. Проведение голени с щипцами, вставьте шприц 3 мл 27-калибруйте содержащие 2,5 мл HF2 в полость большеберцовых костного мозга на дистальном конце голени (голеностоп). Промойте клетки костного мозга от голени с использованием мягкое давление в 14 мл круглая труба внизу.
      1. Повторите для других голени.
    7. Вырежьте проксимальном и дистальном концы бедренной кости с ножницами. Скрытой полости костного мозга бедренной кости, вставив 20-иглы придает шприц 3 мл содержащие 2,5 мл HF2 в дистальный конец бедренной кости полости костного мозга и применяя мягкое давление шприца.
      1. Повторите для других бедренной кости, собирая все костного мозга от обоих голени и бедра в том же 14 мл круглая труба внизу.
    8. Разогнать массы мозга, аспирационных вверх и вниз несколько раз с той же иглой 20-го калибра, придает шприц 3 мл.
  2. Пятнать антитела от BMNC
    1. Всего BMNC. Добавьте 20 мкл раствора уксусной кислоты 3% 20 мкл суспензии BMNC, созданного на шаге 1.1.8. Затем рассчитывать, с помощью инвертированного микроскопа и Горяева.
    2. Пелле BMNC нежный центрифугированием при 450 g x 5 мин при 4 ° C. Ресуспензируйте лепешка с HF2 с использованием 90 мкл на 107 клеток и 10 мкл антител анти линии биотинилированным коктейль для суспензии клеток.
    3. После инкубации в течение 20 минут при температуре 4 ° C, мойте окрашенных клеток с 3 мл физиологического раствора фосфатного буфера (PBS).
    4. Ресуспензируйте BMNC с 100 мкл HF2 за 107 клеток. Добавьте 2 мкл аллофикоцианин (APC) конъюгированных антитела анти биотина для суспензии клеток, следуют инкубации на 4 ° C в течение 20 мин.
    5. Промойте окрашенных BMNC с 3 мл PBS и Ресуспензируйте BMNC с HF2 с 0,2 мкг/мл пропидий йодидом (PI) для сортировки клеток цитометрии потока.
  3. Поток цитометрии сортировки клеток от BMNC
    1. Калибровка потока цитометрии клеток сортировщик. Оптимизировать все фотоэлектронный умножитель трубы (PMT), скаттер и флуоресценции параметров неокрашенных клетки и установить в пределах диапазона линейной каждого детектора.
    2. Подготовить безупречная, PI-витражи, и APC помечены линии коктейль клетки параллельно с шагом 1,2. Анализировать спектральные компенсации.
    3. Дискриминацию Дуплет клетки путем последовательного стробирования FSC-H против SSC-H, 640-SSC-A против 640-SSC-H и 640-SSC-S против 640-SSC-W.
    4. Исключите нежизнеспособных клеток с использованием PI возбужденных в 561 Нм и выбросах, собранные с ВЧ фильтром 614/20 группы. Возбуждают линии APC, помечены клетки на 640 нм и собирать выбросов с ВЧ фильтром 671/30 группы.
    5. Запись значения флуоресценции как высота напряжения и собрать по меньшей мере 100 000 событий в список файлов данных режим визуализации населения должен быть отсортирован.
    6. Вычисления спектральной компенсации после приобретения трех образцов 10 000 ячеек для следующего: без маркировки клетки, PI, помечены клетки и антитела анти линии коктейль с APC, помечены клетки.
    7. Установка трех регионов для сортировки Lineage отрицательные (LN), Lineage положительный (LP) с тусклым флуоресценции интенсивности (LP1) и LP населения с яркими флуоресценции (LP2) в 5 мл пробирки, содержащие 0,5 мл 10% FBS средств массовой информации.
    8. Сортировка клеток с помощью одной капли конверт и очистить режим прерывания.
    9. Выполните анализ рода пост с 1000 всего клетки на каждого отсортированного образца для подтверждения чистоты и жизнеспособность сортировки клеток.
    10. Собирать отсортированных клетки центрифугированием при 450 g x 5 минут при температуре 4 ° C и Ресуспензируйте Пелле клеток с 0,5 мл HF2.
    11. Подтвердите сортировки клеток с Горяева и Трипановый синий. Настройка количества клеток с HF2 для трансплантации.
      Примечание: Широкий спектр BMNC населения могут быть изолированы для трансплантации, используя дополнительные комбинации флюрохром конъюгированных антител в шаге 1.2.2 выше.

2. получателей мышей подготовка и трансплантация гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК)

  1. Подготовка получателей для трансплантации
    1. Поддерживать, ветеринарии и животноводства ухода за congenic получателя мышей (B6-LY5.1/Cr, CD45.1) в объекте бесплатно (SPF) конкретного патогена животного.
    2. Для профилактическое обеззараживание желудочно-трек предоставляют стерильной водой, содержащий 100 мг/Л ципрофлоксацин получателям за 7 дней до летальной дозы (9 гр) облучения и поддерживать в течение 14 дней после облучения.
    3. Гласят летальной дозы (9 гр) облучение от источника Cs. Используйте оператор квалифицированных, сертифицированных Cs. Установите инструмент источника Cs доставить гамма облучение 70 СГР/мин всего тела. Место 10 мышей в специально держателя и вставьте держатель в зале облучателя. Доставить 9 гр тотальное облучение тела в 13 мин и вернуть их клетки мышей.
  2. Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток
    1. Смесь дикого типа (WT) BMNC от congenic получателя мыши (B6-LY5.1/Cr, CD45.1) в дозе ячейки 2 x 105 клеток на мышь с 2 до 5 x 104 клетки очищенный теста, который подготовил BMNC с потока цитометрии сортировки как описано в разделе 1.3 выше. Смешайте клетки в том же шприц.
      Примечание: WT BMNC предоставляют Спаринг эффект радиации получателя мыши и позволяют для выживания получателя мыши, если тест клетки не поддерживают кроветворения. WT-BMNC используется в этом типе эксперимента Экспресс аллеля CD45.1 и таким образом можно отличить от Испытание клеток с использованием антител, устанавливающих дискриминацию между CD45.1 и CD45.2. WT-BM клетки называются «вспомогательные клетки», «излучения щадящие клетки» или «конкурент клетки».
    2. Отрегулируйте громкость смесь клеток до 200 мкл каждого получателя с помощью стерильных HF2 для содействия инъекции.
    3. Трансплантации клеток смеси для смертельно облученного получателей мышей через внутривенное хвост инъекции Вену с помощью 1 мл шприц и игла 28-го калибра, в течение 24 часов облучения. Место мыши хвост под тепла лампы, как тепла приводит к хвост дилатация вен.
      Примечание: Усыпить всех получателей мышей в конце исследования и оценивать развитие болезни, патанатомия, гистология и проточной цитометрии.

3. приживления Assay, используя поток цитометрии

  1. Для оценки доноров клеток приживления, соберите периферической крови (PB) от получателя мышей на 6-й недели, 12-й недели и 16-й недели после пересадки.
  2. Теплый получателей в клетке с тепла лампы около 1 мин и поместите мышь на фиксатор.
  3. Cut хвост вен с помощью скальпеля (лезвия 10, #3 скальпель ручки) и собирать 100 мкл PB каждого получателя, используя микрокапиллярной трубка, содержащая ЭДТА как антикоагулянт.
  4. Разделите собранные PB на два равных аликвоты, поместив 50 мкл в стерильных microcentrifuge трубку. Использовать один Алиготе для автоматизированный анализ крови (CBC) (выполнена на основные гистопатология NCI) и использовать второй Алиготе для пятнать антитела и проточная цитометрия.
  5. Чтобы обнаружить доноров приживления подачей cytometry, лизируют эритроцитов (РБК), добавив 1 мл буфера lysis гипотонический РБК (8.29 г/Л NH4Cl, 1 г/Л KHCO3, 0,037 г/Л Na2ЭДТА, рН 7,2) 50 мкл собранных PB. Вихрь образец, чтобы смешивать и инкубировать 10 мин при комнатной температуре.
  6. Центрифуга лизированных PB в 4600 x g 1,5 мин тщательно удалить супернатант и отбросить.
  7. Частично нарушить клетки Пелле, осторожно нажав или «стряхивая» в нижней части трубки. Добавьте 1,3 мл PBS в гранулы расположен в трубку и центрифуги на 4600 x g 1,5 мин тщательно аспирата и удалить супернатант.
  8. Нарушить Пелле ячейку, нажав или щелкая и 200 мкл HF2 с 5% крыс сыворотка Пелле ячейки.
  9. Добавьте анти CD45.2 антител (в 1 мкл) с аллофикоцианин (APC) к суспензии клеток. Инкубируйте на 4 ° C для по крайней мере 30 минут и кратко вихревой смеси.
  10. После окрашивания, вымыть клетки дважды, как описано выше и Ресуспензируйте с 400 мкл HF2 с 1 мкг/мл Пи.
  11. Обнаружение с помощью 4-цветный проточный цитометр приживления. Получить дополнительную информацию о типах клеток в периферической крови, добавив дополнительные антитела для выявления конкретных клеток типы, такие как B или T лимфоциты.
  12. Запись данных последовательных приживления с помощью распространения листа для дальнейшего анализа данных.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Мы показываем представительных цифры для результаты нескольких экспериментов. Рисунок 1 показывает представитель проточной цитометрии, сортировка эксперимент. Во время нормального кроветворения дифференциации как клетки становятся приверженность конкретным гемопоэтических линии, они приобретают определение линии клеток поверхностных маркеров и потерять возможность самообновления. Таким образом в мышах одичал типа, стволовых клеток самообновлению ограничиваетс...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Хотя MDS расстройство клоновых гемопоэтических стволовых клеток, MDS «остановить» или вызывающей ячейки, пока не характеризовались. Ранее мы показали, что MDS может быть которые спасаютжизньпритрансплантации WT мышей с использованием костного мозга от NHD13 мышей, ТГСК, характеризуется пернициозной анемии, лейкопения, нейтропения и морфологических доказательств дисплазии15. Кроме того конкурентоспособные заселение анализов определены преимущества роста клеток из костного мозга NHD13 MDS. Взятые вм...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У нас есть ничего не разглашать.

Благодарности

Эта работа была поддержана интрамуральных программа исследований Национального института рака, национальные институты здравоохранения (Грант 010378 SC Зия и до н.э. 010983).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
14 мл трубки с круглым дномFalcon352057
сбалансированный раствор соли ХэнкаLonza10-527F
Anti-CD45.2 антителоSouthern Biotech1800-15LOT# A077-T044O
3 мл шприцMonoject8881513934
игла 27-G BD305109
игла 20-G BD
Lineage CocktailMiltenyi130-090-858LOT# 5170418221
Антитела к биотинуMiltenyi130-113-288LOT# 5171109046
1 мл ШприцExcelint26027Инсулиновый шприц
Нагревательная лампаThermo Fisher ScientificE70001901
FACS машинаCytecFACScan2 лазеры, 5 цветовых детекторов
FACS сортировочный приборBeckman CoulterMOFLO ASTRIOS5 лазеров, 23 параметра, 6 популяционных сортировок одновременно
Пропидий ЙодидThermo Fisher ScientificP3566
Гамма-облучательTheratronicsGammacell 40
Пробирка для сбора кровиRAM scientific76011
Recipient мышиCharles RiverB6-LY5.1/Cr, CD45.1
NUP98-HOXD13 мышиn/aC57Bl/6, CD45.2Colony содержались в NIH
5 мл круглодонная трубкаFalcon352058
305176 Best

Ссылки

  1. Corey, S. J., et al. Myelodysplastic syndromes: the complexity of stem-cell diseases. Nature Reviews Cancer. 7 (2), 118-129 (2007).
  2. Garcia-Manero, G. Myelodysplastic syndromes: 2015 Update on diagnosis, risk-stratification and management. American Journal of Hematology. 90 (9), 831-841 (2015).
  3. Heaney, M. L., Golde, D. W. Myelodysplasia. The New England Journal of Medicine. 340 (21), 1649-1660 (1999).
  4. Nimer, S. D. Myelodysplastic syndromes. Blood. 111 (10), 4841-4851 (2008).
  5. Aul, C., Giagounidis, A., Germing, U. Epidemiological features of myelodysplastic syndromes: results from regional cancer surveys and hospital-based statistics. International Journal of Hematology. 73 (4), 405-410 (2001).
  6. Pedersen-Bjergaard, J., Christiansen, D. H., Desta, F., Andersen, M. K. Alternative genetic pathways and cooperating genetic abnormalities in the pathogenesis of therapy-related myelodysplasia and acute myeloid leukemia. Leukemia. 20 (11), 1943-1949 (2006).
  7. Uy, G. L., et al. Dynamic changes in the clonal structure of MDS and AML in response to epigenetic therapy. Leukemia. 31 (4), 872-881 (2017).
  8. Gough, S. M., Slape, C. I., Aplan, P. D. NUP98 gene fusions and hematopoietic malignancies: common themes and new biologic insights. Blood. 118 (24), 6247-6257 (2011).
  9. Lin, Y. W., Slape, C., Zhang, Z., Aplan, P. D. NUP98-HOXD13 transgenic mice develop a highly penetrant, severe myelodysplastic syndrome that progresses to acute leukemia. Blood. 106 (1), 287-295 (2005).
  10. Block, M., Jacobson, L. O., Bethard, W. F. Preleukemic acute human leukemia. Journal of the American Medical Association. 152 (11), 1018-1028 (1953).
  11. Thanopoulou, E., et al. Engraftment of NOD/SCID-beta2 microglobulin null mice with multilineage neoplastic cells from patients with myelodysplastic syndrome. Blood. 103 (11), 4285-4293 (2004).
  12. Kerbauy, D. M., Lesnikov, V., Torok-Storb, B., Bryant, E., Deeg, H. J. Engraftment of distinct clonal MDS-derived hematopoietic precursors in NOD/SCID-beta2-microglobulin-deficient mice after intramedullary transplantation of hematopoietic and stromal cells. Blood. 104 (7), 2202-2203 (2004).
  13. Benito, A. I., et al. NOD/SCID mice transplanted with marrow from patients with myelodysplastic syndrome (MDS) show long-term propagation of normal but not clonal human precursors. Leukemia Research. 27 (5), 425-436 (2003).
  14. Medyouf, H., et al. Myelodysplastic cells in patients reprogram mesenchymal stromal cells to establish a transplantable stem cell niche disease unit. Cell Stem Cell. 14 (6), 824-837 (2014).
  15. Chung, Y. J., Choi, C. W., Slape, C., Fry, T., Aplan, P. D. Transplantation of a myelodysplastic syndrome by a long-term repopulating hematopoietic cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (37), 14088-14093 (2008).
  16. Pietras, E. M., et al. Functionally Distinct Subsets of Lineage-Biased Multipotent Progenitors Control Blood Production in Normal and Regenerative Conditions. Cell Stem Cell. 17 (1), 35-46 (2015).
  17. Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab Animal. 40 (5), 155-160 (2011).
  18. Chung, Y. J., Fry, T. J., Aplan, P. D. Myeloablative hematopoietic stem cell transplantation improves survival but is not curative in a pre-clinical model of myelodysplastic syndrome. PLoS One. 12 (9), e0185219(2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

CD45 2lineage
Использование трансплантации гемопоэтических стволовых клеток для оценки происхождения миелодиспластический синдром
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.