Методическая статья

Поколение нокаут-основной и Расширенный человеческого НК-клеток с помощью Cas9 Ribonucleoproteins

DOI:

10.3791/58237

⸱

14 июня 2018 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Childhood Cancer and Blood Disease, Nationwide Children's Hospital, 2Nuffield Division of Clinical Laboratory Sciences, Radcliffe Department of Medicine, University of Oxford, 3Center for Clinical and Translational Research, Nationwide Children's Hospital Research Institute

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем протокол генетически изменить основной или расширенный человека природные (NK) киллеры с помощью Cas9 Ribonucleoproteins (Cas9/RNPs). Используя этот протокол, мы создали NK клеток человека недостаточно для превращения рецепторов фактора роста – b 2 (TGFBR2) и phosphoribosyltransferase гипоксантина 1 (HPRT1).

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ТРИФОСФАТЫ/Cas9 технологии ускоряется генома техники во многих типов клеток, но до настоящего времени доставки генов и стабильной гена модификации были сложным в первичной НК-клеток. К примеру трансген доставки с помощью лентивирусные или ретровирусной трансдукции привели к ограниченной доходности генетически НК-клеток за счет существенной связанные процедуры NK клеток апоптоз. Здесь мы описываем ДНК, свободной метод для изменения генома человека основной и расширенный НК-клеток с использованием Cas9 рибонуклеопротеида комплексов (Cas9/RNPs). Этот метод позволил эффективно нокаут TGFBR2 и HPRT1 генов в клетки. RT-PCR данные показали значительное снижение уровня выражения гена, и цитотоксичность пробирного представитель ячейки продукта предложил, что RNP-Изменение NK клеток стали менее чувствительными к TGFβ. Генетически модифицированные клетки может быть расширение пост электропорация путем стимуляции с облученного mbIL21-выражая клетки фидера.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Иммунотерапия рака была выдвинута в последние годы. Генетически модифицированные химерных антигена рецепторов (автомобиль) Т-клетки являются отличным примером инженерии иммунных клеток, успешно развернуты в Рак иммунотерапия. Эти клетки были недавно одобрен FDA для лечения против CD19 + B клеток злокачественных опухолей, но успех пока ограничивается заболеваний, принимая несколько ориентации антигены и ориентации такого ограниченного антигенной репертуаров склонны к неспособности иммунных побег. Кроме того автомобиль Т-клетки были сосредоточены на использование аутологических клеток T из-за риска – трансплантат против – хост заболеваний, вызванных аллогенных клеток T. В противоположность этому НК-клетки способны убить цели опухолевого антигена независимым образом и не вызывают GvHD, что делает их хорошим кандидатом для рака иммунотерапия6,,78,9.

ТРИФОСФАТЫ/Cas9 технология была использована недавно в инженерных иммунных клеток, но генетически перепрограммирования НК-клеток с плазмид всегда была сложной. Это объясняется трудностями в доставке трансген зависимым образом ДНК как лентивирусные и антиретровирусным трансдукции, вызывая значительные связанные процедуры NK клеток апоптоз и ограниченное производство генетически NK клеток4 , 9.

Многие врожденные иммунные клетки Экспресс высокий уровень рецепторов для патоген связанные молекулярные модели, такие как ретиноевой кислоты inducible gene я (RIG-я), которые позволяют повышение признания иностранных ДНК. Подавление этих путей позволило более высокую эффективность трансдукции в НК-клеток при использовании методов на основе ДНК генетической модификации10.

Здесь мы описываем метод для использования свободных ДНК генома редактирования основного и расширенного NK клеток человека используя Cas9 рибонуклеопротеида комплексы (Cas9/RNPs). Cas9/RNPs состоит из трех компонентов, рекомбинантные Cas9 белка complexed с синтетическими сингл руководство РНК состоит из complexed crRNA и tracerRNA. Эти Cas9/RNPs способны раскалывание genomic цели с более высокой эффективностью по сравнению с иностранными ДНК зависимая подходов благодаря их доставки как функциональных комплексов. Кроме того быстрое оформление Cas9/RNPs от клеток может уменьшить пробить эффекты, такие как индукции апоптоза. Таким образом они могут использоваться для создания плей аутов, или стук ins для гомологичная рекомбинация6,7в сочетании с ДНК. Мы показали, что электропорации Cas9/RNPs-это простой и довольно эффективный метод, который преодолевает предыдущие ограничения генетической модификации в НК-клеток.

TGFβ является основных иммуносупрессивные цитокинов, который ингибирует активацию и функции НК-клеток. Было высказано предположение о том, что ориентация на тропе TGFβ может увеличить функции иммунных клеток. Мы целевой регион кодирования TGBR2 ectodomain, который связывает TGFβ11. Представитель результаты показывают значительное снижение уровня экспрессии мРНК этого гена и далее демонстрировать, что изменение НК-клетки становятся устойчивыми к TGFβ. Кроме того измененные клетки сохраняют жизнеспособность и пролиферативный потенциал, поскольку они способны быть расширенной пост электропорация облученного фидер клеток. Таким образом, следующий метод является перспективным подходом к генетически манипулировать НК-клеток для любого дальнейшего клинического или исследовательских целях.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Баффи пальто здоровых доноров были получены в качестве исходного материала от Центральной Огайо региона американского Красного Креста. Это исследование было установлено быть освобождены исследований институционального обзора Совет из общенациональных Детская больница.

1. человека NK клеток очистки и расширения

  1. Изолируйте репликацию с Баффи пальто12.
    1. Слой 35 мл образца Баффи пальто на 15 мл Ficoll-Paque.
    2. Центрифуга на 400 x g 20 минут без тормозов и собирать КСДОР от интерфейса.
    3. Мыть восстановленные получения три раза путем добавления по крайней мере равным объемом PBS, центрифугирование в 400 x g на 5 минут и аспирационных КПБ мыть. NK клеток могут быть изолированы на этой стадии RosettesSep13.
  2. Разверните НК-клеток, стимулируя с облученного 10 х 106 mbIL21-выражая клетки фидера на 0, 7 и 14 дней. Замените свежим RPMI, содержащие 10% СМИ FBS, 1% глютамина, 1% стрептомицин, пенициллин и 100 МЕ/мл Ил-2 для всего СМИ тома каждый день.

2. gRNA дизайн и подбор

  1. Выбор конкретных локусов геномной направлять, используя онлайн инструменты, например, NCBI, ансамбль.
    Пример.
    Описание/контроль: Преобразование рецепторов фактора роста бета 2 (TGFBRR2) ectodomain
    Просмотр записи: PF08917
    Просмотр InterPro: IPR015013
    Должность: 49-157 aa
    Целевые последовательности: Экзона 4 гена TGFBR2 (ENSG00000163513)
  2. Дизайн оформления, используйте ТРИФОСФАТЫ дизайн веб-инструменты, такие как http://crispr.mit.edu и «Benchling.»
    1. Введите в последовательности ДНК, выбранного на шаге 2.1. Выберите целевой генома человека (hg 19). ТРИФОСФАТЫ направляющие (20 нуклеотидов следуют последовательность PAM: NGG) будут проверяться из последовательности, введенные ранее. Он также показывает возможные совпадения пробить на протяжении выбранного генома.
    2. Выберите лучшие три оформления, которые имеют самый высокий балл, основанный на их ставок на цель и пробить. Например Таблица 1 показывает разработан ТРИФОСФАТЫ RNAs целевой экзона 4 TGFBR2 гена предложенные ТРИФОСФАТЫ дизайн веб-инструменты.
  3. Порядок ТРИФОСФАТЫ РНК как синтетические последовательность конкретных crRNAs.
  4. Заказать сохранены, transactivating РНК (tracrRNA) для взаимодействия через частичная Гомология с crRNA.

3. Дизайн Удаление скрининг грунтовки

  1. Праймеры дизайн, охватывающих gRNA расщепления сайтов для assay T7E1 мутации.
  2. Использование грунты по крайней мере 100 ВР от предсказал расщепление сайта для обеспечения небольшие вставки удаление (indels) на целевой сайт sgRNA будет появляться на 1,5% агарозном геле после мутации assay. Таблица 2 показывает грунты, которые используются для усиления TGFBR2 ectodomain.

4. трансдукции человека основной и расширенный НК-клеток

Примечание: Трансдукции Cas9/RNPs элементов в НК делается путем электропорации, используя 4D системы следующим.

  1. Ячейка Подготовка
    1. Для первичного НК-клеток, инкубировать свежевыделенных НК-клеток в среде RPMI присутствии 100 МЕ/мл Ил-2 на 4 дня и выполнять электропорации в день 5. Замените средства массовой информации каждый день, как описано ранее и за день до трансдукции.
    2. Для расширенного НК-клеток, стимулируют клетки в день 0 с облученного фидер клеток в соотношении 1:1 и выполнять электропорации в день 5 или 6 или 7. Замените средства массовой информации каждый день, как описано ранее и за день до трансдукции.
    3. В день электропорация Подготовьте T25 колбу, заполнены с 8 мл свежего RPMI, содержащие 100 МЕ/мл Ил-2 для клетки проходят электропорации и предварительно incubate колбы в увлажненные, 37 ° C и 5% CO2 инкубатора.
      Примечание: Размороженный клетки или клетки, которые прошли 2-ой или 3rd стимуляции может быть electroporated в любое время после их восстановления, как описано.
    4. Возьмите 3-4 × 106 клеток / условие для 26 мкл трансдукции смеси.
      Примечание: Очень высокая концентрация НК-клеток в растворе для электропорации повышает уровень трансдукции.
    5. Вымойте клетки 3 раза с PBS для удаления всех FBS, который обычно содержит РНКазы активности. Спина их вниз каждый раз на 300 x g за 8 минут.
      Примечание: Рассмотрим 7 электропорации условия для Cas/RNPs как единый gRNA (gRNA1, gRNA2, gRNA3) и сочетание двух оформления (gRNA1 + gRNA2, gRNA1 + gRNA3, gRNA2 + gRNA3) и один элемент управления с не Cas9/RNPs.
  2. Форма crRNA:tracerRNA / комплекс
    1. Ресуспензируйте crRNAs (gRNA1, gRNA2 и gRNA3) и tracerRNA в 1 x решение TE окончательный концентрации 200 мкм. Mix 2.2 мкл каждого gRNA 200 мкм с 200 мкм tracerRNA, как показано в таблице 3.
    2. Тепла образцы на 95 ° C за 5 минут и дайте ему остыть на скамейке сверху комнатной температуре (15-25 ° C). Магазин высокомобильна РНК и crRNA: tracerRNA/комплекс при-20 ° C для последующего использования.
  3. Образуют комплекс RNP
    Примечание:     чтобы сэкономить время, образуют комплекс во время стирки RNP Шаг 4.1.5.
    1. Для одного crRNA:tracrRNA дуплекс реакции развести Cas9 эндонуклеазы до 36 мкм, как показано в примере в таблице 4.
    2. Для комбинации трансдукции crRNA:tracrRNA дуплексы, разбавить Cas9 эндонуклеазы до 36 мкм, как показано в примере в Таблица 5.
    3. Добавление Cas9 эндонуклеазы crRNA:tracrRNA дуплексы медленно во время закрученного кончиком пипетки, свыше 30 s до 1 минуты.
    4. Инкубируйте смесь при комнатной температуре 15-20 мин. Если не готовы использовать смесь после инкубации, оставьте смесь на льду до использования.
  4. Электропорация
    1. Добавьте все дополнения электропорации решение P3 и держать его при комнатной температуре.
    2. Ресуспензируйте ячейки Пелле (3-4 × 106 клеток из шага 4.1.5) в 20 мкл P3 первичной 4 D электропорации решения. Избегайте пузырьков воздуха при закупорить.
      Примечание: клетки не следует оставлять долгое время в растворе P3.
    3. Сразу же добавьте 5 мкл RNP комплекса (шаг 4.3) суспензии клеток.
    4. Добавьте смесь 1 мкл 100 мкм Cas9 электропорации усилитель на Cas9/RNPs/ячейку.
    5. Передача Cas9/RNPs/ячейку смесь на 20 мкл электропорации полоски.
    6. Аккуратно коснитесь полосы, чтобы убедиться, что образец охватывает в нижней части полосы.
    7. Начало 4D электропорации системы и выбрать программу EN-138 .

5. должность трансдукция

  1. Пусть отдых на 3 минуты в полоски клетки.
  2. 80 мкл предварительно уравновешенной СМИ культуры в кювет и нежно перенесите образца в колбы.
  3. 48 часов после трансдукции, экстракт геномной ДНК от 5 × 105 клеток для удаления гена скрининга.
  4. Усилить гена интереса, используя грунты, предназначенные на шаге 3.2 с комплекты полимеразы дна Taq.
  5. Форма heteroduplexes Ампликон ПЦР для T7EI пищеварение и инкубировать продукта на 30-60 минут с T7EI фермента в 37 ° C.
    Примечание: T7EI, которую пробирного является предпочтительным для скрининга является быстрым, простым и обеспечивает чистый электрофорез результаты по сравнению с использованием пробирного инспектора. Однако, этот метод не может обнаружить вставок и удалений из < 2 базы, которые создаются не гомологичных концу вступление (NHEJ) деятельность в Cas9 RNPs экспериментов14.
  6. Запустите переваривается ДНК на 1,5% агарозном геле на 110 V для 30-45 минут, каждые 15 минут визуализировать геля.
  7. Стимулировать остальнои клеток с mbIL21-выражая ячейки едока в соотношении 1:1.
  8. Через пять дней после стимуляции извлечь РНК для уровня выражения гена с помощью ПЦР.
  9. Проведение анализов Флуорексон как сообщалось ранее12. Вкратце Загрузите клетки-мишени с Флуорексон утра (в примере, используется 3 мкг/мл/1000000 DAOY клеток). Подготовьте НК-клеток для анализов цитотоксичность, отдыхает на ночь в IL2 (100 МЕ/мл) плюс или минус 10 нг/мл растворимых TGFβ. Проводить Флуорексон анализов в том же цитокинов, НК-клетки были положила в одночасье.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Электропорация эффективность

Чтобы оптимизировать электропорации Cas9/RNPs, мы протестировали 16 различных программ с трансдукции GFP ненацеливания siRNA и плазмида ДНК в клетки. Потока cytometry анализ показали, что EN-138 самый высокий процент клеток жизнеспособность и электромеханической эффективности (35% живой GFP позитивные клетки) для обоих частиц (рис. 1 и ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ДНК зависимая модификация НК-клеток сложной4,9. Мы, таким образом, внедрили непосредственно комплекс синтетически преформированных рибонуклеопротеида (RNPs) и Cas9 белка как очищенный протеин в основной и расширенный NK клеток8. Этот метод позволил нам устранить укупорки, хвостохранилища, и другие процессы транскрипционный анализ и трансляционная начал РНК-полимераза II, который может вызывать апоптоз клеток НК связанные с ДНК зависимой тр...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DAL служит/служил в качестве консультанта для курьера терапии, обсидиан терапии, Intellia терапии, Merck научно-исследовательских лабораторий и Miltenyi Биотек и справедливости/лидерство в CytoSen терапии.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы признаем Брайан Tullius за его любезное помощь в редактировании рукопись.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
РозеттаСентябрь&торговля; Коктейль для обогащения NK-клеток человекаSTEMCELL Technologies15065The RosetteSep™ Коктейль для обогащения NK-клеток человека предназначен для выделения NK-клеток из цельной крови путем отрицательного отбора.
Ficoll-Paque® PLUSGE Healthcare - Медико-биологические науки17-1440-02
Alt-R® CRISPR-Cas9 tracrRNAIntegrated DNA Technologies1072532TracrRNA, которая содержит запатентованные химические модификации, повышающие устойчивость к нуклеазам. Гибридизуется с crRNA для активации фермента Cas9
Alt-R® Интегрированныетехнологии ДНКсинтетически производятся как Alt-R® CRISPR-Cas9 crРНК, основанная на последовательности сконструированной гРНК, нацеленной на ген интереса
Alt-R® Набор для обнаружения редактирования геномаIntegrated DNA Technologies1075931Каждый набор содержит эндонуклеазу T7EI, реакционный буфер T7EI и контрольные элементы анализа T7EI.
Платина Taq ДНК-полимераза высокой точностиInvitrogen11304-011
4D-нуклеофектор&торговля; СистемаLonzaAAF-1002B
Человеческий рекомбинантный IL-2 БелокNovartis65483-0116-07
P3 Первичная клетка 4D-Nucleofector™ X KitLonza V4XP-3032содержит pmaxGFP™ Вектор, Nucleofector™ Раствор, Добавка, 16-луночный нуклеокувет и торговля; Полоски
нетаргетные: Custom siRNA, Standard 0,05 2mol ON-TARGETplusDharmaconCTM-360019
Alt-R® S.p. Cas9 Nuclease 3NLSIntegrated DNA Technologies1074181Cas9 Nuclease
DNeasy® Кровь и Справочник по тканевым тканямQiagen69504
RNeasy Mini KitQiagen74104
Calcein AMThermoFisherC3099
TGFβБиолегенда580706
Alt-R® Контрольный набор CRISPR-Cas9,интегрированные в человека технологии ДНК1072554включает в себя тракрРНК, положительную контрольную crРНК HPRT, отрицательную контрольную crRNA #1, смесь праймеров HPRT и дуплексный буфер без нуклеазы.
IDTE pH 7,5 (1X TE Solution)Integrated DNA Technologies11-01-02-02
Alt-R® Усилитель электропорации Cas9Интегрированные технологии ДНК1075915Усилитель электропорации Cas9
CRISPR-Cas9 crRNA

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Guven, H., et al. Efficient gene transfer into primary human natural killer cells by retroviral transduction. Experimental Hematology. 33 (11), 1320-1328 (2005).
  2. Alici, E., Sutlu, T., Sirac Dilber, M. Retroviral gene transfer into primary human natural killer cells. Methods in Molecular Biology. 508, 127-137 (2009).
  3. Carlsten, M., Childs, R. W. Genetic Manipulation of NK Cells for Cancer Immunotherapy: Techniques and Clinical Implications. Frontiers in Immunology. 6, 266(2015).
  4. Mehta, R. S., Rezvani, K. Chimeric Antigen Receptor Expressing Natural Killer Cells for the Immunotherapy of Cancer. Frontiers in Immunology. 283, 9(2018).
  5. Zuris, J. A., et al. Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo. Nature Biotechnology. 33 (1), 73-80 (2015).
  6. Wang, M., et al. Efficient delivery of genome-editing proteins using bioreducible lipid nanoparticles. PNAS. 113 (11), 2868-2873 (2016).
  7. Liang, Z., et al. Efficient DNA-free genome editing of bread wheat using CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein complexes. Nature Communications. 8, 14261(2017).
  8. DeWitt, M. A., Corn, J. E., Carroll, D. Genome editing via delivery of Cas9 ribonucleoprotein. Methods. , 9-15 (2017).
  9. Rezvani, K., Rouce, R., Liu, E., Shpall, E. Engineering Natural Killer Cells for Cancer Immunotherapy. Molecular Therapy. 25 (8), 1769-1781 (2017).
  10. Sutlu, T., et al. Inhibition of intracellular antiviral defense mechanisms augments lentiviral transduction of human natural killer cells: implications for gene therapy. Human Gene Therapy. 23 (10), 1090-1100 (2012).
  11. Viel, S., et al. TGF-beta inhibits the activation and functions of NK cells by repressing the mTOR pathway. Science Signaling. 9 (415), (2016).
  12. Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. Expansion, purification, and functional assessment of human peripheral blood NK cells. JoVE. (48), (2011).
  13. Lee, D. A., Verneris, M. R., Campana, D. Acquisition, preparation, and functional assessment of human NK cells for adoptive immunotherapy. Methods in Molecular Biology. , 61-77 (2010).
  14. Vouillot, L., Thelie, A., Pollet, N. Comparison of T7E1 and surveyor mismatch cleavage assays to detect mutations triggered by engineered nucleases. G3. 5 (3), Bethesda. 407-415 (2015).
  15. Eyquem, J., et al. Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection. Nature. 543 (7643), 113-117 (2017).
  16. Liang, X., et al. Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection. Journal of Biotechnology. 208, 44-53 (2015).
  17. Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
  18. Chmielecki, J., et al. Genomic Profiling of a Large Set of Diverse Pediatric Cancers Identifies Known and Novel Mutations across Tumor Spectra. Cancer Research. 77 (2), 509-519 (2017).
  19. Schultz, L. M., Majzner, R., Davis, K. L., Mackall, C. New developments in immunotherapy for pediatric solid tumors. Current Opinion in Pediatrics. 30 (1), 30-39 (2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

NKNKTGFBR2HPRT1EN138IL21

Похожие статьи