Методическая статья

Чистый метод, основанный на плесень, создания эшафот бесплатный трехмерный сердечной ткани

DOI:

10.3791/58252

⸱

5 августа 2018 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiac Surgery, The First Hospital of Jilin University, 2Division of Cardiac Surgery, Johns Hopkins Hospital

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает метод нетто на основе формы для создания трехмерных бесплатно эшафот сердечной ткани с удовлетворительным структурной целостности и поведение синхронное биений.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает Роман и легко чистый метод на основе формы для создания трехмерной (3-D) сердечной ткани без дополнительных эшафот материала. Человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных кардиомиоцитов (iPSC-CMs), сердечной фибробластов (HCFs), человека пупочную вену эндотелиальных клеток (HUVECs) изолированные и используется для создания суспензии клеток с 70% iPSC-CMs, 15% HCFs и 15% HUVECs. Они совместно культивируемых в системе ультра-низким насадку «висит капля», которая содержит микропоры для конденсации сотни сфероидов в одно время. Клетки агрегировать и спонтанно формируют избиение сфероидов после 3 дней совместного культуры. Сфероидов собирают, семенами в полости формы роман и культивировали в шейкер в инкубаторе. Сфероидов стать зрелой функциональные ткани примерно через 7 дней после посева. Результирующая многослойные ткани состоят из плавленого сфероидов с удовлетворительным структурной целостности и поведением синхронное биений. Этот новый метод имеет многообещающий потенциал воспроизводимость и экономически эффективным методом для создания инженерии тканей для лечения сердечной недостаточности в будущем.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Цель текущего инженерии сердечной ткани является разработка терапии замены или ремонта структуры и функции пораженных тканей миокарда1. Методы для создания моделей 3-D сердечной ткани, экспонирование важные сократительной и электрофизиологические свойства родной сердечной ткани быстро расширяет2,3. Разнообразные стратегии были изучены и использованы в исследованиях4,5. Эти методы варьируются от использования конкретных синтетических и натуральных биоактивных гидрогели, например6желатин, коллаген, фибрина и пептиды, био чернил осаждения технологий2 и подложке технологии7.

Было показано, что леска бесплатные методы могут производить сопоставимые тканей как методы на основе биоматериала, без недостатков включения иностранных леса материала8. Орен Caspi et al. показали, что включение различных видов клеток позволяет поколения высоко васкуляризированной человеческой инженерии сердечной ткани9. Chin et al. разработали метод 3-D печати для создания сердца патч от сфероидов. Результате патчей состоят из кардиомиоцитов, фибробластов и эндотелиальных клеток в 70:15:15 соотношение10. Сфероидов было показано, чтобы быть эффективным «строительные блоки» бесплатно эшафот сердечной ткани творения, как они устойчивы к гипоксии и обладают достаточной механической целостности для имплантации11,12. Предыдущие исследования показали несколько методов изготовления для создания сфероида, включая использование висит drop метод, спиннер колбы13, microfluidic систем14и non сторонник культуры поверхностей без покрытия или с покрытием агарозы микро формы15. В этом протоколе, мы используем висит падение устройство, которое содержит микропоры для конденсации сотни сфероидов в одно время.

Это исследование представляет собой Роман и эффективного эшафот, свободной метод для создания сердечной ткани, которая включает в себя вручную посева сфероидов в полости квадратные формы и инкубации ткани на шейкер для созревания. В условиях обычной статической культуры диффузия кислорода ограничивается внешние аспекты конструкции ткани, что приводит к центральной некроза. Однако с чистой формы, все сфероидов посеяны в плесень погружаются в СМИ с постоянной аэрогидродинамических движения, что позволяет для широкого распространения питательных веществ и кислорода. Кроме того этот метод на основе форм позволяет одновременное создание патчей тканей разного размера с минимальными усилиями ручной и результирующая ткань может быть легко удалена из формы. Этот новый метод позволяет для создания эффективной и воспроизводимые эшафот бесплатно, многослойные сердечной патчей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка кардиомиоцитов

  1. Покройте 6-ну пластины с базальной мембраны матрицы и культуры человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs) как описано17.
  2. Дифференцировать hiPSCs в hiPSC-CMs, используя ранее описанные методы18.
  3. В 16-18 d после дифференциации приостановите кардиомиоцитов, промыв каждой скважины с 2 мл 1 x фосфат амортизированное saline (PBS) без кальция или магния, следуют инкубации с 1 мл/хорошо реагента трипсина или ячейки диссоциации (см. таблицы Материалы) за 5 мин при комнатной температуре.
  4. Нейтрализовать реагент диссоциации трипсина или ячейки (см. Таблицу материалы) с использованием равным объемом Розуэлл парк Мемориальный институт (RPMI) ячейки СМИ дополнена B-27 (RPMI/B-27 ячейки СМИ). Пипетка вверх и вниз, чтобы ослабить любые придерживался клетки.
  5. Собирать приостановлено кардиомиоцитов с 10 мл Серологические Пипетки и перенести их в 50-мл Конические трубки.
  6. Центрифуга суспензию клеток на 250 x g 5 мин при комнатной температуре для получения гранул ячейки.
  7. Ресуспензируйте гранулы в 10 мл RPMI/B-27 клеток средств массовой информации.
  8. Объединить 20 мкл суспензии клеток с равным количеством 0,4% раствора Трипановый синий и осторожно перемешать.
  9. Используйте ручной Горяева для подсчета и получения концентрации и клеток жизнеспособность суспензию клеток.

2. Подготовка фибробластов

  1. Инициируйте культуру человеческого сердца фибробластов (HCF) (взрослый тип желудочков) клеточной линии, как описано ранее,16.
  2. Приостановить HCFs, инкубации их с соответствующим объемом трипсина или ячейки диссоциации реагента (см. Таблицу материалы) для 5 мин при комнатной температуре16. Для T175 колбу был использован 10 mL реагента диссоциации трипсина или ячейки.
  3. Нейтрализовать реагент диссоциации трипсина или ячейки (см. Таблицу материалы) с использованием равный объем среднего, затем передать образец в 50-мл Конические трубки и центрифуги суспензию клеток на 250 x g 5 мин при комнатной температуре для получения Пелле.
  4. Ресуспензируйте гранулы в 10 мл среднего роста фибробластов (см. Таблицу материалы).
  5. Объединить 20 мкл суспензии клеток ЛПУ с равным количеством 0,4% раствора Трипановый синий и осторожно перемешать.
  6. Используйте счетчик автоматизированных клеток или ручной Горяева рассчитывать и получить концентрации и клеток жизнеспособность новых суспензию клеток.

3. Подготовка эндотелиальных клеток

  1. Инициируйте культуру человека пупочную вену эндотелиальных клеток (HUVEC) линии как описано ранее,17. Приостановить HUVECs, инкубации их с соответствующим объемом трипсина или ячейки диссоциации реагента (см. Таблицу материалы) для 3 мин при комнатной температуре17. Нейтрализовать реагент диссоциации трипсина или ячейки (см. Таблицу материалы) с использованием равный объем среднего, затем передать в 50-мл Конические трубки и центрифуги суспензию клеток на 250 x g 5 мин при комнатной температуре для получения гранул.
    Примечание: Для T175 колбу, был использован 10 mL реагента диссоциации трипсина или ячейки.
  2. Ресуспензируйте гранулы в 10 мл средний рост эндотелиальных клеток (см. Таблицу материалы).
  3. Объединить 20 мкл суспензии HUVEC и выведение его с равным количеством 0,4% раствора Трипановый синий и осторожно перемешать.
  4. Используйте счетчик автоматизированных клеток или ручной Горяева рассчитывать и получить концентрации и клеток жизнеспособность суспензию клеток.

4. Создание висит сфероидов падение

  1. Место висит падение устройство, которое содержит 850 микропоры (каждый с диаметром 350 мкм) в стерильных пластин 6-хорошо.
  2. Выделить три типа клеток, как описано выше: hiPSC-CMs, HCFs и HUVECs. Комбинировать их в соотношении 70% iPSC-CMs, HCFs 15% и 15% HUVECs в 50-мл Конические трубки с RPMI/B-27 ячейки СМИ в концентрации 2,475,000 клеток / мл.
  3. Отказаться от 4 мл суспензии клеток (2,475,000 клеток / мл) для каждой скважины ультра-низким уровнем вложения висит падение системы (с диаметром своих 350 мкм) сидит в пластине 6-хорошо.
  4. Сфероидов сформирует спонтанно в течение 12 ч дозирования суспензии клеток в висит падения устройства. Продолжать культуры для в общей сложности 72 ч (3 d) при 37 ° C, 5% CO2и 95% влажности для созревания сфероидов.
  5. После 72 ч культуры, урожай сфероидов через поры в нижней части висит падение системы, поместив устройство в блюдо с среднего и закрученной это осторожно, чтобы освободить от висячих сфероидов падения устройства.

5. 3-D патч создание с помощью Роман чистой формы

  1. База, квадратный днище, дно чистой и 10 слоистых стороны сетей собираются для создания плесени роман с помощью пары стерильный пинцет. Во-первых стек и выравнивание база, днище квадратных и снизу net с помощью угловых опорах. Затем укладывают и слой 10 сторона сетки в чередуя направления для создания чистой тонкой зубцов из нержавеющей стали.
  2. Промойте наполнение базы с PBS или среднего для уменьшения поверхностного натяжения и, затем, литформы собран на базе наполнения.
  3. Влажной чистой формы полости с PBS или среднего в одном методе. Медленно заполнить сфероидов в полость предполагает нужного размера (2 x 2 x 1 мм, 4 x 4 x 1 мм, или 6 x 6 x 1 мм).
    Примечание: Убедитесь, что 120% от ожидаемого объема сфероидов подается в полость, так что клетки агрегаты находятся в тесной связи и оставаться статической.
  4. Соберите чистой верхней и верхней площади пластину на угловых опорах и пробки и трубы Холдинг для предотвращения вымывания сфероидов.
  5. Передача системы заполненную чистой формы 6-ну плита с 6 мл RPMI/B-27 ячейки СМИ или в стерильный контейнер с достаточно среднего, чтобы покрыть весь собранный плесень.
  6. Инкубируйте пластину 6-колодец с системой заполненные формы на размахивая шейкер для 7-10 дней в 3000-4000 x g.
    Примечание: Продолжительность инкубационного определяется размер сердца патчей. С больших патчей время инкубации будет нужно быть увеличена для созревания сердечной патч.

6. Удаление патч от романа чистой формы

  1. Удалить плесень системы из средств массовой информации и поместите его на коврик стерилизованные обработки в стерильные 10 см блюдо.
  2. Снимите трубку Холдинг, пробки, квадратный плиту и топ нет. Осторожно выдвиньте слоистых стороне сетки по одному с парой стерильный пинцет. После decannulation нетронутыми сердца патч получается на вершине чистой нижней.
  3. Выбрать вверх дно чистой с патч с помощью стерильный пинцет и передачи дно чистой в 35-мм блюдо с 5 мл RPMI/B27 средств массовой информации. Осторожно ослабьте патч от нижней чистый, медленно кружась в сети в блюдо, или с стерильных ячейки скребок. После отсоединения от дна чистой сердечной ткани можно культивируемых с RPMI/B27 средствами массовой информации.
  4. Продолжать инкубировать свободно плавающего 3-D сердца патч в 35-мм блюдо. Функциональные синхронное биений может наблюдаться 24 h в кратчайшие сроки после удаления из формы.
  5. После удаления патча от чистой формы, отмечают, что его форма поддерживается целостность и интенсивность синхронных избиение увеличивается с течением времени.
    Примечание: 3-D чистой основе плесень патчи сердечной выставлены электрические интеграции компонента cardiospheres после decannulation. Мы наблюдали избиение частотой от 60 до 80 ударов в минуту, которая сохраняется в течение более чем 60 дней.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В наших экспериментах мы использовали суспензию клеток и 70% iPSC-CMs, 15% HCFs, 15% HUVECs в средствах массовой информации клетки RPMI/B-27 в концентрации 2,475,000 клеток / мл. После создания суспензии клеток, мы обойтись 4 мл суспензии клеток в каждой скважине ультра-низким уровнем вложения висит падение системы, как описано в шаге 4.3 протокола. Использование подвесной системе падение привело спонтанного формирования сотни избиение сфероидов после 3 дней культуры при 37 ° C, 5% CO

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Значение этого метода заключается в его воспроизводимости и эффективности результирующая многослойных сердечной ткани. В области инженерии сердечной ткани одна из целей текущей является определение метода для построения избиение, многослойных и функциональных 3-D сердца патчей. Мы приводим эффективным и воспроизводимый метод создания многослойных сердечной ткани путем прямого ручного посева сфероидов, состоящий из кардиомиоцитов, эндотелиальных клеток и фибробластов в Роман чистой формы. Чистой формы, используемые в этом...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы признают следующие источник финансирования: Фонд магии что вопросы для сердечно-сосудистых исследований.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Фибробласты сердца человека (HCF)Sciencell6310
FM-2 Состоит из базальной средыSciencell2331Культуральная среда HCF
Эндотелиальные клетки пупочных вен человека (HUVEC)LonzaCC-2935
EGM+Bullet Kit LonzaCC5035HUVEC питательная среда
E8 media ИнвитрогенA1517001культуральная среда HiPSC
Geltrex InvitrogenA1413202
TrypLE Express Enzyme (1X)Thermo Fisher12604013Реагент трипсина и диссоциации клеток
RPMI mediaInvitrogen11875093RPMI media с добавкой B-27 - это культуральная среда hiPSC-CM
добавка B-27 (50x)Thermo Fisher17504044RPMI среда с добавкой B-27 - это питательная среда hiPSC-CM
Trypan Blue Раствор, 0,4%Thermo Fisher15250061
Новая сетчатая форма TissueByNet Co.,LtdNM25-1
Подвесная откидная пластинаKuraray Co.,LtdMPc350
6-луночные пластины Сигма-ОлдричCLS-3516

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gao, L., et al. Myocardial Tissue Engineering With Cells Derived From Human-Induced Pluripotent Stem Cells and a Native-Like, High-Resolution, 3-Dimensionally Printed Scaffold. Circulation Research. 120 (8), 1318-1325 (2017).
  2. Borovjagin, A. V., Ogle, B. M., Berry, J. L., Zhang, J. From Microscale Devices to 3D Printing: Advances in Fabrication of 3D Cardiovascular Tissues. Circulation Research. 120 (1), 150-165 (2017).
  3. Tandon, N., et al. Electrical stimulation systems for cardiac tissue engineering. Nature Protocols. 4 (2), 155-173 (2009).
  4. Duran, A. G., et al. Regenerative Medicine/Cardiac Cell Therapy: Pluripotent Stem Cells. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 66 (1), 53-62 (2018).
  5. Lux, M., et al. In vitro maturation of large-scale cardiac patches based on a perfusable starter matrix by cyclic mechanical stimulation. Acta Biomaterialia. 30, 177-187 (2016).
  6. Eschenhagen, T., et al. Three-dimensional reconstitution of embryonic cardiomyocytes in a collagen matrix: a new heart muscle model system. The FASEB Journal. 11 (8), 683-694 (1997).
  7. Moldovan, N. I., Hibino, N., Nakayama, K. Principles of the Kenzan Method for Robotic Cell Spheroid-Based Three-Dimensional Bioprinting. Tissue Engineering Part B: Reviews. 23 (3), 237-244 (2017).
  8. Sugiura, T., Hibino, N., Breuer, C. K., Shinoka, T. Tissue-engineered cardiac patch seeded with human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes promoted the regeneration of host cardiomyocytes in a rat model. Journal of Cardiothoracic Surgery. 11 (1), 163(2016).
  9. Caspi, O., et al. Tissue engineering of vascularized cardiac muscle from human embryonic stem cells. Circulation Research. 100 (2), 263-272 (2007).
  10. Ong, C. S., et al. Biomaterial-Free Three-Dimensional Bioprinting of Cardiac Tissue using Human Induced Pluripotent Stem Cell Derived Cardiomyocytes. Scientific Reports. 7 (1), 4566(2017).
  11. Kelm, J. M., et al. A novel concept for scaffold-free vessel tissue engineering: self-assembly of microtissue building blocks. Journal of Biotechnology. 148 (1), 46-55 (2010).
  12. Noguchi, R., et al. Development of a three-dimensional pre-vascularized scaffold-free contractile cardiac patch for treating heart disease. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 35 (1), 137-145 (2016).
  13. Zuppinger, C. 3D culture for cardiac cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (7 Pt B), 1873-1881 (2016).
  14. Langenbach, F., et al. Generation and differentiation of microtissues from multipotent precursor cells for use in tissue engineering. Nature Protocols. 6 (11), 1726-1735 (2011).
  15. Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).
  16. Agocha, A., Sigel, A. V., Eghbali-Webb, M. Characterization of adult human heart fibroblasts in culture: a comparative study of growth, proliferation and collagen production in human and rabbit cardiac fibroblasts and their response to transforming growth factor-beta1. Cell Tissue Research. 288 (1), 87-93 (1997).
  17. Baudin, B., Bruneel, A., Bosselut, N., Vaubourdolle, M. A protocol for isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells. Nature Protocols. 2 (3), 481-485 (2007).
  18. Pimentel, C. R., et al. Three-dimensional fabrication of thick and densely populated soft constructs with complex and actively perfused channel network. Acta Biomaterialia. 65, 174-184 (2018).
  19. Shimizu, T., et al. Polysurgery of cell sheet grafts overcomes diffusion limits to produce thick, vascularized myocardial tissues. The FASEB Journal. 20 (6), 708-710 (2006).
  20. Sakaguchi, K., Shimizu, T., Okano, T. Construction of three-dimensional vascularized cardiac tissue with cell sheet engineering. Journal of Controlled Release. 205, 83-88 (2015).
  21. Ong, C. S., et al. Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting. Journal of Visualized Experiments. 125 (e55438), (2017).
  22. Tan, Y., et al. Cell number per spheroid and electrical conductivity of nanowires influence the function of silicon nanowired human cardiac spheroids. Acta Biomaterialia. 51, 495-504 (2017).
  23. Karra, R., Poss, K. D. Redirecting cardiac growth mechanisms for therapeutic regeneration. Journal of Clinical Investigation. 127 (2), 427-436 (2017).
  24. Bartholoma, P., et al. Three-dimensional in vitro reaggregates of embryonic cardiomyocytes: a potential model system for monitoring effects of bioactive agents. Journal of Biomolecular Screening. 10 (8), 814-822 (2005).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

iPSC CMs HCFs HUVECs

Похожие статьи