ADIPO ясно: Ткани, очистка метод для трехмерных изображений жировой ткани

Summary

Из-за содержания высоким липидов жировой ткани была сложной для визуализации с использованием традиционных гистологических методов. ADIPO-ясно является очистка техника, позволяющая надежной маркировки и высоким разрешением объемные флуоресцентных изображений жировой ткани ткани. Здесь мы описываем методы для пробоподготовки, предварительной обработки, окраски, очистки и монтажа для воображения.

Abstract

Жировой ткани играет центральную роль в энергетического гомеостаза и терморегуляции. Он состоит из различных типов адипоциты, а также Адипоцит прекурсоров, иммунных клеток, фибробластов, кровеносных сосудов и нервных прогнозов. Хотя молекулярный контроль спецификации типа клеток и как взаимодействуют эти клетки были более разграничены, более полное понимание этих клеток жировой резидент может быть достигнуто путем визуализации их распределения и архитектура на протяжении всей ткани. Существующие подходы иммуногистохимии и иммунофлюоресценции для анализа жировой гистология полагаются на парафин врезанных шлифов. Однако шлифов захватить только небольшую часть ткани; в результате выводы могут быть предвзятым, какая часть ткани анализируется. Поэтому мы разработали жировой ткани, очистка техника, Adipo-ясно, чтобы разрешить всеобъемлющей трехмерной визуализации молекулярных и клеточных структур в целом жировой ткани. ADIPO-ясно был адаптирован от iDISCO / iDISCO +, с конкретными изменениями до полностью удалить липидов, хранящиеся в тканях при сохранении собственных тканей морфологии. В сочетании с свет лист флуоресцентной микроскопии мы здесь демонстрируют использование метода Adipo-Clear для получения объемного изображения с высоким разрешением всего жировой ткани.

Introduction

До недавнего времени, жировой ткани был задуман как аморфный коллекции жировых клеток. За последние несколько десятилетий наше понимание выросло более сложные, с жиром, теперь признается сложный орган, содержащих различные типы адипоциты, а также Адипоцит прекурсоров, иммунных клеток, фибробластов, сосудистую и нерва прогнозы. Взаимодействие между эти клетки жировой резидентов произнесли воздействие на научные физиологии и патофизиологии¹и жировой ткани. Хотя новые исследования разгадана важные молекулярные механизмы, лежащие в основе некоторых взаимодействия, более полное понимание требует надежных структурных профилирования всей ткани в трех измерениях (3D).

Наши текущие знания о морфологии жировой ткани во многом основывается на гистологический анализ тонких секций (5 мкм) с относительно высокого увеличения изображений (более чем 10 X)^2,3. Однако этот подход имеет несколько существенных ограничений. Во-первых, замысловатые нитевидные структуры, такие как симпатические нервы и сосудистую, которые, как известно, играют важную роль в жировой функция^4,5,6,7, трудно оценить через тонкие разделы. Во-вторых благодаря его казалось бы аморфной форме и отсутствие представителей структурных подразделений сосредоточиться на, трудно оценить жировой ткани структуры, основанные только на раздел пятнать. В-третьих жировая ткань имеет содержание очень высоким липидов, создавая проблемы в получении последовательной серийный секций, которые подходят для 3D анатомические реконструкции, традиционным методом, используется для изучения морфологии весь мозг⁸. Учитывая эти факторы, существует большая потребность в целом гора подход, который может обеспечить 3D визуализация всего жировых депо по-прежнему достигая сотовой резолюции.

3D объемного изображения всего органа является сложной задачей вследствие сокрытия эффекта рассеивания света. Основным источником рассеяние света в биологических тканях происходит от липидов водный интерфейсов. Хотя усилия по ликвидации разброса, удалив липиды были постоянной для более века, было большое количество последних инноваций⁹. Один из таких недавно разработанный метод ткани очистка является immunolabeling с поддержкой 3D визуализации растворителя очищены органов (iDISCO / iDISCO +)^10,11. Однако, жировой ткани представляет собой особую проблему, учитывая ее высокий уровень липидов и, следовательно, дополнительные изменения в iDISCO / iDISCO + протокола обязаны полностью извлечь липиды защищая ткани от разрушения. Измененный Протокол, которую мы разработали, теперь называется Adipo-ясно, работают на основе метанол/дихлорметан delipidation жировой ткани для достижения оптимальной транспарентности подходит для высокого разрешения объемных изображений¹². Потому что delipidation шаг во многом утоляет эндогенно выразил флуоресцентные белки, например GFP и ППП, визуализации таких белков должна быть достигнута путем immunolabeling. В целом, это простой и надежный протокол могут быть применены для изучения тканевом уровне Организации клеток жировой резидент, трассировки линии Адипоцит прогениторных клеток и жировой морфогенеза во время разработки.

Protocol

Уход за животными и эксперименты были проведены в соответствии с процедурами, утвержденными на институциональный уход за животными и использования Комитетом Университета Рокфеллера.

1. Подготовка тканей

1. Выполните стандартные внутрисердечной перфузии с ~ 20 мл 1 x фосфатный буфер (PBS) при 4 ° C до тех пор, пока кровь полностью удаляется из ткани.
2. Переключитесь в perfusate ~ 20 мл раствора (параформальдегида 4% (PFA) в однократном ПБС) фиксирующие при температуре 4 ° C до тех пор, пока шею и хвост значительно усилены.
   Предупреждение: PFA является токсичным. Избегайте контакта с кожей, глазами и слизистыми оболочками. Решения должны быть сделаны внутри зонта.
3. Вскрыть жировых отложений интерес тщательно, чтобы удалить весь жировой ткани без его повреждения. Используйте туп законченному пинцет, чтобы избежать щипать или сжимая ткани. Избегайте загрязнения Иссеченную ткань с любой мех.
4. После исправления ткани в 4%, PFA в однократном ПБС на ночь при 4 ° C. Для каждого жировой ткани, после исправления с ~ 10 мл раствора фиксации в 15 мл Конические трубки.
5. Вымойте ткань 3 раза (по 1 ч) с ПБС при комнатной температуре (RT).
6. Магазин тканей для краткосрочных (до 2 недель) в однократном ПБС на 4 ° C и защищены от света. Для длительного хранения (например, 1-2 лет) переключитесь в буфере 1 x PBS с азидом натрия 0.05% (в качестве консерванта).
   Предупреждение: Азид натрия является высокотоксичным, когда внутрь или впитывается через кожу. В основном азид натрия, что решения (на 5% или выше) должны быть обработаны под вытяжного шкафа.

2. Delipidation и Permeabilization

Сроки: 1-2 дня

1. Подготовка 20%, 40%, 60% и 80% метанола градиент с B1n буфера (Таблица 1) (v/v), например, 20% Метанол/B1n буфера, смешать 20 мл метанола и 80 мл буфера B1n. Хранить все буферы при 4 ° C. Глицин кристаллы будет выпадать в осадок от 60% и 80% метанол/B1n буферов из-за насыщения. Избегайте удаления кристаллы; Используйте жидкий раствор для следующих стирок.
   Предупреждение: Метанол летучих, раздражающее и легковоспламеняющимися. Избегайте кожу или глаза.
2. Осторожно удалите волосы из образца под микроскопом рассечение. Волосы, Линт или мусора, прилагается к образцу приведет к тени во время визуализации. Перевести уборка образца в новой трубки.
3. Выполните все следующие шаги на льду или на 4 ° C, если не указано иное. Для небольших образцов (например, задняя подкожной/perigonadal жировых отложений от молодых худой мышей) использовать 2 мл microcentrifuge трубы с 1,6 мл раствора. Для больших образцы или пробы с высоким липидов содержание (например, жировых отложений с ожирением мышей) используйте 5 мл пробирок с 4 мл раствора.
   1. Место пробирки, содержащие образцы горизонтально на орбитальный шейкер на ~ 100 об/мин. Убедитесь, что образцы могут свободно перемещаться внутри трубки.
4. Обезвоживает образца в градуированных серии 20%, 40%, 60%, 80% и 100% метанол/B1n буфера для указанного времени (Таблица 2). Перенос решения свести к минимуму.
5. Delipidate образца с 100% Дихлорметан (DCM) (3 раза), каждый с время инкубации указано в таблице 2. Образец должен опускаться на дно трубки в конце второго и третьего DCM стирок. Если не продлить время инкубации обеспечить полное delipidation (например, простираются от 30 мин до 1-2 ч).
   Предупреждение: DCM должно обрабатываться внутри зонта. Используйте стеклянные контейнеры для хранения и microcentrifuge трубок, которые сделаны из полипропилена для инкубации. Microcentrifuge трубы не должен использоваться для долгосрочного хранения DCM. Петри и серологические пипетки, которые изготавливаются из полистирола не совместимы с DCM. Система DCM является крайне неустойчивым. Передача образцов в свежий раствор быстро для предотвращения высыхания.
6. Мыть дважды с 100% метанола для указанное время (Таблица 2).
7. Необязательно: Если образец не является хорошо перфузии, цвет гемоглобина от остальных красных кровяных клеток может привести к сильным аутофлюоресценция. Отбеливатель с 5% H₂O₂ в метаноле (1 объем 30% H₂O₂ до 5 объемов метанола) на ночь при 4 ° C.
8. Увлажняет образца в обращенном метанол/B1n серии буфера: 80%, 60%, 40%, 20% Метанол/B1n и 100% B1n буфера (2 раза) за указанное время (Таблица 2).
9. Помойте образец с PTxwH буфера (Таблица 1) за 2 ч на RT.
10. Хранить в delipidated образце в буфер PTxwH на 4° C (до 1 года) или сразу перейти к шагу иммуноокрашивания.

3. Вся гора иммуноокрашивания

Время: 8-10 дней

Примечание: Все следующие шаги должны осуществляться в RT если не указано иное, тряски и защиту от света. Для малых выборок используйте 2 мл microcentrifuge трубы с 1,6 мл раствора. Для больших выборок используйте 5 мл пробирок с 4 мл раствора. Рекомендуется сначала проверить антител на мелкие кусочки ткани или лечить метанола тканей секций.

1. Разбавьте основное антитело в буфер PTxwH Рекомендуемые концентрации. Центрифуга разбавленные антитела решение на ~ 20000 x g 10 мин для предотвращения введения преципитаты антитела или агрегатов.
2. Инкубации образца delipidated раствором основное антитело для указанного времени (Таблица 2).
3. Вымойте образца с PTxwH буфер в серии инкубационного шагов: 5 мин, 10 мин, 15 мин, 20 мин, 1ч, 2 h, 4 h и ночлег.
4. Разбавьте вторичное антитело в буфер PTxwH Рекомендуемые концентрации. Центрифуга разбавленные антитела решение на ~ 20000 x g 10 мин для предотвращения введения преципитаты антитела или агрегатов.
   Примечание: Чтобы избежать высокой фоновой, вызванные ткани аутофлюоресценция, рекомендуются вторичные антитела, конъюгированных с флуорофоров, которые излучают свет в красный и far-red регионах. В зависимости от количества имеющихся на микроскопе лазерных линий вплоть до 3-4 маркеры могут быть imaged одновременно в одном образце.
5. Инкубации образца с решением вторичное антитело для указанного времени (Таблица 2).
6. Вымойте образца с PTxwH буфер в серии инкубационного шагов: 5 мин, 10 мин, 15 мин, 20 мин, 1ч, 2 h, 4 h и ночлег.
7. Необязательно: Для типов ткани, которые являются хрупкими, исправьте окрашенных тканей с 4% ПФА в 1 x PBS на ночь при 4 ° C, чтобы помочь сохранить ткани морфологии.
   Примечание: Этот шаг может увеличить изображения фона. Нет необходимости выполнять этот шаг для жировой ткани.
8. Вымойте образца с ПБС в серии инкубационного шагов: 5 минут, 10 минут и 30 мин.
9. Осторожно удалите волокна из образца под микроскопом рассечение.

4. ткань очистка

Сроки: 1-2 дня

1. Дополнительно: Внедрите образца в агарозы для облегчения монтажа образцов для микроскопии свет лист.
   Примечание: Этот шаг настоятельно рекомендуется для жировой ткани стабилизировать свою форму во время визуализации.
   1. Подготовка внедрения решения с агарозы 1% в 1 x PBS (w/v). Прохладный внедрения решения ~ 40 ° C, чтобы избежать разоблачения образца к чрезмерному нагреванию.
   2. Место уборка образца в форму (например, Петри или весом лодка) и организовать его в нужное положение. Избегайте любых жидких уноса. Осторожно залейте пример внедрения решения. Избегайте любых воздушных пузырьков.
   3. Пусть полностью затвердеть на RT. Cut, блок, содержащий образец агарозы.
      Примечание: Все следующие шаги, включая ночи инкубаций должно осуществляться на RT, тряски и защиту от света. Для малых выборок используйте 2 мл microcentrifuge трубы с 1,6 мл раствора. Для больших выборок используйте 5 мл пробирок с 4 мл раствора.
2. Обезвоживает образец градиента метанола с H₂O: 25%, 50%, 75% и 100% (3 раза) за указанное время (Таблица 2).
   Примечание: Образец можно оставить на ночь на шаге 100% метанола.
3. Проинкубируйте образцы в 100% DCM для 1 h встряхивании (3 раза). Образец должен опускаться на дно трубки в конце каждого мытья DCM. Если нет, то продлить время инкубации для обеспечения полного удаления метанола. Образец можно оставить на ночь на шаге DCM 100%.
4. Проинкубируйте образца в dibenzyl эфира (DBE) на ночь с мягкий встряхивания для достижения соответствия преломления.
   Примечание: Образец в конечном итоге станет прозрачной в видимый свет.
   Предупреждение: Опасно DBE. Избегайте любого контакта с кожей. Обрабатывать внутри Зонта с двухслойной перчатки. Как только она загрязнена DBE отбросить перчатки. Используйте стеклянные контейнеры для хранения и microcentrifuge трубы (полипропилен) для инкубации. Microcentrifuge трубы не должны использоваться для долгосрочного хранения DBE. Петри и серологические пипетки, которые изготавливаются из полистирола не совместимы с DBE. Очистите любой разлив с 100% этанола.
5. Инкубировать образца с свежими DBE с мягкой встряхивания в течение 2 ч. магазин образца на RT в темноте, или перейти непосредственно к визуализации.
   Примечание: Образцы рекомендуется для отображаемого в течение месяца. Хотя некоторые флуорофоров более устойчивы, чем другие, длительного хранения образцов на данном этапе не рекомендуется.

5. микроскопия

1. Обработка изображений с помощью микроскопа свет лист, который совместим с DBE.
   Примечание: Только цели, которые утверждены для органических растворителей воображения и сопоставлены с индексом преломления DBE может использоваться как окунать целей в погружении DBE изображений.
   1. Смонтируйте агарозы встроенный образец на держатель, который может предотвратить движение во время визуализации. Погрузите образец в камере DBE-заполнены.
   2. Собирайте z стека, охватывающих весь образец (например, 1-2-кратном) для получения структура состава ткани распределения маркера интерес.
   3. Переключитесь на цель с большим увеличением (например, 4-12 крат) для увеличения регионах, представляющих интерес для изображения подробной структуры.
      Примечание: Коллаген является крупный вклад внеклеточного матрикса жировой ткани, которая окружает все жировые клетки¹³. Коллаген имеет типичный спектр излучения, начиная около 400 Нм до 550 Нм¹⁴. Визуализации образца с 488 лазерной линии (зеленый) и собирая испускаемого света в диапазоне длин волн, которая лежит внутри спектр излучения коллагена (например, 525-550 Нм) даст сигнал аутофлюоресценция ткани, который ранее был показан в разграничить контур жировых клеток и общая архитектура ткани¹².
2. Изображений с Перевернутый конфокальный или двух Фотон микроскопа.
   1. Место агарозы встроенный образец в камере слайд с низа стекла без касатьться любых пластиковых деталей (или другие DBE-совместимых тепловизионные камеры, что можно запечатать). Убедитесь, что DBE не утечки.
   2. Выбор цели с расстояния работы для достижения более глубокого проникновения.
      Примечание: Изображения должно быть сделано с инвертированным микроскопом конфокальный или два Фотон через стекло нижней палаты слайда. Избегайте прямого контакта между образцом и окунать целей, которые не предлагаются на основе DBE изображений.

Results

ADIPO-ясно подготовлен весь жир, что колодки могут отражаться в 3D, чтобы проанализировать влияние ткани морфологии и сотовых взаимодействий в Штатах худой и ожирением. Этот метод может применяться легко анализировать общую структуру жировой, собирая ткани аутофлюоресценция сигнала в зелёном канале. Ранее мы показали что аутофлюоресценция сигнал в жировой оверлеи благоприятно с perilipin, окрашивание, часто используемый маркер наметить Зрелые адипоцитов¹². Например...

Discussion

ADIPO-ясно-это простой и надежный метод для очистки жировой ткани, который может быть легко выполнена в регулярных лабораторной установки. По сравнению с другие методы расчистки на основе растворителей, таких как iDISCO / iDISCO +^10,11,12, Adipo-ясно особенно оптимизирован для очистки жировой ткани и других тканей с высоким содержанием жира. Шаг delipidation полностью удаляет липиды из жировой и таким образом облегчает immunolab...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x фосфатный буферный физиологический раствор	Corning	21-040-CV
Параформальдегид	Сигма Олдрич	P6148-1KG
Метанол	Фишер Scientific	A412SK-4
Тритон X-100	Сигма Олдрич	X100-500МЛ
Подросток 20	Сигма Олдрич	P2287-500МЛ
Гепарин	Сигма Олдрич	H3393-100KU
Дихлорметан	Sigma Aldrich	270991
перекисью водорода 30%	Fisher Scientific	325-100
Бензиловый эфир	Sigma Aldrich	108014
Агарозный	инвитроген	16500500
азид натрия	Sigma Aldrich	71289-5G
глицин	Fisher Scientific	BP381-1
Кролик поликлональный антитирозингидроксилаза	Millipore	AB152	разведение 1:200
Козий поликлональный анти-CD31/PECAM-1	R& D Systems	AF3628	Конечная концентрация 2 & микро; г/мл
Крысиный моноклональный анти-CD68, клон FA-11	Bio-Rad	MCA1957	Конечная концентрация 2 & микро; г/мл
Ослиный противокроличий IgG (H+L) Alexa Fluor 647	Jackson ImmunoResearch	711-605-152	Конечная концентрация 5-10 &m; г/мл
Ослиный антикозий IgG (H+L) Alexa Fluor 568	Invitrogen	A11077	Конечная концентрация 5-10 &; г/мл
Ослиный антикрысиный IgG (H+L) Alexa Fluor 647	Jackson ImmunoResearch	712-605-153	Конечная концентрация 5-10 &m; g/mL
Камера визуализации	ibidi	80287
Световой листовой микроскоп	LaVision BioTec	Ultramicroscope II
Программное обеспечение для визуализации	LaVision BioTec	Imspector Программное обеспечение
для микроскопии Программное обеспечение для визуализации	Bitplane	Imaris