Целью протокола является показать продольной прижизненной слежение в реальном времени тимоцитов, лазерной сканирующей микроскопии в тимуса имплантатов в передней камере глаза мыши. Прозрачность роговицы и васкуляризация трансплантат позволяет непрерывно записывать прогениторных клеток вербовки и зрелых Т-клеток выхода.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
В режиме реального времени в Vivo отслеживания тимоцитов в передней камере глаза лазерная сканирующая микроскопия
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Представлен метод призвана показать, в первый раз, пересадка новорожденных thymi в передней глаз палаты isogenic взрослых мышей в vivo продольной реального времени мониторинга динамики thymocytes´ в пределах васкуляризированной Тимус сегмент. После трансплантации лазерной сканирующей микроскопии (МИС) через роговицу позволяет в vivo неинвазивной повторяющихся изображений на уровне клеточных резолюции. Важно отметить, что подход добавляет предыдущих прижизненной созревание Т-клеток, визуализации модели возможность непрерывного прогениторных клеток вербовки и зрелых Т-клеток выход записи в то же самое животное. Дополнительные преимущества системы являются прозрачность привитые области, позволяющие макроскопических быстрого мониторинга имплантированных ткани, и доступность для имплантации, позволяя для локализованных в дополнение к системной терапии. Основным ограничением является объем ткани, вписывается в ограниченном пространстве глаз камеры, которая требует для обрезки лепестка. Целостности органа максимизируется путем рассечения тимуса лопастями в шаблоны, ранее показанный функциональным для зрелых Т-клеток производства. Техника потенциально подходит допросить окружение медицински соответствующих вопросов, связанных с тимуса функции, которые включают аутоиммунные заболевания, приобретенного иммунодефицита и центральной толерантности; процессы, которые остаются механистически плохо определены. Тонкой рассечение руководящих тимоцитов миграции, дифференциация и выбор механизмов должно привести к Роман терапевтические стратегии ориентации развивающихся Т-клеток.
Введение
Intrathymic Т-клеточная дифференцировка и выбор субпопуляции Т-клеток являются ключевых процессов для развития и поддержания клеточного иммунитета в позвоночных1. Этот процесс включает в себя сложные последовательности плотно организованных мероприятий, включая вербовку прародителей от крови, пролиферации и миграции, дифференциальной выражение мембранных белков, и массивные запрограммированная смерть клетки для подмножества выбор. Результатом является освобождение зрелых Т-клетки реагируют на большой спектр иностранных антигены во время отображения свернутого ответы на self пептиды, которые конца вверх колонизировать периферических лимфоидных о....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все эксперименты согласно рекомендациям IACUC одобрил институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) из университета Майами.
1. изоляция и обрезки новорожденных Thymi
- Подготовьте все реагенты и инструменты автоклавирования или других методов, обеспечение стерильных условий.
- Чтобы свести к минимуму загрязнений, выполняют все хирургические вмешательства под капотом ламинарного потока.
- До euthanizing доноров мышей, заполнить 60 мм стерильные блюдо с стерильных prechilled 1 x фосфат амортизированное saline (PBS, рН 7,4) и поместите его на льду. Он будет использоваться для промывки и хранения подакц....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Тимус от новорожденных мышей были изолированы от B6. CG-Tg(CAG-DsRed*MST) 1Nagy/Жас мышей, как описано в настоящем Протоколе (шаги 1,1-1,9). В этих трансгенных мышей промоутер актина курица бета направляет выражение Красного флуоресцирующего белка вариант DsRed. MST под влиянием цитомегаловирусом (CMV) немедленно усилитель ранних облегчения отслеживания имплантатов.
Для предотвращения отторжения тканей, isogenic людей с.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Ввиду важности процесса созревания Т-клеток для индивидуальной иммунной компетентности4 и предполагаемого воздействия прекурсоров клеток динамики на зрелых Т-клетки, производимые тимуса2,3инвестировали значительные усилия разработать альтернативы подходу снимок классической фиксированной ткани.
Хотя фрагменты тканей и другие эксплантов явно превосходит в воспроизводя архитектуру ткани чем монослои или совокупных.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего сообщать.
Благодарности
Эта работа была поддержана NIH грантов R56DK084321 (AC), R01DK084321 (AC), R01DK111538 (AC), R01DK113093 (AC) и R21ES025673 (AC) и лучшие/2015/043 Грант (Consellería де Educació, cultura я киберспорта, Женералитата valenciana, Валенсия, Испания) (ЭО). Авторы благодарят команду отправлено в Universidad Católica де Валенсия Сан Висенте Мартир, Валенсия, Испания и Альберто Эрнандес в Centro de Investigación Принсипе Фелипе, Валенсия, Испания, за их помощь с видео съемки и редактирования.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Изофторный испаритель с изофлюораном | Kent Scientific Corp | VetFlo-1215 | |
| Препарирующий эндоскоп с источником света | Zeiss | Stemi 305 | |
| Тонкодиссекционные щипцы | WPI | 500455 | |
| Щипцы для среднего рассечения | WPI | 501252 | |
| Щипцы для тонкого рассечения с изогнутым наконечником | WPI | 15917 | |
| Ножницы Vannas | WPI | 503371 | |
| Ножницы для препарирования | WPI | 503243 | |
| Скальпель | WPI | 500353 | |
| 40 мм иглы 18G | BD | 304622 | |
| Одноразовая переводная пипетка | Thermofisher | 201C | |
| Грелка и тепловая лампа | Kent Scientific Corp | Infrarred | |
| Этанол 70% | VWR | 83,813,360 | |
| 60 мм стерильная посуда | SIGMA | CLS430166 | |
| Стерильная 1x PBS pH(7,4) | Thermofisher | 10010023 | |
| Стерильные салфетки | Kimberly-Clark | LD004 | |
| Препараты для обезболивания | Sigma-Aldrich | A3035-1VL | |
| Солевой раствор или Вискослезы | Novartis | N/A | |
| Стереомикроскоп | Leica | MZ FLIII | |
| Адаптер для удержания головы | Narishige | SG-4N-S | |
| Противогаз | Narishige | GM-4_S | |
| Конфокальный микроскоп | Leica | TCS SP5 II | |
| Ламинарный проточный бленд | Telstar | BIO IIA |
Ссылки
- Boehm, T., Hess, I., Swann, J. B. Evolution of lymphoid tissues. Trends in Immunology. 33, 315-321 (2012).
- Takahama, Y. Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection. Nature Reviews Immunology. 6 (2), 127-135 (2006). ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
