Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Репрессии транскрипции гена, перенаправив клеточными с химической эпигеномные модификаторы

6.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/58222

⸱

20 сентября 2018 г.

 ,  ,  ,  , 
1Chemical Biology and Medicinal Chemistry, Center for Integrative Chemical Biology and Drug Discovery, Curriculum in Genetics and Molecular Biology, University of North Carolina, 2College of Arts and Sciences, Chemical Biology and Medicinal Chemistry, Center for Integrative Chemical Biology and Drug Discovery, University of North Carolina, 3Chemical Biology and Drug Discovery, Pharmacological Sciences and Oncological Sciences, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 4Chemical Biology and Medicinal Chemistry, Center for Integrative Chemical Biology and Drug Discovery, Curriculum in Genetics and Molecular Biology, Lineberger Comprehensive Cancer Center, University of North Carolina

В этой статье

Краткое содержание

Регулирование окружающей среды хроматина является важным процессом для надлежащего ген выражение. Здесь мы описываем метод для контроля экспрессии генов путем набора chromatin изменения механизма ген специфического и обратимым образом.

Аннотация

Регулирование хроматина уплотнения является важным процессом, который регулирует экспрессию генов у высших эукариот. Хотя во многих заболеваний обычно разрушаются хроматина уплотнения и регулирование выражение гена, локус конкретных, эндогенного и реверсивные метод для изучения и контроля этих механизмов действий отсутствует. Для решения этой проблемы, мы разработали и характеризуется романа Джин регулируя бифункциональных молекул. Одним из компонентов бифункциональных молекулы связывается с ДНК белковых якорь так, что он будет набираться для Аллел Специфически Локус. Другой компонент занимается эндогенного chromatin изменения клеточными, рекрутинг эти белки для нокдауна определенного гена. Эти малые молекулы, называется химической эпигеномные модификаторы (CEMs), способны контролировать экспрессии генов и окружающей среды хроматина в зависимости от дозы и обратимым образом. Здесь мы подробно CEM подход и его применение к снижению экспрессии генов и ацетилирование гистона хвост на репортера Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП), расположенный в локусе Oct4 в мышиных эмбриональных стволовых клеток (mESCs). Мы характеризуют ведущим CEM (CEM23) с помощью флуоресцентной микроскопии, проточной цитометрии и иммунопреципитации chromatin (обломока), а затем количественных полимеразной цепной реакции (ПЦР). В то время как мощности этой системы проявляется в локусе Oct4 , концептуально, CEM технологии является модульной и может быть применен в других типах клеток и в других геномной локусов.

Введение

Хроматин состоит из ДНК, обернутые вокруг гистона octamer белков, которые формируют ядро нуклеосома частиц. Регулирование хроматина уплотнения является важнейшим механизмом для надлежащего ДНК ремонт, репликации и выражение1,2,3. Один из способов, в котором клетки контролировать уровень уплотнения является добавление или удаление различных модификаций хвост столб-поступательные гистонов. Две такие изменения включают ацетилирования (1) Лизин, которая чаще всего ассоциируется с активацией генов, и (2) Лизин метилирования, который может быть связан с активации генов или репрессий, в зависимости от контекста аминокислоты. Добавление ацетилирования и метилирования марок катализировано гистона acetyltransferases (шляпы) и гистона methyltransferases (HMTs), соответственно, в то время как удаление знака осуществляется гистона комплексы (ГДА) и demethylases (HDMs гистона ), соответственно4,5. Хотя существование этих белков было известно на протяжении десятилетий, многие механизмы как chromatin изменения механизма работы должным образом регулировать экспрессию генов еще предстоит определить. С хроматином регуляторные процессы являются dysregulated в многих заболеваний человека, новые идеи механистического может привести к будущим терапевтического применения.

В естественных условиях chromatin assay (ЦРУ) является недавно описан метод, который использует химическое индуктором близости (CIP) для управления chromatin изменения механизма набора конкретных Локус6. Эта технология использовалась для изучения расширяющийся список динамики хроматина, включая изменения гистона белки, ремонтом хроматина и транскрипции факторов6,,78,9. На основе CIP хроматина привязывая экзогенно выраженной белков также продлевался мимо ЦРУ для модуляции немодифицированных генетических локусов использования с деактивированной кластерного регулярно Interspaced короткие палиндром повторяет ТРИФОСФАТЫ связанные белком (dCas9) 10 , 11. в системе ЦРУ, были изменены mESCs выразить репортер гена GFP в Oct4 локусе, сильно выраженный и строго регламентируются области генома mESC. Ранее, эта система применялась для описания дозозависимый и обратимым вербовки экзогенно выраженной гетерохроматин протеин 1 (HP1), фермент, который связывает H3K9me3 и распространяет репрессивных знаки (например, H3K9me3) и ДНК Метилирование6. Чтобы выполнить этот тип стратегии набора персонала, mESCs заражены плазмида, выражающий FK506-связывающий белок (FKBP), связанные с Gal4, который является ДНК белковых привязку, которая связывает массив Gal4-привязки GFP репортер вверх по течению. Клетки также инфицированы FKBP-rapamycin связывающий домен (FRB), подключенных к HP1. Когда mESCs подвергаются воздействию низких наномолярных концентрациях CIP, rapamycin, FRB и FKBP, сводятся воедино в локусе целевого объекта. В течение дней rapamycin лечения экспрессия гена целевой подавляется, что подтверждается флуоресцентной микроскопии и потока цитометрии и ацетилирование гистона уменьшается, чип и бисульфит последовательности. Хотя разработка и проверка этого подхода были значительные успехи в области исследований хроматина и регулирования, один недостаток — необходимые экзогенных выражение chromatin изменения механизма.

Чтобы сделать технологии, основанные на наборе только эндогенных физиологически соответствующих ферментов и сделать более модульной системы, мы разработан и характеризуется Роман бифункциональных молекул, называемых CEMs (рис. 1)12. Одним из компонентов CEMs включает FK506, который похож на rapamycin, связывает плотно и специально для FKBP. Таким образом CEMs по-прежнему будут набраны к Oct4 локус в ЦРУ mESCs. Другой компонент ПОВ является остаток, который связывает эндогенного chromatin изменения механизма. В экспериментальном исследовании мы протестировали пов, содержащие ингибиторы ГДАЦ. Хотя концепция использования ингибитора набирать гда кажется нелогичным, ингибитор, тем не менее возможность набирать HDAC активность гена интереса. Это достигается путем (1) перенаправление HDAC в локусе, выпуская энзим и увеличение плотности ООН препятствует гда в этом районе и (2) поддержание HDAC ингибирование в локусе, но найма репрессивных комплексы, которые связывают к тормозится гда, (3) или комбинация обоих. В предыдущем исследовании, мы показали, что CEMs смогли успешно подавить GFP-репортер в зависимости от дозы и времени, а также в духе, который был быстро обратимых (т.е., в течение 24 часов)12. Мы были характерны способность CEM технологий, представленные здесь для контроля экспрессии генов с помощью микроскопии флуоресцирования, проточной цитометрии и способности для управления средой хроматина, используя чип ПЦР6. Здесь мы описываем метод для использования и характеризующие пов, которые будут способствовать адаптации этой системы для ответа на дополнительные вопросы, относящиеся к биологии хроматина.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1) клеточной культуры линия для производства Лентивирусы

  1. Растут свежие, низкий проход (меньше, чем прохождение 30) 293T человеческих эмбриональных почек (ГЭС) клетки в высоких глюкозы Дульбекко модифицированная орел базы СМИ среднего (DMEM) дополнены с 10% плода бычьим сывороточным (ФБС), 10 мм HEPES, 1 x несущественные аминокислот (NEAA), ручка / Стрептококк, 2-mercaptoenthanol в инкубаторе 37 ° C с 5% CO2. Разбить ячейки каждые 3-5 d и прежде чем они становятся > 95% притока.
  2. Прохождение 293T ГЭС клетки с6 18 x 10 на 15 см пластины (один 15-см пластины для каждого вируса производства).
    1. Для 15-см формат аспирационная старых СМИ, добавляют 10 мл 1 x фосфат амортизированное saline (PBS), аспирационная PBS и добавить 3 мл 0,05% трипсина. Инкубируйте клетки в трипсина 8 минут при 37 ° C, качалка и выстукивать на полпути через инкубации клеток.
      Примечание: Цель этого шага необходимо получить ячеек в одну ячейку подвеска.
  3. Когда клетки достигли 60% - 80% confluency следующий день, выполняют transfection polyethylenimine (PEI) с 13,5 мкг плазмида psPAX2, 4,5 мкг pMD2.G плазмиды, 18 мкг лентивирусные совместимых доставки вектора с гена интереса (т.е. , FKBP-Gal4), 108 мкл пей и 1,8 мл трансфекции средств массовой информации.
    1. Осторожно смешать ДНК, пей и трансфекции СМИ в 15 мл Конические трубки, инкубации образца при комнатной температуре в течение 15 мин и добавить его каплям к пластине 15-см.
      Примечание: Пожалуйста, используйте соответствующие меры безопасности и следовать всех институциональных и лабораторных процедур безопасности после этого шага, как все реагенты будут содержать живой вирус.
  4. После 16 h transfection и инкубации в инкубаторе 37 ° C с 5% CO2аспирационная СМИ и осторожно добавить свежие 293 ГЭС СМИ (подставьте в ванну воды 37 ° C) плиты 15-см. Инкубируйте клетки в 37 ° C инкубатор с 5% CO2 в течение 48 часов после того, как средства массовой информации изменения. Вирус, то готовы быть собраны.

2) инфекции из мышиных эмбриональных стволовых клеток (mESC) с человека

  1. Расти низкий проход (меньше, чем прохождение 35), фидер бесплатные адаптированные mESCs ЦРУ в высоких глюкозы DMEM базы СМИ дополнены 20% ESC-класс FBS, 10 мм HEPES, 1 x NEAA, перо/Strep, 2-mercaptoenthanol и 1: 500 лейкемии ингибитор фактор (LIF) в 37 ° C инкубатор с 5% CO2.
    Примечание: LIF получается из супернатант COS LIF-продуцирующих клеток, которые собираются в пакете и замороженные при температуре-80 ° C.
    1. Рост клеток на пластины, которые были преинкубации для 1-3 ч с 0,1% желатина в ПБС и впоследствии промывают с ПБС. Накормить клетки ежедневно и разделить их каждые 2-3 d, в зависимости от их плотности.
      Примечание: Морфологически, колоний эмбриональных стволовых клеток (ES) должны быть мелкие, круглые и отличаются друг от друга.
  2. Прохождение mESC в формате 12-ну пластины (100000 клеток/а) 1 d до инфекции.
    1. Подсчет количества ячеек с Горяева. Для клеток, выращиваемых в формате 10-см аспирационная старые средства массовой информации, добавить 5 мл ПБС, аспирационная PBS и добавить 1 мл 0,25% трипсина. Инкубируйте клетки в трипсина 8 минут при 37 ° C, качалка и выстукивать на полпути через инкубации клеток. Цель этого шага заключается в том, чтобы получить ячеек в одну ячейку подвеска.
  3. 48 ч после изменения СМИ от вирусных 293T15-см упаковка клетки от шага 1.4, удалить и передачи супернатант в 50-мл Конические трубки.
  4. Центрифуга супернатант в 300 x g за 5 мин до Пелле ячейки мусор.
  5. Фильтр супернатант через мембрану 0,45 мкм.
    Примечание: Не забудьте использовать поверхностно бесплатно ацетат целлюлозы (SFCA) мембраны, как некоторые другие материалы можно сохранить вирус и значительно снизить урожайность.
  6. Сосредоточиться вируса с ultracentrifugation, с помощью центрифуги с SW32 ротором и спина его на 20 000 об/мин (~ 72 000 x g) для 2,5 ч при 4 ° C.
  7. В то время как вирус концентрируется под ultracentrifugation, лечить mESCs ЦРУ в пластине 12-хорошо с свежими ES СМИ, содержащих 5 мкг/мл Полибрен.
  8. По окончании концентрация вируса тщательно удалить супернатант и приостановить Пелле вирус в 100 мкл ПБС (избежать избыточного пузыри).
  9. Добавьте вирус и ПБС отцентрифугировать 1,5 мл трубку. Вихревой/встряхнуть трубки 300 x g (или на самом низком настройки) полностью приостановить вирус. Спин вниз по трубе в мини Настольная центрифуга для 5-10 s для удаления пузырьков.
  10. Мкл 30 вируса в каждой скважине 12-ну плиты. Вихрем пластину и затем центрифуга пластину на 1000 x g 20 мин.
    Примечание: Количество вируса добавил могут варьируется в зависимости от вирусных титр, который пропорционален размер конструкции доставки.
    1. Кроме того flash заморозить вирус с жидким азотом и храните его при температуре-80 ° C. Однако замораживание вирус будет ниже вирусный титр.
  11. Место пластину 12-Ну обратно в инкубаторе 37 ° C и изменить СМИ следующее утро (~ 16 h) позднее с свежими ES СМИ (как описано в шаге 2.1).
  12. После 48 ч инфекции выберите для клеток, которые интегрированы вирусный плазмида, добавив соответствующий антибиотик (т.е., 1,5 мкг/мл puromycin, 10 мкг/мл blasticidin и т.д.). Измените средства массовой информации ежедневно и вымыть клетки с ПБС, если большинство клеток являются плавающие/мертвых. Сохранить выделение средств массовой информации на клетки для 72-96 h в инкубаторе 37 ° C с 5% CO2.

3) подготовка s химических эпигеномные модификаторы (CEM) и лечение

  1. Приостановите пудры CEM в диметилсульфоксида (ДМСО) штока концентрации 1 мм и рабочие концентрации 100 мкм.
  2. После того, как клетки прошли отбор для 72-96 h, разделена на 12-ну формат с 100000 клеток/хорошо mESCs. Инкубировать клетки в 37 ° C инкубатор с 5% CO2 за 24 ч. После этого, приготовляют раствор средства массовой информации 100 Нм джем с ES СМИ. Используйте этот носитель для корма mESC ЦРУ с 1 мл/хорошо. В качестве элемента управления, держите колодец клеток без каких-либо добавлен пов.
    1. Средства массовой информации аспирационных старые средства массовой информации и добавив 1 мл/хорошо свежеприготовленные CEM-содержащих или беспроводной ЦЕМ ES СМИ каждые 24 ч для измените продолжительность эксперимента.

4) анализ экспрессии микроскопии и проточной цитометрии

  1. После 48 часов лечения CEM, изображение клетки без лечения джем и клетках, обработанных с 100 Нм джем с помощью микроскопа флуоресценции. Представитель изображения с помощью фазы или brightfield для записи морфология mESC при 20-кратном; клетки должны сформировали круглый колоний, с несколько дифференцированных клеток. Под каналом флуоресценции FITC изображение оба условия клетки.
  2. Изолируйте управления и CEM-лечение клетки для проточной цитометрии, аспирационных СМИ, мытья клетки с 1 мл раствора ПБС, аспирационных PBS и добавить 0,25 мл 0,25% трипсина с ЭДТА для 8-10 мин.
  3. Убедитесь, что клетки больше не являются в больших сгустков, глядя в Микроскоп. Используйте 20 кратным увеличением. Если ячейки не отображаются в одной ячейки подвеска, нежно, Пипетка вверх и вниз, с P1000 пипетку, чтобы полностью trypsinize клетки.
  4. Утолить трипсина с 1 мл свежего СМИ и Ресуспензируйте клетки на высокой скорости с Серологические Пипетки (или с помощью P1000 пипеткой и кончик) до тех пор, пока клетки находятся в одной ячейки подвеска.
  5. Спин вниз клетки на 300 x g 5 мин аспирата супернатант. Вымойте с ПБС и recentrifuge клетки. Аспирационная PBS супернатант.
  6. Ресуспензируйте Пелле клеток в 200 мл буфера СУИМ (1 мм Этилендиаминтетрауксусная кислота [ЭДТА], ПБС и 0,2% альбумина bovine сыворотки [BSA]).
    1. Общий объем буфера СУИМ будет зависеть, сколько клетки присутствуют, но концентрация должна быть 1000-3000 клеток / мкл. подсчитать количество ячеек в 3 образцах и средняя концентрация клеток. При необходимости добавьте больше СУИМ буфера.
  7. Выполните проточной цитометрии > 50,000 клетки с подвесной клетки, сохраняя клетки на льду, когда они не анализируются. Используйте фильтр 530/40 (FITC, AF488, GFP и т.д.) для записи изменений в выражении. Определить соответствующие флуоресцентные напряжения с использованием необработанных управления ячейки выборки и установите напряжение иметь флуоресцентные пик быть в середине спектра записанные интенсивности. Выполнение примеров скоростью около 5000 клеток/с оболочкой.
  8. Экспортировать данные и анализировать ФТС файлы на программу цитометрии потока (т.е., FlowJo), сначала стробирования на вперед разброс против стороны разброс для живых клеток, а затем на вперед разброс высота против области для фуфайки. Затем, визуализировать GFP канала данных на гистограмме для определения относительной экспрессия гена GFP в целевых и контроля населения.

5) анализ Chromatin, Chromatin иммунопреципитации (чип) вслед за ПЦР

  1. Разделить mESCs на 10 см пластины с 3 миллионов клеток и 10 мл ES СМИ (одна пластина 10 см для каждой экспериментальной или контролировать состояние). Следующий день, добавляют 10 мл CEM-содержащих или джем свободных средств массовой информации. После 48 часов лечения CEM аспирационная старые средства массовой информации. Вымыть и удалить ячейки с 5 мл ПБС. Далее разбить ячейки с трипсин 0.25% и утолить трипсина с 10 мл ES СМИ. Граф и изолировать образец 10 миллионов клеток в состоянии.
  2. Спин вниз каждый из 10 миллионов клеток образцов на 300 x g за 5 мин.
  3. Ресуспензируйте каждой гранулы в 10 мл ПБС и recentrifuge клетки на 300 x g за 5 мин.
  4. Ресуспензируйте каждой гранулы в 10 мл ЦРУ исправить буфера (50 мм pH 8, 1 мм ЭДТА рН 8, 0.5 мм этиленгликоля бис [ß аминоэтил эфира]-N, N, N', N'-tetraacetic кислоты [EGTA] pH 8 и 100 мм хлорида натрия [NaCl]). Добавить 1 мл раствора формальдегида 11% и сразу Инвертируйте образцы 5 x - 10 x. Инкубируйте образца при комнатной температуре в течение 10 мин.
  5. Добавьте 0,5 мл 2,5 метров глицина. Инвертировать образцы сразу и инкубации образца на льду на 5 мин.
  6. Центрифугуйте образцы на 1200 x g 5 мин при 4 ° C. Аспирационная супернатант.
  7. Ресуспензируйте гранулы в 10 мл 1 промойте ЦРУ (50 мм HEPES рН 8, 140 мм NaCl, 1 мм ЭДТА рН 8, 10% глицерина, 0,5% Nonidet P-40 [NP40] и 0,25% Тритон X100). Проинкубируйте образцы на льду за 10 мин центрифуга его на 1200 x g 5 мин при 4 ° C.
  8. Ресуспензируйте гранулы в 10 мл ЦРУ промыть 2 (10 мм трис [гидроксиметил] aminomethane [трис] рН 8, 1 мм ЭДТА рН 8, 0,5 мм EGTA pH 8 и 200 мм NaCl). Центрифугуйте образцы на 1200 x g 5 мин при 4 ° C.
  9. Аккуратно добавьте 5 мл ЦРУ стрижка буфера (0,1% SDS, ЭДТА 1 мм и 10 мм трис рН 8) вдоль конической трубки смыть соль не нарушая гранулы. Центрифугуйте образцы на 1200 x g 3 мин при 4 ° C. Повторите шаг мыть.
  10. Ресуспензируйте гранулы в 90 мкл ЦРУ режа буфера и ингибиторы протеазы свежие (используйте смесь leupeptin, chymostatin и pepstatin A распущен вместе на 10 мг/мл в ДМСО сделать 1000 x Стоковый раствор, делая окончательный концентрации 10 мкг/мл). 10 мкл sonication повышения nanodroplets, сохраняя все на льду13,14.
  11. Трансфер 100 мкл раствора в стеклянной трубки и крышка трубки.
  12. Sonicate образцы для 3,5 мин (определяется на основе клеток линии и количество клеток). Во избежание перегрева образцов, обработки образцов в цикла 2-мин максимальной времена если общая sonication время превышает 2 мин.
    Примечание: Целенаправленное ultrasonicator используется здесь функций с высокой частотой (500 кГц). Запустить машину на акустической мощности 55 Вт. Продолжительность sonication следует заранее на каждый отдельным лаборатории.
  13. Передать новой пробки microcentrifuge 1,5 мл каждый образец sonicated хроматина. Спин трубы на 8000 x g на 2 мин при 4 ° C.
  14. Анализировать стрижка эффективность и определить их относительное количество хроматина, следовать протокол комплект Производитель чипа.
    Примечание: Определения концентрации ДНК спектрофотометрически (например, с помощью инструмента nanodrop ДНК), и запустить ~ 200 нг ДНК на геле агарозы 1% для проверки, что хроматина является sonicated для примерно 200-500 basepairs (bp) в размер.
  15. Для выполнения иммунопреципитации и изолировать хроматина, следовать протокол комплект Производитель чипа.
    Примечание: Для иммунопреципитации образцов с высокой концентрации ДНК, теплый Элюирующий буфер при 37 ° C и элюировать образцы 2 x с 30 мкл буфера (спиннинг за 1 мин каждый раз).
  16. Для выполнения ПЦР, загрузите реагентов в 384-ну плиту. Добавить 5 мкл 2 x асимметричный цианиновые краситель микс Мастер, 2,5 мкм каждого грунт, воду и 0,1 - 10 нг ДНК для каждой реакции.
    1. Дизайн праймеров для того чтобы усилить bp ампликонов 50-100 и значения CT нормализуются к гену домоустройства, intracisternal A-типа частиц (МАП).
      Примечание: Для дальнейших методов ПЦР, смотрите комплект Производитель протокол. Набор грунтовка, используются для таргетинга Oct4 Локус был: CACATGAAGCAGCACGACTT (F); (R) CCTTGAAGAAGATGGTGCGC. Грунтовка управления, набор команд для цели МАП был: ATTTCGCCTAGGACGTGTCA (F); (R) ACTCCATGTGCTCTGCCTTC.
    2. На основании праймеры и желаемого продукта, запустите ПЦР с 40 циклов отжига температура 60 ° c за 1 мин.
      Примечание: Полученные данные был предел, с использованием Дельта дельта Ct сравнений между образцами, с CiA:Oct4 нормализуется через МАП. Результаты заключительного анализа отображаются как средние тройные экспериментальных образцов, с ошибкой, представлены как стандартное отклонение от среднего значения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Мы недавно разработали пов и продемонстрировал, что эта технология может применяться для регулирования экспрессии генов и окружающей среды хроматина в локусе репортер в зависимости от дозы и обратимым образом. На рисунке 1показана модель ведущего CEM, CEM23. HDAC машины к репортер Локус завербован ингибиторы ГДАЦ, который, в данном случае является журналистом GFP, вставляется в локусе Oct4 .

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Здесь мы описали недавно разработанная система CEM применяются для регулирования экспрессии генов и окружающей среды хроматина в конкретных генов в зависимости от дозы. Мы предоставляем точный метод для изучения динамики участвует в регуляции экспрессии генов путем выборочного набора конкретных эндогенного хроматина регуляторных белков. Это высоко модульная технология, которая может применяться для расследования, как различные белка и хроматин модифицирующие комплексы работу в концерте должным образом регулировать хромат...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить членов Hathaway и Цзинь лабораторий за их полезные дискуссии. Авторы также поблагодарить Dan Crona и Иэн Макдональд за их критического чтения рукописи. Эта работа частично поддержали R01GM118653 грант от национальных институтов здравоохранения США (до N.A.H.); и на гранты R01GM122749, R01CA218600 и R01HD088626 от США национального институтов здравоохранения (для J.J.). Эта работа была также поддержана уровня 3 и студент грант от КООН Эшелман Институт инноваций (N.A.H и Мехико, соответственно). Дополнительное финансирование из T-32 GM007092 (в Мехико) поддерживает эту работу. Проточная цитометрия, полученные данные на КООН потока цитометрии Core объекте финансируется P30 CA016086 рака центр основной поддержки Грант на КООН Lineberger всеобъемлющем онкологический центр.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
DMEMCorning10-013CV
NEAAGibco11140-050
HEPES (для культуры тканей)Corning25-060-Cl
BME (2-меркаптоэтанол)Gibco21985-023
FBSAtlantic BiologicalsS11550Отдельные партии проверены на качество
пробирокCovarisКолпачки ThermoScientificC4008-632R
КолпачкиThermoScientificC4008-2A
PEI (полиэтиленимин)Polysciences23966-1
Трансфекционные среды (Opti-mem)Gibco31985070
344058
Вирусная фильтрующая мембранаCorning431220
PolybreneSanta Cruz BiotechnologySC134220
0,25 % ТрипсинGibco25200-056с ЭДТА
0,05 % ТрипсинGibco25400-054с ЭДТА
ПуромицинInvivoGenant-pr
БластицидинInvivoGenant-bl
SYBR Green Master Mix (асимметричный цианиновый краситель)Roche4913914001
H3K27ac антителоAbcamab4729
(ChIP kit) ChIP-IT High Sensitive KitActive Motif53040
SonicatorCovarisE110
УльтрацентрифугаOptimaXPN-80
SW-32 ротор центрифугиBeckman Coulter14U4354
Ведра центрифуги SW-32 TiBeckman Coulter130.2
LentiX 293 Эмбриональная почка человекаClontech632180
PBSCorning46-013-CM
BSAFisherBP9700
EGTASigmaE3889
EDTAFisherS311-100
NaClFisherS271-1
ГлицеринFisherG33-1
TrisFisherBP152
NP40Roche11754599001
TritonMP Biomedicals807426
глицинFisherBP381-500
TE буферFisherBP2474-1
HEPES (для ChIP)Проточный цитометр FisherBP310-100
желатиновыйSigmaG1890
, Attune NxTThermo FisherA24858
FKBP-Gal4 плазмидаAddgene44245
psPAX2 плазмидаAddgene12260
pMD2.G плазмидаAddgene12259
нанокаплиMegaShear/A
DNA NanodropThermo FisherND1000
(Leupeptin)Calbiochem/EMD108975
(химостатин)Calbiochem/EMD230790
(пепстатин)Calbiochem/EMD516481
CiA:Oct4 mESCДобрый подарок G. Crabtree
Lif-1C-альфа - продуцирующие Cos клеткиДобрый подарок J. Wysocka
Вирусные центрифужные пробирки Gibco Coulter Ингибиторы протеазы NИнгибиторы протеазы Ингибиторы протеазы

Ссылки

  1. Alabert, C., Groth, A. Chromatin replication and epigenome maintenance. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (3), 153-167 (2012).
  2. Venkatesh, S., Workman, J. L. Histone exchange, chromatin structure and the regulation of transcription. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (3), 178-189 (2015).
  3. Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Research. 21 (3), 381-395 (2011).
  4. Gräff, J., Tsai, L. -H. Histone acetylation: molecular mnemonics on the chromatin. Nature Reviews Neuroscience. 14 (2), 97-111 (2013).
  5. Verdin, E., Ott, M. 50 years of protein acetylation: from gene regulation to epigenetics, metabolism and beyond. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (4), 258-264 (2015).
  6. Hathaway, N. A., et al. Dynamics and memory of heterochromatin in living cells. Cell. 149 (7), 1447-1460 (2012).
  7. Ren, J., Hathaway, N. A., Crabtree, G. R., Muegge, K. Tethering of Lsh at the Oct4 locus promotes gene repression associated with epigenetic changes. Epigenetics. 13 (2), 173-181 (2018).
  8. Stanton, B. Z., Hodges, C., et al. Smarca4 ATPase mutations disrupt direct eviction of PRC1 from chromatin. Nature Genetics. 49 (2), 282-288 (2017).
  9. Koh, A. S., Miller, E. L., et al. Rapid chromatin repression by Aire provides precise control of immune tolerance. Nature Immunology. 19 (2), 162-172 (2018).
  10. Chen, T., Gao, D., et al. Chemically Controlled Epigenome Editing through an Inducible dCas9 System. Journal of the American Chemical Society. 139 (33), 11337-11340 (2017).
  11. Braun, S. M. G., et al. Rapid and reversible epigenome editing by endogenous chromatin regulators. Nature Communications. 8 (1), 560(2017).
  12. Butler, K. V., Chiarella, A. M., Jin, J., Hathaway, N. A. Targeted Gene Repression Using Novel Bifunctional Molecules to Harness Endogenous Histone Deacetylation Activity. ACS Synthetic Biology. 7 (1), (2018).
  13. Kasoji, S. K., et al. Cavitation Enhancing Nanodroplets Mediate Efficient DNA Fragmentation in a Bench Top Ultrasonic Water Bath. PLoS ONE. 10 (7), 0133014(2015).
  14. Chiarella, A. M., et al. Cavitation enhancement increases the efficiency and consistency of chromatin fragmentation from fixed cells for downstream quantitative applications. Biochemistry. 57 (19), 2756-2761 (2018).
  15. Gao, Y., et al. Complex transcriptional modulation with orthogonal and inducible dCas9 regulators. Nature Methods. 13 (12), 1043-1049 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

GFP
Репрессии транскрипции гена, перенаправив клеточными с химической эпигеномные модификаторы
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.