Здесь мы представляем протокол генетически изменить основной или расширенный человека природные (NK) киллеры с помощью Cas9 Ribonucleoproteins (Cas9/RNPs). Используя этот протокол, мы создали NK клеток человека недостаточно для превращения рецепторов фактора роста – b 2 (TGFBR2) и phosphoribosyltransferase гипоксантина 1 (HPRT1).
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Поколение нокаут-основной и Расширенный человеческого НК-клеток с помощью Cas9 Ribonucleoproteins
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
ТРИФОСФАТЫ/Cas9 технологии ускоряется генома техники во многих типов клеток, но до настоящего времени доставки генов и стабильной гена модификации были сложным в первичной НК-клеток. К примеру трансген доставки с помощью лентивирусные или ретровирусной трансдукции привели к ограниченной доходности генетически НК-клеток за счет существенной связанные процедуры NK клеток апоптоз. Здесь мы описываем ДНК, свободной метод для изменения генома человека основной и расширенный НК-клеток с использованием Cas9 рибонуклеопротеида комплексов (Cas9/RNPs). Этот метод позволил эффективно нокаут TGFBR2 и HPRT1 генов в клетки. RT-PCR данные показали значительное снижение уровня выражения гена, и цитотоксичность пробирного представитель ячейки продукта предложил, что RNP-Изменение NK клеток стали менее чувствительными к TGFβ. Генетически модифицированные клетки может быть расширение пост электропорация путем стимуляции с облученного mbIL21-выражая клетки фидера.
Введение
Иммунотерапия рака была выдвинута в последние годы. Генетически модифицированные химерных антигена рецепторов (автомобиль) Т-клетки являются отличным примером инженерии иммунных клеток, успешно развернуты в Рак иммунотерапия. Эти клетки были недавно одобрен FDA для лечения против CD19 + B клеток злокачественных опухолей, но успех пока ограничивается заболеваний, принимая несколько ориентации антигены и ориентации такого ограниченного антигенной репертуаров склонны к неспособности иммунных побег. Кроме того автомобиль Т-клетки были сосредоточены на использование аутологических клеток T из-за риска – трансплантат против – хост заболеваний, вызванных аллогенных клеток T.....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Баффи пальто здоровых доноров были получены в качестве исходного материала от Центральной Огайо региона американского Красного Креста. Это исследование было установлено быть освобождены исследований институционального обзора Совет из общенациональных Детская больница.
1. человека NK клеток очистки и расширения
- Изолируйте репликацию с Баффи пальто12.
- Слой 35 мл образца Баффи пальто на 15 мл Ficoll-Paque.
- Центрифуга на 400 x g 20 минут без тормозов и собирать КСДОР от интерфейса.
- Мыть восстановленные получения три раза путем добавления по крайней мере равным объемом PBS, центрифу....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Электропорация эффективность
Чтобы оптимизировать электропорации Cas9/RNPs, мы протестировали 16 различных программ с трансдукции GFP ненацеливания siRNA и плазмида ДНК в клетки. Потока cytometry анализ показали, что EN-138 самый высокий процент клеток жизнеспособность и электромеханической эффективности (35% живой GFP позитивные клетки) для обоих частиц (рис. 1 и .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
ДНК зависимая модификация НК-клеток сложной4,9. Мы, таким образом, внедрили непосредственно комплекс синтетически преформированных рибонуклеопротеида (RNPs) и Cas9 белка как очищенный протеин в основной и расширенный NK клеток8. Этот метод позволил нам устранить укупорки, хвостохранилища, и другие процессы транскрипционный анализ и трансляционная начал РНК-полимераза II, который может вызывать апоптоз клеток НК связанные с ДНК зависимой тр.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
DAL служит/служил в качестве консультанта для курьера терапии, обсидиан терапии, Intellia терапии, Merck научно-исследовательских лабораторий и Miltenyi Биотек и справедливости/лидерство в CytoSen терапии.
Благодарности
Мы признаем Брайан Tullius за его любезное помощь в редактировании рукопись.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| РозеттаСентябрь&торговля; Коктейль для обогащения NK-клеток человека | STEMCELL Technologies | 15065 | The RosetteSep™ Коктейль для обогащения NK-клеток человека предназначен для выделения NK-клеток из цельной крови путем отрицательного отбора. |
| Ficoll-Paque® PLUS | GE Healthcare - Медико-биологические науки | 17-1440-02 | |
| Alt-R® CRISPR-Cas9 tracrRNA | Integrated DNA Technologies | 1072532 | TracrRNA, которая содержит запатентованные химические модификации, повышающие устойчивость к нуклеазам. Гибридизуется с crRNA для активации фермента Cas9 |
| Alt-R® Интегрированные | технологии ДНК | синтетически производятся как Alt-R® CRISPR-Cas9 crРНК, основанная на последовательности сконструированной гРНК, нацеленной на ген интереса | |
| Alt-R® Набор для обнаружения редактирования генома | Integrated DNA Technologies | 1075931 | Каждый набор содержит эндонуклеазу T7EI, реакционный буфер T7EI и контрольные элементы анализа T7EI. |
| Платина Taq ДНК-полимераза высокой точности | Invitrogen | 11304-011 | |
| 4D-нуклеофектор&торговля; Система | Lonza | AAF-1002B | |
| Человеческий рекомбинантный IL-2 Белок | Novartis | 65483-0116-07 | |
| P3 Первичная клетка 4D-Nucleofector™ X Kit | Lonza V4XP-3032 | содержит pmaxGFP™ Вектор, Nucleofector™ Раствор, Добавка, 16-луночный нуклеокувет и торговля; Полоски | |
| нетаргетные: Custom siRNA, Standard 0,05 2mol ON-TARGETplus | Dharmacon | CTM-360019 | |
| Alt-R® S.p. Cas9 Nuclease 3NLS | Integrated DNA Technologies | 1074181 | Cas9 Nuclease |
| DNeasy® Кровь и Справочник по тканевым тканям | Qiagen | 69504 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Calcein AM | ThermoFisher | C3099 | |
| TGFβ | Биолегенда | 580706 | |
| Alt-R® Контрольный набор CRISPR-Cas9, | интегрированные в человека технологии ДНК | 1072554 | включает в себя тракрРНК, положительную контрольную crРНК HPRT, отрицательную контрольную crRNA #1, смесь праймеров HPRT и дуплексный буфер без нуклеазы. |
| IDTE pH 7,5 (1X TE Solution) | Integrated DNA Technologies | 11-01-02-02 | |
| Alt-R® Усилитель электропорации Cas9 | Интегрированные технологии ДНК | 1075915 | Усилитель электропорации Cas9 |
Ссылки
- Guven, H., et al. Efficient gene transfer into primary human natural killer cells by retroviral transduction. Experimental Hematology. 33 (11), 1320-1328 (2005).
- Alici, E., Sutlu, T., Sirac Dilber, M. Retroviral gene transfer i....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
