Использование трансплантации гемопоэтических стволовых клеток для оценки происхождения миелодиспластический синдром

Миелодиспластические синдромы (MDS) представляют собой разнообразный набор клоновых крови расстройства характеризуются неэффективным кроветворения, морфологических доказательств дисплазии и склонность для преобразования острый миелоидный лейкоз (ОМЛ)^{1,2 ,3,4}. Неэффективные кроветворения признан созревания арест в костный мозг и результаты в периферической крови цитопении несмотря на костный мозг hypercellular^1,3. Распространенность MDS различно оценивается как 2-12 случаев на 100 000 человек ежегодно в Соединенных Штатах, и заболеваемость MDS увеличивается с возрастом, что является важным условием, чтобы понять с учетом старения населения США^{3, 5}. Хотя в большинстве случаев MDS имеют без четких этиологии, некоторых случаях MDS считается вследствие воздействия известных генотоксичным агентам, включая растворители например, бензол и химиотерапии рака⁶.

MDS пациентов обычно приобрели мутаций в клетках MDS⁷. Хотя сравнительно редко, число больных MDS приобрели сбалансированного хромосомные транслокации, с участием генов, например, NUP98, EVI1, RUNX1 и МРОТ (http://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman). Наша лаборатория имеет давнюю заинтересованность в транслокации хромосом, которые включают гена NUP98⁸. Трансгенных мышей, что Экспресс, NUP98-HOXD13 (NHD13) трансген регулируется Vav1 промоутер и усилитель элементы отображения всех ключевых особенностей MDS, включая периферической крови цитопении, морфологических доказательств дисплазии, и преобразование к бод⁹ .

Хотя MDS были признаны за более чем 60 лет¹⁰и считаются расстройство клоновых стволовых клеток, усилия привить клеток человека MDS иммунодефицитных мышей были во многом неудачными, потому что клетки MDS угодный плохо^{11, 12,13,14} и мышей не развиваются клинические заболевания. В попытке определить, какие кроветворные клетки могут передавать MDS, мы обратились к NHD13 модели и показал, что мы могли привить MDS как болезнь субъект, который показал все кардинальные особенности человека MDS, в том числе периферической крови цитопении, дисплазии, и преобразование к бод¹⁵. В настоящем докладе мы представляем технические детали этих экспериментов, а также подходы к дальнейшей фракционировать гемопоэтических стволовых и клеток-предшественников (HSPC), в целях выявления MDS-инициирование клетки.

Животных процедуры, описанные в этой статье были утверждены в национальном институте рака в Bethesda животное уход и использование Комитета и соответствуют политики, содержащихся в политике службы общественного здравоохранения на гуманного ухода и использования лабораторных животных, Закон о защите животных и руководство для ухода и использования лабораторных животных.

1. Подготовка клетки

1. Заготовка ядерных клеток костного мозга (BMNC)
   1. Используйте только стерильные материалы. Стерилизуйте повторно используемых инструментов, с помощью паровой автоклав. Покупка, иглы, шприцы и пластиковая посуда в одноразовых стерильных контейнеров. Выполните все манипуляции животного и клетки в класс II, типа A2 биологической безопасности кабинета.
   2. Подготовка BMNCs в 14 мл круглая труба внизу, содержащие 3 мл HF2 (Хэнк сбалансированный дополнена плода бычьим сывороточным 2% раствор соли).
   3. Усыпить C57Bl6 доноров мышей (положительное для CD45 аллеля CD45.2), возраст обычно 2-6 месяцев, используя камеру CO₂ .
   4. Стерилизуйте мыши туши путем распыления на 70% спирте по всему телу с спрей бутылку. Очистите кожу от ноги, от таза до лодыжки.
   5. Удалите из каркаса, используя стерильные ножницы (прямой, острый/Шарп, 11,5 см) и щипцы (Грефе, зубчатые, ширина 0,8 мм кончик) бедра и голени. Трим прилагаемый мышцы ясно.
   6. Вырежьте проксимальных и дистальных концов голени с ножницами. Проведение голени с щипцами, вставьте шприц 3 мл 27-калибруйте содержащие 2,5 мл HF2 в полость большеберцовых костного мозга на дистальном конце голени (голеностоп). Промойте клетки костного мозга от голени с использованием мягкое давление в 14 мл круглая труба внизу.
      1. Повторите для других голени.
   7. Вырежьте проксимальном и дистальном концы бедренной кости с ножницами. Скрытой полости костного мозга бедренной кости, вставив 20-иглы придает шприц 3 мл содержащие 2,5 мл HF2 в дистальный конец бедренной кости полости костного мозга и применяя мягкое давление шприца.
      1. Повторите для других бедренной кости, собирая все костного мозга от обоих голени и бедра в том же 14 мл круглая труба внизу.
   8. Разогнать массы мозга, аспирационных вверх и вниз несколько раз с той же иглой 20-го калибра, придает шприц 3 мл.
2. Пятнать антитела от BMNC
   1. Всего BMNC. Добавьте 20 мкл раствора уксусной кислоты 3% 20 мкл суспензии BMNC, созданного на шаге 1.1.8. Затем рассчитывать, с помощью инвертированного микроскопа и Горяева.
   2. Пелле BMNC нежный центрифугированием при 450 g x 5 мин при 4 ° C. Ресуспензируйте лепешка с HF2 с использованием 90 мкл на 10⁷ клеток и 10 мкл антител анти линии биотинилированным коктейль для суспензии клеток.
   3. После инкубации в течение 20 минут при температуре 4 ° C, мойте окрашенных клеток с 3 мл физиологического раствора фосфатного буфера (PBS).
   4. Ресуспензируйте BMNC с 100 мкл HF2 за 10⁷ клеток. Добавьте 2 мкл аллофикоцианин (APC) конъюгированных антитела анти биотина для суспензии клеток, следуют инкубации на 4 ° C в течение 20 мин.
   5. Промойте окрашенных BMNC с 3 мл PBS и Ресуспензируйте BMNC с HF2 с 0,2 мкг/мл пропидий йодидом (PI) для сортировки клеток цитометрии потока.
3. Поток цитометрии сортировки клеток от BMNC
   1. Калибровка потока цитометрии клеток сортировщик. Оптимизировать все фотоэлектронный умножитель трубы (PMT), скаттер и флуоресценции параметров неокрашенных клетки и установить в пределах диапазона линейной каждого детектора.
   2. Подготовить безупречная, PI-витражи, и APC помечены линии коктейль клетки параллельно с шагом 1,2. Анализировать спектральные компенсации.
   3. Дискриминацию Дуплет клетки путем последовательного стробирования FSC-H против SSC-H, 640-SSC-A против 640-SSC-H и 640-SSC-S против 640-SSC-W.
   4. Исключите нежизнеспособных клеток с использованием PI возбужденных в 561 Нм и выбросах, собранные с ВЧ фильтром 614/20 группы. Возбуждают линии APC, помечены клетки на 640 нм и собирать выбросов с ВЧ фильтром 671/30 группы.
   5. Запись значения флуоресценции как высота напряжения и собрать по меньшей мере 100 000 событий в список файлов данных режим визуализации населения должен быть отсортирован.
   6. Вычисления спектральной компенсации после приобретения трех образцов 10 000 ячеек для следующего: без маркировки клетки, PI, помечены клетки и антитела анти линии коктейль с APC, помечены клетки.
   7. Установка трех регионов для сортировки Lineage отрицательные (LN), Lineage положительный (LP) с тусклым флуоресценции интенсивности (LP1) и LP населения с яркими флуоресценции (LP2) в 5 мл пробирки, содержащие 0,5 мл 10% FBS средств массовой информации.
   8. Сортировка клеток с помощью одной капли конверт и очистить режим прерывания.
   9. Выполните анализ рода пост с 1000 всего клетки на каждого отсортированного образца для подтверждения чистоты и жизнеспособность сортировки клеток.
   10. Собирать отсортированных клетки центрифугированием при 450 g x 5 минут при температуре 4 ° C и Ресуспензируйте Пелле клеток с 0,5 мл HF2.
   11. Подтвердите сортировки клеток с Горяева и Трипановый синий. Настройка количества клеток с HF2 для трансплантации.
       Примечание: Широкий спектр BMNC населения могут быть изолированы для трансплантации, используя дополнительные комбинации флюрохром конъюгированных антител в шаге 1.2.2 выше.

2. получателей мышей подготовка и трансплантация гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК)

1. Подготовка получателей для трансплантации
   1. Поддерживать, ветеринарии и животноводства ухода за congenic получателя мышей (B6-LY5.1/Cr, CD45.1) в объекте бесплатно (SPF) конкретного патогена животного.
   2. Для профилактическое обеззараживание желудочно-трек предоставляют стерильной водой, содержащий 100 мг/Л ципрофлоксацин получателям за 7 дней до летальной дозы (9 гр) облучения и поддерживать в течение 14 дней после облучения.
   3. Гласят летальной дозы (9 гр) облучение от источника Cs. Используйте оператор квалифицированных, сертифицированных Cs. Установите инструмент источника Cs доставить гамма облучение 70 СГР/мин всего тела. Место 10 мышей в специально держателя и вставьте держатель в зале облучателя. Доставить 9 гр тотальное облучение тела в 13 мин и вернуть их клетки мышей.
2. Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток
   1. Смесь дикого типа (WT) BMNC от congenic получателя мыши (B6-LY5.1/Cr, CD45.1) в дозе ячейки 2 x 10⁵ клеток на мышь с 2 до 5 x 10⁴ клетки очищенный теста, который подготовил BMNC с потока цитометрии сортировки как описано в разделе 1.3 выше. Смешайте клетки в том же шприц.
      Примечание: WT BMNC предоставляют Спаринг эффект радиации получателя мыши и позволяют для выживания получателя мыши, если тест клетки не поддерживают кроветворения. WT-BMNC используется в этом типе эксперимента Экспресс аллеля CD45.1 и таким образом можно отличить от Испытание клеток с использованием антител, устанавливающих дискриминацию между CD45.1 и CD45.2. WT-BM клетки называются «вспомогательные клетки», «излучения щадящие клетки» или «конкурент клетки».
   2. Отрегулируйте громкость смесь клеток до 200 мкл каждого получателя с помощью стерильных HF2 для содействия инъекции.
   3. Трансплантации клеток смеси для смертельно облученного получателей мышей через внутривенное хвост инъекции Вену с помощью 1 мл шприц и игла 28-го калибра, в течение 24 часов облучения. Место мыши хвост под тепла лампы, как тепла приводит к хвост дилатация вен.
      Примечание: Усыпить всех получателей мышей в конце исследования и оценивать развитие болезни, патанатомия, гистология и проточной цитометрии.

3. приживления Assay, используя поток цитометрии

1. Для оценки доноров клеток приживления, соберите периферической крови (PB) от получателя мышей на 6-й недели, 12-й недели и 16-й недели после пересадки.
2. Теплый получателей в клетке с тепла лампы около 1 мин и поместите мышь на фиксатор.
3. Cut хвост вен с помощью скальпеля (лезвия 10, #3 скальпель ручки) и собирать 100 мкл PB каждого получателя, используя микрокапиллярной трубка, содержащая ЭДТА как антикоагулянт.
4. Разделите собранные PB на два равных аликвоты, поместив 50 мкл в стерильных microcentrifuge трубку. Использовать один Алиготе для автоматизированный анализ крови (CBC) (выполнена на основные гистопатология NCI) и использовать второй Алиготе для пятнать антитела и проточная цитометрия.
5. Чтобы обнаружить доноров приживления подачей cytometry, лизируют эритроцитов (РБК), добавив 1 мл буфера lysis гипотонический РБК (8.29 г/Л NH₄Cl, 1 г/Л KHCO₃, 0,037 г/Л Na₂ЭДТА, рН 7,2) 50 мкл собранных PB. Вихрь образец, чтобы смешивать и инкубировать 10 мин при комнатной температуре.
6. Центрифуга лизированных PB в 4600 x g 1,5 мин тщательно удалить супернатант и отбросить.
7. Частично нарушить клетки Пелле, осторожно нажав или «стряхивая» в нижней части трубки. Добавьте 1,3 мл PBS в гранулы расположен в трубку и центрифуги на 4600 x g 1,5 мин тщательно аспирата и удалить супернатант.
8. Нарушить Пелле ячейку, нажав или щелкая и 200 мкл HF2 с 5% крыс сыворотка Пелле ячейки.
9. Добавьте анти CD45.2 антител (в 1 мкл) с аллофикоцианин (APC) к суспензии клеток. Инкубируйте на 4 ° C для по крайней мере 30 минут и кратко вихревой смеси.
10. После окрашивания, вымыть клетки дважды, как описано выше и Ресуспензируйте с 400 мкл HF2 с 1 мкг/мл Пи.
11. Обнаружение с помощью 4-цветный проточный цитометр приживления. Получить дополнительную информацию о типах клеток в периферической крови, добавив дополнительные антитела для выявления конкретных клеток типы, такие как B или T лимфоциты.
12. Запись данных последовательных приживления с помощью распространения листа для дальнейшего анализа данных.

Мы показываем представительных цифры для результаты нескольких экспериментов. Рисунок 1 показывает представитель проточной цитометрии, сортировка эксперимент. Во время нормального кроветворения дифференциации как клетки становятся приверженность конкретным гемопоэтических линии, они приобретают определение линии клеток поверхностных маркеров и потерять возможность самообновления. Таким образом в мышах одичал типа, стволовых клеток самообновлению ограничивается BMNC родословную отрицательные. В этом эксперименте мы рассортированы по BMNC из костного мозга NHD13 линии отрицательные, низкой линии позитивные и высокой линии положительных клеток. Эти сортировать клетки затем были пересажены в WT получателей для определения способности самообновления.

Рисунок 2 показывает результаты из отдельной эксперимент, в котором линии отрицательные клетки или несортированные клеток от NHD13 доноров с MDS были пересажены в смертельно облученного WT получателей. NHD13 клеток донора выразил CD45.2 клеток поверхности маркер, тогда как ячейки конкурента WT (см. раздел 2.2.1 выше) выразил CD45.1 клеток поверхности маркер. Рисунок 3 показывает серийный приживления анализ несортированные NHD13 BMNC, или линии отрицательных NHD13 BMNC. После примерно 16 недель NHD13 клетки переиграть WT клетки, как показано увеличение доли CD45.2 + клеток в периферической крови. На рисунке 4 показан пример лейкозных трансформации от мыши, пересаженные с NHD13 MDS клеток.

Рисунок 1: проточной цитометрии сортировки стратегия BMNC окрашенных с родословной антитела коктейль. Каждый прямоугольник на участке точка представляет популяции клеток, сортируются для ТГСК для оценки функции клеток. R4, линии отрицательных; R5, низкой линии положительный; R6, высокой линии положительный. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2: представитель СУИМ профили для приживления assay с помощью доноров конкретные антитела анти CD45.2. BMNC получатель был пересажен с 1 X 10-6 NHD13 BMNC (CD45.2 +) и LNBM получателя с 5 Х 104 NHD13 линии отрицательных BM клеток (CD45.2 +). В каждом случае 2 x 105 WT BMNC (CD45.1 +) использовались как ячейки конкурента. Номера в верхней и нижней коробки представляют CD45.2 положительную (производный от доноров NHD13) и CD45.2 отрицательные (производный от ячейки конкурента WT), соответственно, в период после трансплантации 6 и 24 неделе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3: кинетика приживления отдельных получателей после трансплантации. Каждая линия на графике показывает серийный приживления анализы отдельных получателей мыши. BMNC получателей были пересажены с 1 X 106 клеток NHD13 весь BMNC, и LNBM получателей были пересажены с 5 X 104 NHD13 линии отрицательных БМ после сортировки. NHD указывает NHD13 доноров. BM, BMNC получателей мышей; LNBM, линии отрицательных BM получателя; КСДОР, mononucleated клеток периферической крови. Во всех случаях клеток донора NHD13 постепенно переиграть WT клетки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4: Май-Grünwald Гимзы (МГГ) пятная костного мозга (БМ) от получателя MDS, который перешел к бод. Обратите внимание на наличие многочисленных взрывов и незрелых форм. Стрелки указывают взрывов, и стрелки указывают незрелых форм. Оригинальные 400 X. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

У нас есть ничего не разглашать.