Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Проксимальный культуры метод для изучения паракринными сигнализации между ячейками

9.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/58144

⸱

28 августа 2018 г.

 ,  ,  ,  , 
1Indiana University School of Medicine, 2Urology, Indiana University Health Southern Indiana Physicians, 3Indiana University Melvin and Bren Simon Cancer Center, 4Department of Medical and Molecular Genetics, Indiana University School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Паракринными и juxtacrine клеточных взаимодействия играют важную роль во многих биологических процессах, включая прогрессии опухоли, иммунные реакции, ангиогенез и развития. Здесь метод проксимального отдела культуры используется для изучения паракринными сигнализации, где поддерживается локализованные концентрации факторов выделяется допуская прямого контакта клеточных.

Аннотация

Межклеточных взаимодействий играют важную роль во многих биологических процессах, включая прогрессии опухоли, иммунные реакции, ангиогенез и развития. Паракринными или juxtacrine сигнализации опосредует такого взаимодействия. Использование условных среднего и coculture исследования являются наиболее распространенными методами для выявления различий между этими двумя типами взаимодействий. Однако эффект локализованные высокие концентрации факторов выделяется в микроокружения во время взаимодействия паракринными точно не изъятый с кондиционерами средой и, таким образом, может привести к неточным выводам. Чтобы преодолеть эту проблему, мы разработали метод проксимального отдела культуры для изучения паракринными сигнализации. Типы клеток двух выращиваются на любой поверхности 10 мкм толстые поликарбонатные мембраны с порами 0,4 мкм. Поры позволяют обмена выделяется факторов и, в то же время, препятствует juxtacrine сигнализации. Клетки могут быть собраны и анализироваться в конечной точке для определения последствий паракринными сигнализации. Помимо возможности для локализованных градиенты концентрации секретируемые факторов, этот метод является поддаются эксперименты с длительной культуры, а также использование ингибиторов. Хотя мы используем этот метод для изучения взаимодействия между клетки рака яичников и мезотелиальной клетки, которыми они сталкиваются на сайте метастазов, она может быть адаптирована для любых двух типов адэрентных клеток для исследователей для изучения паракринными сигналов в различных областях, включая микроокружения опухоли, иммунологии и развития.

Введение

Роль продуктивных взаимные взаимодействий между раковые клетки и микроокружения опухоли в прогрессии опухоли хорошо создан и стал одним из основных направлений исследований в биологии рака1. Подобные случаи двунаправленный сигнализации важны во время заживления, иммунные реакции, ангиогенез, ниши стволовых клеток и развития2,3,4,5,6 , 7 , 8. общей темой во всех этих биологических процессах является, что клетки реагируют в различных способов внеклеточные сигналы от их микроокружения которые определяют судьбу клеток, тканей физиологии и прогрессирования заболевания. Таким образом основное внимание чаще превратилась в сторону лучшего понимания механизмов, участвующих в таких сообщениях ячеек. Большинство таких взаимодействий связаны паракринными или juxtacrine сигнализации между ячейками. Паракринными сигнализации включает секрецию специфических сигнальных факторов на одну ячейку, которые воспринимаются соответствующими рецепторами на другую ячейку в близости, вызывает ответ в нем9,10, тогда как juxtacrine сигнализации требует прямого контакта между клеточных компонентов две клетки участвуют11,12.

Такая сигнализация является ключевым компонентом в ткани гомеостаза, а также в микроокружения опухоли. Раковые клетки выгоду от паракринными и juxtacrine факторов от клеток в опухоли стромы, включая рак связанные фибробластов (CAFs), иммунные клетки и адипоцитов13,14,,1516. Паракринными сигнализации может быть опосредовано факторы роста, цитокины, chemokines, и т.д., в то время как juxtacrine сигнализации включает совмещенных лигандов и рецепторов в паз сигнализации, или взаимодействия между интегринов и их соответствующих белков внеклеточного матрикса. Мы продемонстрировали важность взаимного взаимодействия клетки рака яичников и CAFs в прогрессии и метастазированием опухоли14. Аналогичным образом взаимодействия метастазирующих клеток рака яичников с мезотелиальной клетки, охватывающих сайта метастазов регулировать ключевые микроРНК и факторы транскрипции в раковых клетках, которые способствуют метастатического колонизации17, 18.

Большинство исследований о сигнализации паракринными предполагают использование собранных из одной ячейки типа для лечения второй тип ячейки с кондиционером среды. Хотя такой подход широко использовался, он не эффективно реплицировать локализованные уровни высокой концентрации секретируемые фактора в микроокружения принимающей ячейки. Он также не удается воспроизвести кинетика непрерывного потока выделяется фактор, производится на одну ячейку и получил в соседней ячейке. Паракринными сигнализации является эффективным на коротких расстояниях, секретируемые факторов на необходимые концентрации только вблизи исходной ячейки и как правило диффузный и разбавлять как увеличивается расстояние. Этот локализованных высокая концентрация выделяется фактор необходимо вызвать ответ в рецепторов клеток. Кроме того в клетках получателя зависит ответ также баланс вновь выделяется факторов и их постоянное истощение деградации, привязки и интернализации в получателя клетки и диффузии от исходной ячейки. Кондиционерами носитель может быть сосредоточено на счет для более высокие концентрации локализованных в микроокружения, но это точно не может реплицировать точные концентрации. Кроме того он не может имитировать естественный кинетика производства и истощение фактором, связанным. Для более точно реплицировать паракринными сигнализации и отделить его от juxtacrine, сигнальные механизмы, мы разработали метод Роман проксимального отдела культуры, который предусматривает выращивание типы двух клеток на любой поверхности пористые мембраны. Поры достаточно малы, чтобы предотвратить juxtacrine взаимодействия и еще разрешить обмен секретируемые факторов на локализованные высокие концентрации. Таким образом эта система сохраняет кинетика производства и истощение паракринными факторов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Протокол следует принципам институционального регулирования Совет из университета Индианы.

1. Подготовка клетки

  1. Изоляции и культуры первичной mesothelial клеток человека
    1. Изолировать первичной мезотелиальной клетки человека (HPMCs) от человека сальника, как описано ранее,17,18 и вырастить их в полный рост средних [Дульбекко изменение Eagle среднего (DMEM), содержащий плода бычьим сывороточным 10%, 1% пенициллин стрептомицином, 1% несущественные аминокислот и витаминов, 1%] при 37 ° C и 5% CO2.
      Примечание: Обычно HPMCs выращивают до 100% слияния (рис. 1A).
  2. Условия роста клеток рака яичников
    1. Рост клетки рака яичников HeyA8 в полный рост среднего при 37 ° C и 5% CO2.
      Примечание: Использование HeyA8 клетки выросли примерно 80% слияния (Рисунок 1B).

2. клеточная культура

  1. Настройка проксимального отдела культуры
    1. Использование Transwell вкладыши для 6-ну пластин с 10 мкм толстые ткани Культура лечение поликарбоната мембраны 0,4 мкм поры (108 поры/см2) и зона роста 4.67 см2 . При необходимости, оптимизируйте для вставки различных размеров, масштабировании количество клеток, отобранный по площади поверхности роста. Теплый полный рост среднего, трипсина и фосфат амортизированное saline (PBS) до 37 ° C перед использованием.
  2. Подготовка операции вставки
    1. Заполнение HeyA8 клеток на нижней поверхности мембраны insert, извлеките вставки из упаковки с помощью стерильный пинцет и поместите его перевернутый в стерильных 15 см культуры блюдо.
    2. Используйте 15 см блюдо, как она имеет глубину размещения Перевернутый вставки, или заменить его с любой соответствующей стерильный контейнер. В зависимости от эксперимента место необходимое количество вставок в 15 см блюдо.
    3. Три элемента управления и три экспериментальных условиях Label соответственно с маркером на краю вставок.
  3. Подготовка раковые клетки
    1. Trypsinize HeyA8 клетки, вырос на 80% слияния в колбу 25 см2 (~ 2 x 106 клеток), добавить 1 мл трипсина (0,25%) для 40-60 s и нейтрализовать трипсина с 6 мл средство полного роста.
    2. Центрифуга клетки на 500 x g при комнатной температуре (RT) 3 мин, удалить супернатант и Ресуспензируйте Пелле клеток в 5 мл средство полного роста. Количество живых клеток, с помощью метода исключение Трипановый синий краситель.
  4. Заполнение раковые клетки
    1. Приостановите 100000 клеток/мл живых клеток HeyA8 в полный рост среднего. Тщательно семян 80000 HeyA8 клетки приостановлено в 800 мкл среднего полного роста в нижней части пластины (который в настоящее время сталкивается вверх, так как он является инвертированным).
    2. Заполнить клетки образуют купол образную форму, поэтому клетки остаются на пластины (рис. 1 c). Начните с центра мембраны и двигаться наружу в концентрические круги пока медленно закупорить. Избегайте происходит более чем на 3 мм от края, чтобы предотвратить любой разлив среды.
      Примечание: Количество клеток посеян будет зависеть от темпов роста клеток и продолжительность эксперимента. Количество клеток HeyA8, отобранный для этой проксимального отдела культуры были оптимизированы и клетки будет 80 – 90% притока в конце третьего дня.
  5. Рак клеток вложений
    1. Обложка блюдо 15 см и тщательно перемещать блюдо, содержащий вставки для CO2 инкубатора. Важно, чтобы не нарушить падение среднего и клеток на вкладыше на этот шаг. Оставьте клетки при 37 ° C для 4 h позволяют раковым клеткам, чтобы прикрепить к вставка.
  6. Подготовка мезотелиальной клетки
    1. После около 4 ч trypsinize HPMCs, выросли на 100% слияния в колбе2 75 см (~ 4 х 106 клеток) с 2 мл трипсина (0,25%), за 1 – 2 мин и нейтрализовать трипсина с 12 мл средство полного роста.
    2. Центрифуга клетки на 500 x g на RT на 3 мин, Ресуспензируйте Пелле клеток в 10 мл полный рост средних и количество живых клеток, с помощью метода исключение Трипановый синий краситель.
  7. Заполнение мезотелиальной клетки
    1. Приостановите 300 000 клеток/мл живой HPMCs в полный рост среднего. Добавьте 2,5 мл свежего полный рост средств массовой информации в каждой скважине 6-ну плиты. Тщательно принести блюдо 15 см, содержащие вставок, капот биобезопасности. С помощью стерильный пинцет, флип вставки и поместите его в хорошо пластину 6-хорошо, так что это вертикально, с HeyA8 клетками, на нижней поверхности, погруженный в полный рост среднего (рис. 1 c).
    2. HPMCs семя 450000 приостановлено в 1,5 мл среднего роста внутри вставок с HeyA8 клеток, придает поверхности, обращенной в нижней части скважины (рис. 1 c) или вставки без каких-либо HeyA8 клетки для контроля по Карбопола. Элементы управления HeyA8 добавьте 1,5 мл среднего роста без клетки.
  8. Выращивание проксимального отдела культуры
    1. Пусть проксимального отдела культуры растут в инкубаторе CO2 при 37 ° C и 5% CO2 за 72 ч. При необходимости, носитель может быть пополнен следующим образом.
      1. Для внутри insert удалите 750 мкл и 750 мкл свежие полный рост среднего.
      2. Для внешней вставки (6-ну плита) удалите 1 мл и добавьте 1 mL свежих полный рост средних. 1 мл был выбран для удобства изменения среднего за один шаг. При желании, 1,25 мл могут быть удалены и заменены вместо.
  9. Сбор клетки
    1. Соберите клетки после 72 ч проксимального отдела культуры. Обратите особое внимание на этот шаг, чтобы не допустить перекрестного заражения клеток HeyA8 и HPMCs. Trypsinize клетки, центрифуга их и лизируют Пелле вместо лизировать клетки на мембраны для предотвращения перекрестного загрязнения.
  10. Trypsinizing клетки
    1. Промывайте обе стороны пластины с ПБС.
    2. Переложите вставки новой скважины и добавьте трипсина. Добавить 0,5 мл трипсина внутри insert и добавить 2 мл трипсина в пластину 6-хорошо для trypsinize раковые клетки, на нижней поверхности пластины. Инкубировать пластину для 2 минут при 37 ° C.
  11. Нейтрализация трипсина
    1. Добавьте 1 mL средство полного роста внутри insert нейтрализовать трипсина, Пипетка вверх и вниз и затем принять клетки и передавать их на обозначенные трубки. Добавьте еще 2 мл полный рост средних для полной нейтрализации. Следует позаботиться о том, чтобы не проколоть мембраны при дозирование для предотвращения перекрестного инфицирования клеток.
    2. Чтобы собрать клетки в нижней части пластины, Пипетка 2 мл трипсина, которая была добавлена в шаге 12.2 на нижней поверхности 2-3 x так, что клетки попадают в нижней части пластины 6-хорошо. Нейтрализовать трипсина в нижней части пластины с 6 мл среднего роста и передавать содержимое плиты обозначенные трубки.
  12. Сбор и лизировать клетки
    1. Центрифуга клетки на 500 x g 3 мин и аспирационная средств массовой информации. Ресуспензируйте и лизировать клетки окатышей с 0,7 мл фенола и гуанидина тиоцианат-на основе - лизис реагента для извлечения РНК. Изолируйте РНК, используя любой подходящий комплект.

3. Количественная реального времени полимеразная цепная реакция

Примечание: Следующие шаги описывают количественную реального времени полимеразной цепной реакции (ПЦР) для изучения изменения выражения гена в результате проксимального отдела культуры.

  1. Подготовьте cDNA от образцов РНК для ПЦР. Используйте любой подходящий обратной транскриптазы с соответствующего буфера и случайных праймеров для обеспечения обратной транскрипции всех мРНК (см. Таблицу материалы).
  2. Оценить изменения в уровнях выражения мРНК фибронектина (FN1) и E-Кадгерины (CDH1) и превратить фактор роста бета-1 (TGFβ1), ПЦР с Глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа (GAPDH) как внутреннего контроля. Вполне возможно, для использования стандартизированных коммерчески доступных ген выражение анализов (см. Таблицу материалов) или дизайн праймеров.
  3. Сравните HeyA8 клетки, выращенных в проксимальном культуры с HPMCs с элементами управления, HeyA8 и HPMCs, выращенных в проксимальном культуры с управления по Карбопола.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Метастазирующих клеток рака яичников сталкиваются мезотелиальной клетки на сайте метастазов в брюшной полости19. Продуктивного взаимодействия паракринными и juxtacrine с помощью мезотелиальной клетки в стимулировании адаптивных реакций в клетках рака яичников, позволяющие успешно метастазов17,18,20,21 . Чтобы проверить эффективность метод...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Понимание механизма паракринными и juxtacrine сигнализации между ячейками имеет важное значение для улучшения знаний о нормальной ткани гомеостаза и болезней условия7,8. Большинство паракринными сигнализации что исследования проводятся путем сбора обусловлено среднего из одной ячейки типа и использовать его для лечения другой тип клеток. Этот метод имеет преимущество в простоте присущие. Однако она не пилки точно локализованные концентрации факторов выделяется в ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Мы в долгу перед пациентов за их участие в коллекции тканей для этих экспериментов. DoD OCRP яичников Рак Оскар (W81XWH-15-0253) и экспериментального награда от Коллин 's Dream Foundation Anirban K. Mitra поддержали это исследование.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
24 мм Проницаемая крепь Transwell с 0,4 & микро; m Вставка из поликарбонатной мембраныдля пор Corning (Costar)3412• 10 &микро; Полупрозрачная поликарбонатная мембрана толщиной m
• Обработан для оптимального прикрепления клеток
и быка; Упаковано по 6 вкладышей в 6-луночный планшет, по 4 пластины в корпусе
и bull; Мембрана должна быть окрашена для видимости клеток
и бык; Стерилизованный гамма-излучением
6-луночный планшетCorning (Falcon)353046Плоский дно, обработанный TC, стерильный, с крышкой
15 см чашка для культурыCorning (Falcon)353025Стерильная, обработанная TC чашка для клеточной культуры
DMEMCorning (Cellgro)10-013-CV
Пенициллин стрептомицинCorning30-002-CI
MEM Заменимая амино кислотыCorning (Cellgro)25-025-CI
MEMВитамины Corning (Cellgro)25-020-CI
0,25% трипсин, 2,21 мМ ЭДТАCorning25-053-CI
Фетальная бычья сывороткаAtlanta BiologicalsS11150
Пипецмарки хорош
CO2 Инкубаторлюбой марки хорош
Уровень биобезопасности II шкафмарки хорош
FN1 TaqMan Анализ экспрессии геновThermoFisher ScientificHs01549976_m1
TGFB1 TaqMan Анализ экспрессии геновThermoFisher ScientificHs00998133_m1
CDH1 TaqMan Анализ экспрессии геновThermoFisher ScientificHs01023895_m1
GAPDH TaqMan Экспрессия генов НаборThermoFisher Scientific
miRNeasyQiagen217004
Набор для обратной транскрипции кДНК с высокой емкостьюThermoFisher Scientific43-688-13
HeyA8 раковые клетки яичниковполучены из лаборатории Эрнста Лендьела, Чикагский
TGFβ Нейтрализующие антителаR& Системы DMAB1835-100
любой любой для выделения мини-РНК Hs99999905_m1 университет

Ссылки

  1. Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
  2. Cupedo, T., Mebius, R. E. Cellular interactions in lymph node development. The Journal of Immunology. 174 (1), 21-25 (2005).
  3. Suvas, S. Role of Substance P Neuropeptide in Inflammation, Wound Healing, and Tissue Homeostasis. The Journal of Immunology. 199 (5), 1543-1552 (2017).
  4. Gnecchi, M., Danieli, P., Malpasso, G., Ciuffreda, M. C. Paracrine Mechanisms of Mesenchymal Stem Cells in Tissue Repair. Methods in Molecular Biology. , 123-146 (2016).
  5. Lionetti, V., Bianchi, G., Recchia, F. A., Ventura, C. Control of autocrine and paracrine myocardial signals: an emerging therapeutic strategy in heart failure. Heart Failure Reviews. 15 (6), 531-542 (2010).
  6. Nicosia, R. F., Zorzi, P., Ligresti, G., Morishita, A., Aplin, A. C. Paracrine regulation of angiogenesis by different cell types in the aorta ring model. International Journal of Developmental Biology. 55 (4-5), 447-453 (2011).
  7. Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. Tackling the cancer stem cells - what challenges do they pose. Nature Reviews Drug Discovery. 13 (7), 497-512 (2014).
  8. Plaks, V., Kong, N., Werb, Z. The cancer stem cell niche: how essential is the niche in regulating stemness of tumor cells. Cell Stem Cell. 16 (3), 225-238 (2015).
  9. Elenbaas, B., Weinberg, R. A. Heterotypic signaling between epithelial tumor cells and fibroblasts in carcinoma formation. Experimental Cell Research. 264 (1), 169-184 (2001).
  10. Wilson, K. J., et al. EGFR ligands exhibit functional differences in models of paracrine and autocrine signaling. Growth Factors. 30 (2), 107-116 (2012).
  11. Kopan, R. Notch signaling. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (10), (2012).
  12. Singh, A. B., Sugimoto, K., Harris, R. C. Juxtacrine activation of epidermal growth factor (EGF) receptor by membrane-anchored heparin-binding EGF-like growth factor protects epithelial cells from anoikis while maintaining an epithelial phenotype. Journal of Biological Chemistry. 282 (45), 32890-32901 (2007).
  13. Swartz, M. A., et al. Tumor microenvironment complexity: emerging roles in cancer therapy. Cancer Research. 72 (10), 2473-2480 (2012).
  14. Mitra, A. K., et al. MicroRNAs reprogram normal fibroblasts into cancer-associated fibroblasts in ovarian cancer. Cancer Discovery. 2 (12), 1100-1108 (2012).
  15. Nieman, K. M., et al. Adipocytes promote ovarian cancer metastasis and provide energy for rapid tumor growth. Nature Medicine. 17 (11), 1498-1503 (2011).
  16. Salimian Rizi, B., et al. Nitric oxide mediates metabolic coupling of omentum-derived adipose stroma to ovarian and endometrial cancer cells. Cancer Research. 75 (2), 456-471 (2015).
  17. Mitra, A. K., et al. Microenvironment-induced downregulation of miR-193b drives ovarian cancer metastasis. Oncogene. 34 (48), 5923-5932 (2015).
  18. Tomar, S., et al. ETS1 induction by the microenvironment promotes ovarian cancer metastasis through focal adhesion kinase. Cancer Letters. 414, 190-204 (2018).
  19. Mitra, A. K. Ovarian Cancer Metastasis: A Unique Mechanism of Dissemination. Tumor Metastasis. Xu, K. , InTechOpen. Available from: https://www.intechopen.com/books/tumor-metastasis/ovarian-cancer-metastasis-a-unique-mechanism-of-dissemination 43-58 (2016).
  20. Iwanicki, M. P., et al. Ovarian cancer spheroids use myosin-generated force to clear the mesothelium. Cancer Discovery. 1 (2), 144-157 (2011).
  21. Kenny, H. A., et al. Mesothelial cells promote early ovarian cancer metastasis through fibronectin secretion. Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4614-4628 (2014).
  22. Boelens, M. C., et al. Exosome transfer from stromal to breast cancer cells regulates therapy resistance pathways. Cell. 159 (3), 499-513 (2014).
  23. Kalluri, R. The biology and function of exosomes in cancer. Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1208-1215 (2016).
  24. Kohlhapp, F. J., Mitra, A. K., Lengyel, E., Peter, M. E. MicroRNAs as mediators and communicators between cancer cells and the tumor microenvironment. Oncogene. 34 (48), 5857-5868 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

1E
Проксимальный культуры метод для изучения паракринными сигнализации между ячейками
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.