Здесь мы опишем простой способ заставить клинически значимых кожи давление язв (PUs) в модели мыши спинного мозга (SCI). Эта модель может использоваться в доклинических исследованиях экран для различных терапии для исцеления гной в SCI больных.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Модель мыши давление язв после травмы спинного мозга
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Давление язвы (PUs) являются общими, изнурительной осложнений травматической спинного мозга (SCI) и, как правило, происходят в мягких тканей вокруг костлявые протуберанцев. Существует однако, мало известно о влиянии SCI на раны кожи исцеление в контексте животных моделей в контролируемых экспериментальных установках. В этом исследовании представлена простая, неинвазивный, воспроизводимые и клинически значимых мыши модель гноя в контексте полного SCI. Взрослых самцов мышей (Balb/c, 10 недель) были бритые и depilated. После депиляции (24 h), мышей были подвергнуты Ламинэктомия следуют полный спинного перерезка (T9-T10 позвонков). Сразу же после этого складку кожи на задней части мышей был отменен и зажатой между двумя магнитные диски, удерживается на месте на следующий 12 h, таким образом создавая ишемические области, которая превратилась в ПУ в последующие дни. Раненых области продемонстрировал отек тканей и эпидермальный исчезновение приложением 3 день после магнит. Гной спонтанно развитых и исцелил. Исцеление, однако, медленнее в SCI мышей по сравнению контролировать-SCI мышей, когда рана была создана ниже уровня наук и наоборот, нет разницы в исцеление был замечен между SCI и управления-SCI мышей, когда рана был создан выше уровня SCI. Эта модель является потенциально полезным инструментом для изучения динамики развития ПУ кожи и заживление после SCI, а также проверить терапевтические подходы, которые могут помочь залечить раны, такие.
Введение
Давление язвы (PUs) являются основными вторичных осложнений травматической SCI1. Гной, локализованные повреждения кожи и подлежащих тканей, которые обычно происходят на костлявые протуберанцев где вес тела сконцентрировано в то время как пациент сидя или лежа1. Это постоянное давление, что приводит к развитию локализованных ишемии, воспаление тканей, механических повреждений и некроз2,3подвергаются кожи, жира и мышц.
Разработка гной зависит от нескольких местных факторов, включая масштабы давления и сдвига, Загрузка продолжительность, влажность кожи и температуры, травмы долголетия и общие кожи гигиены. Существуют также системные факторы, которые играют роль, как общее физическое состояние, кости и мышечной ткани морфологии и прочность4, возраст пациента, гематологические меры, пол и даже социально экономических факторов, включая семейное положение, образование, и доходы4,5.
Профилактики и лечения гной остаются значительные проблемы в SCI больных. SCI пациентов развивается гной в ~ 30-40% случаев, с частотой повторения 60-85%, возможно из-за слабой рубцовой ткани и отсутствие защитных ощущение1. Таким образом часто приводит к повторной госпитализации больных SCI гной и в целом представляют собой существенное финансовое бремя (80% больше против SCI только) в системе здравоохранения5,6,,78,9 , 10.
В меру наших знаний было без исследований в контролируемых экспериментальных настройки для изучения последствий SCI на процесс заживления пу из-за отсутствия подходящих животных моделей. Здесь описан воспроизводимость и клинически значимых мыши модель Пу в коже. Эта модель может быть использована для изучения динамики пу начала и последующего исцеления, а также для проверки потенциальных терапевтических подходов к предотвращению пу или улучшить ПУ, заживление в контексте SCI.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
В соответствии с протоколом, утвержденным Ратгерский университет институциональных животное уход и использование Комитета были исполнены все животные обработки и хирургических процедур. Мышей кормили стандартной диете и воды ad libitum.
1. Подготовка хирургических и нехирургических инструментов
- Стерилизуйте хирургические и нехирургические инструментов в автоклаве.
- Очистить хирургические операционный стол с 70% этанола и теплая грелка до 37 ° C.
- Место грелку на операционном столе и накрыть стерильные хирургические шторы.
Примечание: Во всех процедурах, выживания техника «No Touch» используется здесь для сохранения стерильности.
2. Подготовка животных и выполнение спинного Ламинэктомия Т9 T10
- Закупать взрослых мышей (Balb/c) 10-недельных мужчины. Побудить анестезии в каждое животное, с использованием ингалятора начиная с 5% изофлюрановая, а затем уменьшить до 2-3% для поддержания седативный эффект на оставшуюся процедур.
- Подтвердите полной анестезии, вызывая никакого ответа на хвост/лапы крайнем случае индуцированной Ноцицепция стимуляции.
- Брить волосы на спинку (головы до хвоста), с электрической машинки, а затем применить депиляционный крем (3 мин), чтобы удалить оставшиеся волосы. Наконец мыть спинку с проточной воды/мокрый скраб и вернуть их клетках животных.
Примечание: Это необходимо, чтобы избежать дополнительного раздражения кожи и химического загрязнения в момент ранения кожи - Следующий день, применять глазная мазь для роговицы для защиты глаз от пересыхания во время хирургической процедуры и затем вымыть кожу с 3 альтернативных препаратов Бетадин скраб и 70% этанола.
- С помощью скальпеля выполните разрез (~1.0-1.5 см) вдоль средней линии на спине на уровне позвонков T8-T12.
Примечание: Уровень позвонков определяется вернуться подсчета позвонка от T13 используя расположение плавающие ребра, которые соответствуют T13 позвонка11,12. - Очистите подкожной жировой ткани, чтобы получить доступ к paraspinal мышц и затем вскрыть их медленно подвергать остистых отростков и пластинки с обеих сторон.
Примечание: Сделать эту процедуру очень тщательно, чтобы избежать избыточное кровотечение или любой травмы спинного мозга, на данный момент. - Выполните Ламинэктомия подвергать спинного мозга (T9-T10 позвонков), мягко пилинг от позвоночника пластинки, используя пинцет microdissecting.
Примечание: Выполните ламинэктомии, чтобы избыток спинного подвергается облегчить создание травмы. В группе элементов управления выполняется только Ламинэктомия.
3. выполнение Т9 T10 Полный спинного мозга
- С помощью щипцов, закрепите позвоночнике Т8 и подъем вверх преувеличивать искривлений позвоночника.
- С помощью тонкой ножницы, раздел спинного мозга между T9 и T10 позвонка вплоть до пол позвоночного канала, для обеспечения полной перерезка.
- После наблюдения за полным перерезка под микроскопом хирургические, применение кусок подкожного жира над Ламинэктомия сайт, чтобы предоставить дополнительную защиту спинного мозга до закрытия операции.
- Наконец закройте рану и шовные паравертебральных мышц, поверхностной фасции, с помощью непрерывного шва и кожи с помощью швов клипы12.
- Пост-SCI, наблюдать движение кишечника на следующий день; Однако управлять мочевого пузыря, ручной пузыря эвакуации.
Примечание: Бассо мыши шкала (BMS) может использоваться для контроля за ходом задних конечностей функциональное восстановление пост SCI на 2 день и затем загрузок, см дополнительная цифра 111,12,13.
4. индукция давление язвы кожи после полного SCI
- Сразу же после операции SCI скраб задней части животного с Бетадин и 70% спирта.
- Для пу ниже сайта SCI впрыскивают в спинной кожи возле крестец, очень небольшой объем (10 мкл) 0,125% бупивакаин раствора с помощью иглы 25 G в равноотстоящих места ~0.5-1.0 см друг от друга, в эллипса вокруг магнита приложения узла.
Примечание: Для пу выше сайта SCI придать спинной кожи возле шейки матки региона. - Аккуратно поднимите складку кожи на задней части мыши и бутерброд между 2 магнитные диски (5 × 12 мм в диаметре, 2.4 g, 3800 G магнитные силы) (рис. 1). 11 , 12
- Сразу же после того, как использовать магниты, возвращение животных одной клетки помещаются грелку пока полное сознание не восстановили (рис. 1).
- После 12 h приложения магнит слегка анестезировать животное с изофлюрановая и удалите магниты. Возьмите фотографию раны сайтов, чтобы записать первоначальный внешний вид Пу (день 0 время точка). Закрыть рану пленкой прозрачной Туалетная (3M) во избежание высыхания или загрязнения.
5. послеоперационный уход за животными, эвтаназия и коллекции тканей для гистологии
- Сразу после операции придать животное с 1 мл 0,9% физиологического раствора подкожно для гидратации.
- Подкожно, сразу придать бупренорфин SR (1 мг/кг) для обезболивания.
- Вводить подкожно животных ежедневно мелоксикам (1 мг/кг) и содержит цефазолина (50 мг/кг за 3-7 дней) и дважды день эвакуации ручной мочевого пузыря.
- Место животных в одной клетки и обеспечивают доступной пищи и воды ad libitum. Мышей с полным SCI можно ходить с помощью их передние конечности и подход пищи и воды без каких-либо трудностей.
- Удаление хирургические зажимы 7 дней после операции SCI.
- В точках желаемое время, после SCI и ранив кожи усыпить животных на CO2 ингаляции (3-5 мин), в соответствии с руководящими принципами AVMA эвтаназии14.
- Сбор образцов раненых кожи, исправить в формалина 10% за 24 часа и затем хранить в 70% этанол на 4 ° C до секционирование.
- Для обработки тканей, внедрить в парафин и генерировать шлифов (5 мкм) на микротома. Пятно с гематоксилином и эозином (H & E) для визуализации тканей морфологии (рис. 3). Для иммуногистохимии исследований (рис. 4), выведение разделы, используя соответствующие антитела для Ki67 (распространения), CD31 (ангиогенеза) и альфа гладких мышц актина (α-SMA), как описано в Kumar et al.12
Примечание: Программное обеспечение для анализа изображений может использоваться для количественного определения изображения особенности12.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Этот протокол создает ПУ в обстановке полной SCI. кратко (как показано на рис. 1), все модели мыши с или без полного SCI мириться магниты очень хорошо, который оставался в их исходное положение для полного 12 h (рисунки 1 c, 1f, 1 d, 1 h ). Всех мышей разработаны две круглые раны, разделенных мост нормальной ткани (Рисунок 1e, 1 g, 1i). Первоначальная реакция ранения был похож мышей без SCI (...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Протокол в этом исследовании описывает Роман Экспериментальная модель гноя для оценки влияния SCI на заживление ран. Через 12 ч применение двух магнитов-шайб диаметром 12 мм на складку спинной кожи, установить выше или ниже сайта SCI были индуцированной кожи гной. Данные показывают, что SCI замедляет кожи заживление ран у мышей. Важно отметить, что эти замечания были специально сделаны в раны кожи ниже уровня иннервации SCI, как раны, сделанные выше уровня SCI, и таким образом, оставался иннервируемые, были в основном бе...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего сообщать.
Благодарности
Эта работа была частично поддерживается Комиссией Нью-Джерси по спинного исследований (CSCR15IRG010), Министерство обороны США (SC160029) и Йельского университета Кафедра хирургии ОГСЕ исследований грантовой программы. Мы благодарим Шон о ' Лири W.M. Кек центра совместных неврологии, Ратгерс для оказания технической помощи.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Магниты | Master Magnetcs, Inc., Касл Рок, CO | CD14C | 3800 G Магнитная сила |
| Мыши стандартная диета | PMI Nutrition International, Брентвуд, Миссури | Стандартные пищевые гранулы | |
| изофлуран | HENRY SCHEIN Animal Health | Артикул 029405 | |
| ImageJ | NIH, Bethesda, MD | Программное обеспечение для анализа изображений | |
| BETADINE Surgical Scrub | HENRY SCHEIN Animal Health | ||
| Офтальмологическая мазь | ГЕНРИ ШАЙН Здоровье животных | Артикул 008897 | |
| NAIR-Лосьон для удаления волос Church | & Dwight Co., Inc. Принстон, Нью-Джерси | ||
| ELOXIJECT (мелоксикам) Инъекция | HENRY SCHEIN Animal Health | Артикул 049755 | 5 мг/мл, 10 мл |
| цефазолин натрия | HENRY SCHEIN Animal Health | Артикул 054846 | 1 г, 10 мл флакон |
| Бупренорфин-SR | ZooPharm, Виндзор, CO | - | |
| -0,9% хлорида натрия для инъекций USP | BRAUN, Ирвайн, Калифорния | S8004-5384 | |
| 10% нейтральный буферизованный формалин | VWR, Раднор, Пенсильвания | 16004-130 | |
| BALB/C Самец мыши | Charles River Lab., Уилмингтон, Массачусетс | 28 | |
| Стерильный аппликатор с хлопковым наконечником | Puritan, Гилфорд, Мэн | SKU#: 25-806 | |
| Michel Suture Clips | Fine Science Tools (США) Inc., Фостер-Сити, Калифорния | 12040-01 | |
| Хирургический шовный материал, США. | Генри Шайн Здоровье животных | 101-2636 |
Ссылки
- Rappl, L. M. Physiological changes in tissues denervated by spinal cord injury tissues and possible effects on wound healing. International Wound Journal. 5 (3), 435-444 (2008).
- Salcido, R., Popescu, A., Ahn, C. Animal models in pressure ulcer research. The Journal of Spinal Cord Medicine. 30 (2), 107-116 (2007).
- Mak, A. F., Zhang, M., Tam, E. W. Biomechanics of pressure ulcer in body tissues interacting with external forces during locomotion. Annual Review of Biomedical Engineering. 12, 29-53 (2010).
- National Pressure Ulcer Advisory Panel. Prevention and Treatment of Pressure Ulcers: Clinical Practice Guideline. , Cambridge Media. Osborne Park, Western Australia. (2014).
- Marin, J., Nixon, J., Gorecki, C. A systematic review of risk factors for the development and recurrence of pressure ulcers in people with spinal cord injuries. Spinal Cord. 51 (7), 522-527 (2013).
- Krause, J. S. Skin sores after spinal cord injury: relationship to life adjustment. Spinal Cord. 36 (1), 51-56 (1998).
- Redelings, M. D., Lee, N. E., Sorvillo, F. Pressure ulcers: more lethal than we thought? Advances in Skin & Wound. 18 (7), 367-372 (2005).
- Kruger, E. A., Pires, M., Ngann, Y., Sterling, M., Rubayi, S. Comprehensive management of pressure ulcers in spinal cord injury: current concept and future trends. The Journal of Spinal Cord Medicine. 36 (6), 572-585 (2013).
- Lala, D., Dumont, F. S., Leblond, J., Houghton, P. E., Noreau, L. Impact of pressure ulcers on individuals living with a spinal cord injury. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 95 (15), 2312-2319 (2014).
- Li, C., DiPiro, N. D., Krause, J. A latent structural equation model of risk behaviors and pressure ulcer outcomes among people with spinal cord injury. Spinal Cord. 55 (6), 553-558 (2017).
- Kumar, S., Yarmush, M. L., Berthiaume, F. Impact of complete spinal cord injury on neovascularization and tissue granulation in mouse model of skin pressure ulcers. Journal of Neurotrauma. 34 (13), A72-A73 (2017).
- Kumar, S., Yarmush, M. L., Dash, B. C., Hsia, H. C., Berthiaume, F. Impact of complete spinal cord injury on healing of skin ulcers in mouse models. Journal of Neurotrauma. 35 (6), 815-824 (2018).
- Basso, D. M., Fisher, L. C., Anderson, A. J., Jakeman, L. B., McTigue, D. M., Popovich, P. G. Basso Mouse Scale for locomotion detects differences in recovery after spinal cord injury in five common mouse strains. Journal of Neurotrauma. 23 (5), 635-659 (2006).
- Leary, S., et al. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals. , American Veterinary Medical Association. Schaumburg, Illinois, USA. (2013).
- Stadler, I., Zhang, R. Y., Oskoui, P., Whittaker, M. S., Lanzafame, R. J. Development of a simple, noninvasive, clinically relevant model of pressure ulcers in the mouse. Journal of Investigative Surgery. 17 (4), 221-227 (2004).
- Peirce, S. M., Skalak, T. C., Rodeheaver, G. T. Ischemia-reperfusion injury in chronic pressure ulcer formation: a skin model in the rat. Wound Repair and Regeneration. 8 (1), 68-76 (2000).
- Wong, V. W., Sorkin, M., Glotzbach, J. P., Longaker, M. T., Gurtner, G. C. Surgical approaches to create murine models of human wound healing. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 969618-969625 (2011).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
