Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Антигенные липосом для поколения болезни специфические антитела

11.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/58285

⸱

25 октября 2018 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Janssen R&D, 2Department of Microbiology and Immunology, University of North Carolina, 3UNC Food Allergy Initiative, University of North Carolina, 4Department of Pediatrics, University of North Carolina, 5Department of Chemistry, University of Alberta, 6Department of Molecular Medicine, Scripps Research Institute, 7Department of Medical Microbiology and Immunology, University of Alberta

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Описал является подготовка антигенной липосомальных наночастиц и их использования в стимулировании B-клетки активации в пробирке и в естественных условиях. Последовательный и надежный антител привело к разработке новой модели арахиса аллергии. Протокол для генерации антигенной липосомы может распространяться на различные антигены и иммунизации модели.

Аннотация

Реакции антитела обеспечивают критические защитный иммунитет к широкий спектр патогенных микроорганизмов. По-прежнему существует большой интерес в создании надежной антитела для вакцинации а как понять как патогенные антител реакции развиваются в аллергии и аутоиммунные заболевания. Создание надежной антиген специфические антитела ответы не всегда является тривиальным. В моделях мыши это часто требует нескольких раундов иммунизации с адъювантом, что приводит к большой изменчивости уровня индуцированного антител. Одним из примеров является в моделях мыши аллергии арахиса, где было бы целесообразно более надежных и воспроизводимых моделей, которые сводят к минимуму мыши чисел и использование адъювантов. Представленные здесь представляет собой высокую воспроизводимость мыши модель арахиса аллергии анафилаксии. Эта новая модель основывается на двух ключевых факторов: (1) антиген специфические splenocytes восприимчивую передаются из сенсибилизированных арахисовое мыши в наивной получателей мышь, нормализующее количество антиген специфические памяти - и Т-лимфоцитов через большое количество мышей; и (2) получателя мышей впоследствии увеличила с сильным многовалентных immunogen в виде липосомальных наночастиц, отображение крупных Арахис Аллерген (h 2 Ара). Основным преимуществом этой модели является его воспроизводимости, который в конечном итоге снижает количество животных, используемых в каждом исследовании, при сведении к минимуму количество животных, получать множественные инъекции адъювантной. Модульная сборка этих иммуногенность липосомы обеспечивает относительно легкая адаптируемость к другие аллергические либо аутоиммунные модели, включающие патогенных антител.

Введение

Пищевая аллергия влияет на 8% детей в Соединенных Штатах и увеличилась в распространенности в последние десятилетия1. Аллергия на арахис влияет на 1% детей и не является обычно перерос2. Хотя несколько перспективных клинические испытания проводятся для лечения пищевой аллергии, включая устное иммунотерапия (ОИТ), сублингвального иммунотерапия (ЩЕЛИ) и иммунотерапия epicutaneous (EPIT), в настоящее время есть нет стратегии лечения, FDA утвержденных для десенсибилизирующее арахиса аллергические люди3,4,5,6,,78. Таким образом аллергические люди должны строго избегать аллергенов, чтобы избежать анафилаксии. Многие вопросы остаются относительно маршрутов сенсибилизации и лежащих в основе механизмов развития пищевой аллергии.

Модели мыши являются ценным инструментом для изучения механизмов аллергии, а также разработки новых tolerogenic и десенсибилизации терапии9,10,,1112. Это особенно верно потому, что крупные Арахис Аллерген (Ара h 2; Ah2) в организме человека также является доминирующей Аллерген в нескольких описал мыши модели,1314. В то время как мыши модели арахиса аллергии являются бесценными в изучении механизмов информирования и терпимости, недостаток заключается в том, что они могут быть переменной и требуют использования адъювантов. Более мощным иммуногенов бы одним из способов минимизировать внутреннюю изменчивость таких моделей. Так как B-клетки активируются сильно многовалентных антигены, антигенных липосомы, отображение Аллерген являются хорошим вариантом из-за их способности потенциально активировать B-клетки через B-клеточного рецептора (BCR), а также имея собственность эффективно Грунтовка отсеке Т-клеток через принимаемые-специфически антиген представляющих клеток.

Здесь мы описываем подробный протокол для спрягать белков антигенов в липосомальных наночастиц с помощью снисходительный и модульной стратегии. Использование суррогатных антиген, анти IgM Fab фрагмента, мы показываем, как мощный, в стимулировании активации B-клеток может быть такой антигенной липосомы. Антигенные липосомы, отображение Ah2 антигена были использованы для разработки новой модели мыши наделяют чувствительности. В этой модели splenocytes от проверенных арахиса аллергия мышей, содержащий памяти - и Т-лимфоцитов, зависящие от ореховое переносятся в наивной congenic мышей. Памяти антител ответы являются индуцированных инъекций липосом, конъюгированных с Ah2 в получателя мышей, с тем чтобы побудить антител против Ah2. Следуют только один импульс с растворимых Ah2 Ah2-специфические антитела порождают сильное анафилактические реакции когда этих мышей впоследствии оспорены с Ah2. Как мышей, проходят аллергические реакции реагирования в весьма единообразно и не получили адъювант, такой подход является желательным арахиса аллергии модель и результаты показывают, что он может иметь утилита в других моделях мыши, движимый антигены, направленных на аллергены и, возможно, autoantigens.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Общий метод сцепления белка липидов и включения в липосомах основывается главным образом на более ранние работы15. Все животные описанные ниже были одобрены в университете Северной Каролины в Чапел-Хилл институциональный уход животных и использования Комитет (IACUC). Все мыши, используемых в модели арахиса аллергии являются женщины BALB/cJ, приобретенные на 3-недельного возраста. Уход за животными университета Альберты и использовать Комитет (ACUC) одобрил эксперименты с использованием мыши селезенки ex vivo анализа от мышей C57Bl/6 по крайней мере 6 недель.

1. спряжение антигена протеина до Пегилированный липидов

  1. Добавьте 3 g сшитого декстрана гель бусинки с фракционирования, спектр 1500 – 30 000 дальтон (Da) 250 мл термос. Добавьте 60 мл-фосфатный буфер (PBS) и постоянно перемешивать с баром магнитные перемешать. Уплотнение флакон и прикрепить к вакууму инициировать де газообразования на перемешать пластины как минимум на 1 час.
  2. В столбце хроматографии стекла 1.0 x 30 см с оборота пробку закрыт добавьте PBS в столбце мыть. Откройте оборота пробку и слейте столбец. После стирки, добавьте пульпы де газированные бусины в столбец. Постоянно добавьте навозной жижи, до тех пор, пока столбец упакован борта высотой около 24 см.
  3. После того, как столбец имеет «голова» приблизительно 4-5 см по PBS выше Упакованные бусы, имеют следующие шаги готов.
    1. Создание потока сифон тяжести путем измерения кусок трубки достаточно долго, чтобы достичь полка 1 – 2 футов выше верхней части колонны и создать цикл, который падает в нижней части столбца и возвращает в верхней части столбца. Добавьте оборота пробку в один конец трубки, оставляя одну сторону трубы открытым. Поместите конец открытой трубой в 500 мл бутылка PBS и место на полке над столбцом.
    2. Возьмите конец с оборота пробку и присоединить шприц 10 мл. Открыть клапан стопор оборот на линии труб и рисовать PBS через трубку. Как только PBS достиг три четверти пути через трубку, быстро удалить шприц и добавить оборота пробку в верхней части столбца — жидкость должна быть запущена на столбец.
      Примечание: Количество «голова» PBS слева вверху столбца должно быть между 1 и 3 см. Минимальная сумма для промойте колонку-3 колонки тома.
  4. Определите количество белка (родинки) связаны с липидов, основанный на его молекулярной массы (МВт).
    Примечание: Fab фрагмента коза анти мыши IgM (сам IgG) используется здесь как универсальный суррогатной антигена для стимуляции polyclonal B-клеток. Соответственно Fab фрагмента коза IgG имеет МВт приблизительно 48 kiloDalton (кДа) и коммерчески доступна в общее количество 1,3 мг. Таким образом количество белка связаны — 27,1 мкмоль.
  5. Определите Коэффициент вымирания протеина интереса. Если неизвестно, измерения поглощения белков на 280 Нм, используя спектрофотометр и пропасти, рассчитать стоимость280 A на количество родинок на шаге 1.4.
    Примечание: Вымирание co эффективный ФАБ козла IgG в 280 Нм-64600 M-1.
  6. Для обеспечения что след количество Амин содержащих буфера удаляются, опреснения белка на столбце, созданную во время шагов 1.1 – 1.3 и собирать белковых фракций в 1,5 мл microcentrifuge трубы (~ 500 мкл на фракции).
    1. Закройте клапан стопор оборот, подключенных к верхней части колонны и удалить в верхней части столбца. Если не уже открыть, открыть оборот стопорный клапан в нижней части столбца и ждать, пока «голова» PBS попадает в верхней части бисер.
    2. Медленно добавьте в протеин интереса к верхней части с использованием стекла бисер пипетка Пастера, стараясь свести к минимуму помехи в верхней части бисер.
    3. После того, как «голова» раствор белка достиг верхней части бисер, добавьте 1 mL PBS мягко через пипетку Pasteur. Повторите три раза. Добавление PBS для создания начальника 4-5 см и повторите шаг 1.3 мыть столбца.
      Примечание: Этот шаг можно пропустить, если это уверен, что буфер не содержащие амины присутствует.
  7. Определить фракций, которые содержат белок, измеряя значения A280 и бассейн фракций, которые дают около 90% восстановления белка.
    Примечание: Обычно это разбавляет белок 1,5-2 раза. Определите концентрацию белка после объединения. Концентрат белка на этот шаг, при необходимости, с помощью центрифугирования концентратор.
  8. Добавьте 2.5 молярной эквивалентной сшивателя heterobifunctional белка.
    1. Во-первых, весят примерно 5 мг succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) пропионата (SPDP, MW = 314 г/моль) в трубку microcentrifuge. Чтобы определить объем распустить SPDP, возьмите Молярная белка концентрацию и умножить его на 250 x 100 x решение, которое даст 2,5 Молярная избыток в реакции создавать.
      Примечание: К примеру, если концентрация белка 50 мкм, раствор SPDP на 12,5 мм необходима. Для 5 мг SPDP это соответствует 1,27 мл диметилсульфоксида (ДМСО).
  9. Добавьте SPDP протеина интереса в разведении 1: 100. Место реакции на осциллируя шейкер при комнатной температуре (RT) для примерно 1 час.
  10. Чтобы удалить избыток SPDP и защищать эндогенного дисульфида bond(s), белка на шаге последующего сокращения, сбалансировать и промойте колонку, созданный в шаги 1.1 – 1.3 в 100 мм ацетат натрия (NaOAc) при pH 5.5 или создать столбец идентичные исключительно для использования в этом буфер.
  11. После инкубации 1 час с SPDP опреснения белка на столбце достижение равновесного уровня в 100 мм NaOAc. Выполнять этот шаг идентичным образом как шаг 1.6 за исключением использования 100 мм NaOAc (рН 5,5) как элюента. Сбор фракций, определить A280и бассейн верхней доли. Промойте колонку в PBS.
  12. Приготовляют раствор 2,5 м DTT (MW = 154 г/моль) в двойной дистиллированной воды (ddH2O). Добавьте 25 мм DTT в пуле фракций белка для 5-10 мин.
  13. Измерить A280 белка и разделите это коэффициент вымирания. Кроме того определите A343. Вычислите коэффициент увязки основе Молярность белка (280) и компоновщик (343).
    Примечание: Выключите A340-автокалибровка при использовании nanodrop спектрофотометром. A343 измерения представляет собой поглощение группы 2-Тион пиридина (Коэффициент вымирания = 7550 М-1), будет удален из SPDP крест-компоновщик DTT. Молярное соотношение компоновщика: соотношение белка 1,2 – 1,5 обычно достигается при выполнении реакции с 2,5 Молярная избыток SDPD на широкий спектр белков.
  14. Запуск пула фракций над столбцом, промывают в PBS, как описано выше. Сбор фракций, определить A280и бассейн верхней доли. Определите концентрацию белка, A280 после объединения фракции.
  15. Подготовить DSPE-ПЭГ (2000)-Maleimide (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000)-Maleimide. Это будет добавлено к протеину в соотношении 10:1 моляра. Подготовка 100 x запас DSPE-ПЭГ (2000)-Maleimide для достижения желаемой концентрации.
    1. Например если концентрация белков 10 мкм после шага 1.14, Подготовьте запас DSPE-ПЭГ (2000)-Maleimide 10 мм. Тщательно взвесить, DSPE-ПЭГ (2000)-Maleimide (MW = 3000 г/моль) и добавьте соответствующее количество ДМСО. Несколько раундов нежные vortexing и sonicating может получить его полностью распущены.
  16. Определить общий объем фракций из шага 1.14 и передачи решения тщательно в небольшой (10-25 мл) вокруг нижней колбе (РБФ). Добавьте соответствующее количество 100 x (2000)-Maleimide белка DSPE-PEG для достижения 1 x, десятикратного Молярная концентрация избыток, окончательный. Аккуратно водоворот решение, чтобы убедиться, что ДМСО полностью рассеяны.
  17. Запуск реакции на ночь под азота в запечатанном РБФ. Используйте резиновые перегородки и место в зонта.
    1. Удалите атмосферу, прокалывание перегородки с иглой 20 G, придает шприц 3 мл в конце трубы, придает вакуум и включите пылесос для 3-5 s.
    2. Замените атмосфере азота. Заполнить шар прикрепляются к 3 мл шприц, пополам с азотом и прикрепить иглы 20 G. Прокол перегородки для заполнения атмосферы внутри круглых нижней колбе с азотом. Повторить удаление атмосферу и замена с азотом еще раз и оставить воздушный шар азота, придает на ночь.
  18. Подготовьте отдельный сшитого декстрана гель шарик столбец с диапазоном фракционирование 4000 – 150000 Да в столбце хроматографии стекла 1.0 x 50 см (согласно шаги 1.1-1.3).
  19. Следующий день, удалите белка с круглым дном колбу, подготовленный в шаге 1.17 и запуск (следуйте метод, используемый на шаге 1.6) в столбце сшитого декстрана шарик геля (из шага 1.18).
    Примечание: Общая сумма для загрузки на столбце должно быть не более 2 мл. Если был использован более реакции, разделен на две и запустить на отдельных столбцах или на столбец большего диаметра.
    1. Сбор фракций, определить A280, бассейн верхней доли и определить концентрацию белка. Измерения не повлияет на присутствие липидов.
  20. Храните окончательного объединения фракций липидов, связанных белка на 4 ° C до готовности для использования.

2. липосомы подготовка

  1. Весят, липиды: DSPE-PEG(2000) (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000, МВт = 2805.5 г/моль; Холестерин (3Б гидрокси-5-cholestene, 5-Cholesten-3b-ол), МВт = 386.7 г/моль; и DSPC (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), МВт = 790.1 g/солнечники создать 5 мг/мл раствора DSPC, 4 мг/мл раствора холестерина и 2 мг/мл раствора DSPE-PEG(2000) в хлороформе.
  2. Убедитесь, что молярное соотношение липидов в липосомы: 57% DSPC, 38% холестерина и 5% DSPE-PEG(2000), как представлено в таблице 1.
    Примечание: Важно контролировать количество антигена на липосомы, который обычно составляет от 0,01 – 0,1%. В таблице 1используется 0,1% против мыши коза IgM Fab фрагмента связан с пегилированным липидов. Очень важно принимать во внимание молярной десятикратного превышения DSPE-ПЭГ (2000) Maleimide, который был добавлен к протеину в шаге 1.15, чтобы убедиться, что общее количество липидов Пегилированный не превышает 5%.
  3. Необходимо учитывать суммы окончательного липидов (мкмоль) при создании липидов для экструзии. См. таблицу 1 в качестве примера расчет Молярный липидов концентрации для создания липосомы на 1,25 концентрации всего липидов мкм.
  4. После того, как была рассчитана правильное количество каждого липидов добавляться вместе, объедините все в пробирке 12 мл боросиликатного стекла.
  5. Тщательно удар от метилхлороформа.
    1. Использование труб и шприц 3 мл с иглой, готовы на шаге 1.17.1, тщательно сдуть хлороформ в трубку с азотом. Мягко удар поток азота на решение при вращении трубку с другой стороны. Будьте осторожны, чтобы минимизировать брызг или вызывая жидкости для запуска путь стороне трубки, как это может быть более трудно получить это в раствор на следующем шаге.
  6. Добавить 100 мкл ДМСО в каждую пробирку и lyophilize это решение на ночь. Крышка в верхней части трубки с non статических Лаборатория очистки, безопасных с резинкой и заморозить-80 ° C.

3. липосомы экструзии

  1. Добавьте 1 mL PBS, содержащих липидов, связанных белков для 12 мл, содержащих липидов. Sonicate решение для приблизительно 30 s до 1 мин на водяной бане sonication. Отдых для 5 минут или больше между каждый раунд и повторить 3 – 4 раза.
  2. Подготовка экструдера, как указано заводом-изготовителем.
    1. Добавьте фильтр поддерживает для поддержки внутренней мембраны, несколько капель (по 10 мкл) PBS на парафин фильм. С помощью пинцета, захватите край поддержки фильтра и окунуть его в раскрывающемся списке 10 мкл.
    2. Место внутри кольцо фильтра. Сделайте это для обеих сторон. С помощью пинцета, захватить 0,8 мкм фильтром на краю и окунуться в падение 10 мкл и пальто вне уплотнительное кольцо с PBS. Поместите 0,8 мкм фильтром мягко на уплотнительное кольцо, чтобы фильтр поддерживает не более повесить внутреннюю мембрану.
  3. Поместите блок Отопление экструдера на горячей пластине предварительно нагреть экструдера. Включите низким поджарки и позволяют экструдер, Отопление блока для достижения желаемой температуры. Чтобы избежать потенциальных проблем с агрегацией белковых, не нагревайте блок последних 37 ° C.
  4. Загрузите sonicated образца в один из экструзии шприцы, помещены в экструдере. Поместите шприц экструдера в другом конце экструдера. Убедитесь, что пустой шприц плунжерный устанавливается равным нулю. Пустой шприц будет заполнить как липидов выдавливается через мембрану из поликарбоната 0,8 мкм. Постарайтесь избежать передачи пузыри и обратно через мембрану.
  5. Место полностью собранный экструдера в блоке Отопление. Аккуратно вставьте поршень заполненных шприц с липидами пустой шприц. В зависимости от концентрации липидов это будет трудно протолкнуть. Повторите 20 x.
  6. Удалите полностью собранный экструдер из блока Отопление. Медленно Удалите заполненный шприц из экструдера, будьте уверены, чтобы собирать любые липиды, которые может просочиться при удалении. Поместите липосомы в чистую пробирку. Повторите шаги с помощью 3.4-3.6 поликарбоната 0,2 мкм и 0,1 мкм мембраны.
  7. Создание столбца шарик сшитого агарозы2 0,7 x 50 см с разделения спектр 0,7-10 мега Дальтон (MDa) достижение равновесного уровня в PBS. Добавить липосомы и запустить как шаг 1.6. Фракций, содержащих липосомы будет снижение передачи света в диапазоне 250 – 400 Нм.
  8. Хранить липосомы на 4 ° C и не замерзают.

4. кальция потока для мониторинга B-клетки активации антигенной липосом

  1. Усыпить мышей двуокиси углерода (CO2) или передозировки изофлюрановая, согласно организационной стандартные оперативные процедуры. Подтвердите эвтаназии мышей, шейки матки дислокации.
  2. Стерилизации хирургических инструментов и тушу мышей с использованием 70% этиловом спирте. Использование 10 см длиной, 0,8 мм кончика, изогнутые Ирис щипцы для разделения кожи, охватывающих грудной полости от грудной клетки. Используйте 10 см длиной, прямо рассекает ножницы, чтобы сделать дистальной разрез с двусторонней разрез.
  3. Используйте щипцы изогнутые Ирис и рассечения ножницы для извлечения селезенки из брюшной полости. Удаление жировых тканей, окружающих селезенки и затем поместите его в 15 мл полистирола Конические трубки заполнены с RPMI1640 средних содержащий 1% плода теленка сыворотки (FCS) и пенициллина и стрептомицина.
  4. Передача селезенки и СМИ через стрейнер клеток 40 мкм установлены на 50 мл Конические трубки. Использование резиновых конце поршень шприца 3 мл, аккуратно раздавить селезенки. Промойте фильтр клеток 40 мкм с средствами массовой информации. Повторите этот процесс до тех пор, пока остается только жировой ткани в 40 мкм клеток ситечко. Промойте сито с 3-5 мл средства массовой информации для повышения восстановления клеток.
  5. Центрифуга для клеток огневки на 300 x g 5 мин на RT. После центрифугирования удалить супернатант и добавить 10 мл буфера lysis РБК 1 x в гранулы. Пипетка вверх и вниз, оставить на 2-3 мин на RT и затем центрифуги на 300 x g 5 мин на RT.
  6. Отменить супернатант и Ресуспензируйте splenocytes красных кровяных клеток в исчерпаны в 10 мл средства массовой информации. Определите номера ячейке с помощью Горяева или других клеток подсчета устройства. Пелле клетки центрифугированием, как описано выше.
    Примечание: Идеальный конечной концентрации, необходимые для загрузки Indo-1 splenocytes 10 – 20 х 106 клеток/мл, но более низкой концентрации клеток могут быть использованы.
  7. Ресуспензируйте splenocytes на 15 х 106 клеток/мл в кальция потока загрузки буфера (RPMI1640 среде, содержащей 1% FCS, 10 мм 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic кислота (HEPES), хлорид магния 1 мм (MgCl2), (этиленгликоль бис 1 мм Β-аминоэтил эфира)-N, N, N', N'-tetraacetic кислота (EGTA) и 5% пенициллин стрептомицином). Добавить в 1,5 мкм Indo-1 от 1 мм ДМСО Стоковый раствор, инвертировать трубки несколько раз перемешать. Защищать от света и инкубации клеток при 37 ° C водяной бане 30 мин.
  8. После 30 минут инкубации добавьте в 5 x количество кальция потока загрузки буфера. Центрифуга на 300 x g 7 мин на RT.
  9. Для стробирования на клетки B, пятно клетки с анти мышь 1: 200 B220-PE/Cy7 в 0,5 мл загрузки буфера на 4 ° C в течение 20 мин, защищенном от света и 1: 200 анти мыши CD5-PE.
  10. Вымойте splenocytes кальция потока загрузки буфера и центрифуги на 300 x g 7 мин на RT. Ресуспензируйте клетки на 10 – 20 х 106 клеток/мл в потока кальция работает буфер (Хэнк сбалансированного солевого раствора (HBSS), содержащей 1% FCS, 1 мм MgCl2 и 1 мм Хлорид кальция (CaCl2)). Хранить на льду, защищенном от света до готовности для запуска на проточный цитометр.
  11. Программа установки проточной цитометрии с незапятнанной и один пятно элементов управления для компенсации.
    1. Запустите окрашенных клеток для установки ворот надлежащим образом (см. рис. 2а). Установка Indo-1 (фиолетовый) по сравнению с индо-1 (синий) сюжет, отрегулировать напряжение в Индо-1 каналы поместить окрашивания на уклоне 45 – 60 ° для максимального сигнала клетки: шум Indo-1 фиолетовый: синий изменения в соотношении после стимуляции B-клеток.
      Примечание: Убедитесь, что напряжение не слишком высоки, что значительный процент клеток (> 5%) против верхней части участка.
    2. Создание диагональной ворота, который инкапсулирует в верхней левой части (фиолетовый голубой–+) сюжет, что без стимуляции < 10% из клетки находятся в ворота, который в идеале следует увеличить до > 75% после стимуляции.
  12. Добавить 0,5 мл клеток в максимум 5 мл круглая труба внизу из полистирола (Сортировка труб (FACS) активирована флуоресценции клеток) и теплый клетки до 37 ° C для 3-5 мин на водяной бане. Поместите трубки СУИМ в 37 ° С водяной рубашкой камеры, который подключен к повторно циркулирующей водой ванну.
    1. Запустить трубу water-jacket на проточный цитометр и инициировать приобретения, без сохранения данных, на приблизительно 5000 – 10 000 событий в секунду. После того, как клетки стабилизировались (15 – 30 с), инициировать получение и сбор данных для по крайней мере 10 s установить фон.
    2. Отметке 10 s быстро снять трубку от проточный цитометр, добавить стимуляции (антигенной липосомы 5-50 мм в 2 – 20 мл), пульс вихря и возвращение СУИМ трубу на проточный цитометр. Поддерживать сбор данных и хранения через этот раз и собирать данные для 3-5 мин.
  13. Анализ данных в соответствующий анализ программного обеспечения под кинетики функции.

5. Подготовка арахиса экстракт

  1. Экстракт белков арахиса, смешивая арахиса муку в соотношении 1:5 (wt:vol)-фосфатный буфер (PBS), с 1 М хлорид натрия (NaCl). Смешать раствор на Плиты магнитные перемешать 2 h на RT при сохранении в рН 8,5.
  2. Центрифуга решение на 3000 x g 45 мин при 4 ° C. Декантируют и фильтра стерилизуйте супернатант последовательно через фильтр 0,4 мкм, следуют 0.2 мкм фильтром. Определите концентрацию белка, bicinchoninic кислоты (BCA) пробирного используя бычьим сывороточным альбумином (БСА) как стандарт.
  3. Сократить и денатурировать образец арахиса белков с 50 мм Дитиотреитол (DTT) в буфер, содержащий литий Додециловый сульфат при рН 8,4, который позволяет максимальную активность восстанавливающего агента и тепла при 70 ° C на 10 мин.
  4. Запустите 10 мкг денатурированные белки арахиса на бис-трис 4 – 12% геля полиакриламида precasted разработан, чтобы дать оптимальное разделение градиента гель с молекулярной массой предварительно окрашенные стандарта.
  5. Пятно гель с disulfonated трифенилметанового и Отмойте с ddH2O. выявлять известных крупных аллергенам арахиса Ара h 1, 2 и 3 в подготовке экстракт. Ара h 1 отображается в 63 кДа, Ара h 2 должен появиться как две изоформы на 17 и 19 кДа, а Ара h 3 в 37 кДа (кислых субъединицы).

6. информирование мышей арахиса

  1. Ресуспензируйте токсин холеры 1 мг в 1 мл ультрачистая вода. Подготовка 200 мкл разбавленный арахиса экстракт содержащий 2 мг арахиса белка и 10 мкг холеры токсина в PBS.
  2. Администрировать 200 мкл концентрированного экстракта арахиса, содержащие холеры токсин (2 мг белка арахиса и 10 мкг холеры токсин) через пероральная затравка для каждого 4-5 неделя старый BalB/cJ женского мыши. Повторите один раз в неделю в течение трех недель (т.е. дня 0, 7 и 14).
  3. Администрировать 300 мкл разбавленный арахиса экстракт (содержащие 5 мг белка арахиса и 10 мкг холеры токсин) через пероральная затравка для каждой мыши на четвертой неделе (т.е., 21 день).

7. задача мышей с экстрактом из арахиса

  1. День 28 Подготовьте арахиса экстракт до конечной концентрации 1 мг/мл в PBS. Измерение температуры тела базовый с помощью ректального термометра (около 37,5 – 38,5 ° C). Администрировать 200 мкл (200 мкг) арахиса экстракт через инъекции внутрибрюшинного (и.п.).
  2. Измерение температуры тела с ректального термометра каждые 15 мин в течение 1 ч после инъекции. Падения температуры тела указывает аллергии на арахис.
    Примечание: Гипотермии является отличительной чертой анафилаксии мышей. Эта задача будет продемонстрировать, что мышей аллергия на арахис. Как правило 90% мышей Balb/cJ, которые проходят в протоколе информированию развиваться аллергические реакции во время вызова, характеризуется снижением температуры по крайней мере на 2 – 3 ° C.

8. изоляция Splenocytes от аллергических мышей и приемных передачи

  1. Изоляция splenocytes от наивного и арахиса аллергия мышей.
    1. День 30 усыпить наивными и подтвержденных арахиса аллергия мышей управляющими 3 Л/мин CO2 в газовой камере. Подтвердите эвтаназии мышей, двусторонние торакотомии. Стерилизации хирургических инструментов и тушу мыши с помощью 70% этиловом спирте. Используйте щипцы для разделения кожи, охватывающих грудной полости от грудной клетки. Используйте прямой рассечения ножницы для двусторонних разрез, нарушение ребер левой и правой.
    2. Используйте щипцы и рассечения ножницы для извлечения селезенки из брюшной полости. Удаление жировых тканей, окружающих селезенки перед размещением в полистирола 15 мл Конические трубки, заполненные с 10 мл RPMI 1640 среднего.
    3. В стерильные Ламинарный шкаф Налейте 35 мм пенополистирола Петри селезенки и СМИ. Держите наивными и аллергических splenocytes в отдельном Петри и СМИ во время изоляции клеток. Используйте стерилизованные щипцы и рассечения ножницы разрезать на три части селезенки и вернуться к чашке Петри.
    4. С помощью грубой, матовое края двух стеклянных скольжениях микроскопа, нежно однородный (в RPMI) части селезенки до тех пор, пока белые ткани остается между слайдами. Изменить слайды между группами.
    5. Передача огневки клеток от Петри через стрейнер ячейки 70 мкм, установлены на 50 мл Конические трубки. Пройти оставшиеся фрагменты селезенки через сито с плунжером от 1 мл шприц. Промойте сито с 5 мл RPMI для максимального восстановления клеток. Передавать фильтрата из полистирола 15 мл конические пробки и центрифуги (450 x g, 10 мин, RT).
    6. Аспирационная супернатант и добавить Ресуспензируйте Пелле клеток в 2 мл буфера lysis красных кровяных клеток (0,83% хлорид аммония в буфер Tris 10 мм, pH 7.2). Смешать и Инкубируйте на RT для добавить 10 мл 2-3 мин FBS PBS - 2% и центрифуги на 300 x g 7 мин на RT.
    7. Вымыть клетки снова с 12 мл FBS PBS - 2% для полностью удалить любые остаточные аммония хлорид и центрифуги на 300 x g 7 мин на RT. вновь приостановить ячейки пеллет в 2 мл RPMI 1640 среды. Подсчет количества ячеек с помощью Горяева или автоматический гематологический анализатор.
  2. С помощью 27 G, 5/8-дюймовый иглу на шприц 1мл инсулин, внутривенно вводить 15 х 106 аллергических или наивно splenocytes извлечены как описано выше (в 200 мкл) через хвост вен в наивной (unsensitized) мышах.

9. инъекции мышей с Ара h 2 антигенной липосом

  1. Подготовьте Ah2 липосомы, содержащие 0,1% Ah2 в 2,5 мм липидов. Для расчета концентрации белка, коэффициент вымирания Ah2-15000 M-1. Разбавить липосомы до 300 мкм в стерильных PBS.
  2. Один день после приемных передачи (31 день) аллергических или наивно splenocytes, внутривенно вводят 200 мкл PBS или Ah2 антигенной липосомы (300 мкм), содержащих в общей сложности 1,38 мкг Ah2 через хвост духе мышей BALB/cJ, splenocytes, полученные на шаге 8.2.

10. boost и вызов мышей с Ара h 2

  1. Через две недели после инъекции с Ah2 липосомы, день 45, используйте 4 мм животных Ланцет для сбора 50 – 200 мкл крови от перекрестка подчелюстной мыши. Сбор крови в сыворотке сепаратор трубе без гепарина; отдельный сыворотке крови центрифугированием при 6000 x g 15 мин использовать собранные сыворотки позже на меру антиген специфические антитела.
  2. День 46, две недели после инъекции мышей с липосомы (шаг 9.2) увеличить мышей, и.п. инъекции 200 мкл PBS или 200 мкг растворимых Ah2 (очищенный, как описано ранее,16).
  3. На 60 дней собирать 50-200 мкл крови от перекрестка подчелюстной мыши и обработки крови, как описано ранее.
  4. На 61 день, вызов каждой группе мышей с и.п. инъекции 200 мкл 300 мкг растворимых Ah2. Измерение температуры тела с ректальный датчик каждые 15 мин в разделе 7.

11. Количественная оценка Ара h 2-специфических IgE и IgG1 по ELISA

  1. Слой 96-луночных энзим соединенный assay иммуносорбента (ELISA)-совместимый плита с 100 мкл HSA-DNP (2,4-dinitrophenyl Гаптены конъюгированных человеческого сывороточного альбумина, 20 мкг/мл) для стандартной кривой или Ah2 (5 мкг/мл) для образцов сыворотки собранных в шагах 10.1 и 10.3, разбавленных в буфер покрытия (карбонат бикарбонат буфера 50 мм, pH 9,6) при 4 ° C на ночь или 37 ° C для > 1 час.
  2. Вымойте три раза с 200 мкл PBS-T (PBS с 0,05% Tween-20) и блокировать скважин с 200 мкл PBS-T содержащие 2% BSA при 37 ° C для > 2 ч.
  3. Для ELISA Ah2-специфических IgE, добавьте 50 мкл IgE анти DNP стандартов (2 – 0,002 мкг/мл, приготовленный из серийных разведений 1:2) или мыши образцы сыворотки (1:20 разрежения) и инкубировать на ночь при 4 ° C. Для Ah2-конкретных IgG1 ELISA, добавить 100 мкл очищенного IgG1-анти DNP стандартов (2 – 0,002 мкг/мл, приготовленный из серийных разведений 1:2) или мыши образцы сыворотки (разбавления 1: 500) и инкубировать на ночь при 4 ° C или 1 ч при 37 ° C.
  4. Вымойте три раза с 200 мкл PBS-T. Для ELISA Ah2-специфических IgE, 100 мкл овец анти мыши IgE (0,5 мкг/мл) и инкубировать при 37 ° C в течение 1 ч. Для Ah2-конкретных IgG1 ELISA, 100 мкл HRP коза анти мыши IgG1 (разбавленный 1:40,000 в PBS-T - 2% BSA). Инкубируйте при 37 ° C в течение 1 ч.
  5. Вымойте три раза с 200 мкл PBS-T. Для Ah2-специфических IgE ELISA, добавить 100 мкл биотинилированным осел анти овец IgG (0,5 мкг/мл) и инкубировать при 37 ° C на 45 мин. Для Ah2-конкретных IgG1 ELISA перейдите к шагу 11.7.
  6. Вымойте три раза с 200 мкл PBS-T. Для ELISA Ah2-специфических IgE добавить 100 мкл нейтральн взимается авидин-пероксидаза (например, NeutrAvidin-ПХ, 0,3 мкг/мл) и инкубировать при 37 ° C за 30 мин.
  7. Добавить 100 мкл 3, 3', 5, 5'-тетраметилбензидина (ТМБ) субстрат, инкубировать 10-15 мин или пока образцы превратить темно-синего цвета, затем добавить 100 мкл ТМБ универсальное решение. Читайте пластину на 450 Нм.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Спряжение протеина интереса с DSPE-PEG(2000) можно продемонстрировать путем запуска сокращение показаны увеличение молекулярной массы по сравнению с неконъюгированной белка. Рисунок 1A показывает представитель гель анти мыши IgM F(ab) фрагмент конъюгации ПЭГ-DSPE, который показывает кДа bandshift 2-3 для денатурированного протеина. Обратите внимание, что примерно 50% белка появляется, изменение которого ожидается, учитывая, что 1:1 стехиометрии был достигнут ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Методы, описанные здесь являются общий протокол для сопряжения белка липидов, который позволяет отображать белка на липосомальных наночастиц. Для очень больших мульти Субблок белков этот протокол может ограниченную полезность. Идеальный метод должен быть введение конкретных тег, который позволяет биортогональный химических увязки стратегии для использования. Если выражения протеина recombinantly, это может быть возможно с использованием имеющихся конкретных стратегий17и широкий спектр функциональн...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Это исследование было поддержано грантов от министерства обороны (W81XWH-16-1-0302 и W81XWH-16-1-0303).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Модель 2110 Сборник фракцийBioRad7318122
холестролSigmaC8667Sigma grade 99%
SPDPThermo Fisher Scientific21857
DSPCAvanti850365
DSPE-PEG 18:0Avanti880120
DSPE-PEG MaleimideAvanti 880126
ЭкструдерAvanti610000шприц 1 мл с держателем/нагревательным блоком
Фильтры 0,1 &; mФильтрыAvanti 610005
0.8 & микро; mAvanti610009
10 мм Опоры для фильтраAvanti6100014
стеклянная колба с круглым дномSigmaZ100633
Стопоры оборотаThermo Fisher ScientificP-301398
ТрубкаThermo Fisher ScientificP-198194
Leur LockThermo Fisher Scientifick4201634503
Бусины Sephadex G50GE Life Sciences17004201
Sephadex G100 БусиныGE Life Sciences17006001
Термоинактивированная сыворотка для телятThermo Fisher Scientific10082147
HEPES (1 M)Thermo Fisher Scientific15630080
EGTASigmaE3889
Пенициллин-стрептомицин (10 000 ЕД/мл)Thermo Fisher Scientific15140122
1x буфер для лизиса эритроцитовThermo Fisher Scientific00-4333-57
Indo-1InvitrogenI1203
CD5-PEBioLegend100608
B220-PE-Cy7BioLegend103222
HBSSThermo Fisher Scientific14170112без кальция и магния
MgCl2SigmaM8266
CaCl2SigmaC4901
Fab anti-mouse IgMJackson ImmunoResearch115-007-020
F(ab')2 anti-mouse IgMJackson ImmunoResearch115-006-020
Арахисовая мукаGolden Peanut Co.52127112% жира светлая обжарка, 50% белка
Иглы для кормления животныхCadence Science792022г x 1,5", 1,25 мм - прямой
термометр MicroprobePhysitempBAT-12
Ректальный зонд для мышейPhysitempRet-3
Холерный токсин, от Vibrio choleraList Biological Laboratories, Inc.100BНабор
для анализа белка BCAPierce23225
Карбонатно-бикарбонатный буферSigmaC3041
TMB Stop SolutionKPL50-85-06
SureBlue TMB Microwell Peroxidase SubstrateKPL5120-0077
96 лунок Immulon 4HBX plateThermo Scientific3855
Очищенный растворимый Ara h 2N/AN/Aочищенный в: Sen, et al., 2002, Journal of Immunology
HSA-DNPSigmaA-6661
Mouse IgE anti-DNPAccurate ChemicalBYA60251
Sheep anti-Mouse IgEThe Binding SitePC284
Biotinylated Donkey Anti-SheepIgG Accurate Chemical JNS065003
NeutrAvidin Protein, HRPThermoFisher Scientific31001
Мышиный IgG1 анти-ДНПТочный химическийMADNP105
HRP козий антимышиный IgG1Southern Biotech1070-05
1 мл инсулиновых шприцевBD329412U-100 Инсулин, 0,40 мм (27 г) x 16,0 мм (5/8 дюйма)
Superfrost Микроскоп СлайдыFisher Scientific12-550-1425 мм x 75 мм x 1,0 мм
ACK Лизирующий буферgibco by Life TechnologiesA10492-01100 мл
RPMI 1640 MediumThermo Fisher Scientific11875093500 мл
Клеточный фильтрCorning35235070 μ m Нейлон, Белый, Стерильный, Индивидуально упакованный
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Протеиновые гелиInvitrogenNP0322BOX10 гелей
NuPAGE LDS буфер, 4xInvitrogenNP0008250 мл
SeeBlue Plus2 Предварительно окрашенный стандартныйInvitrogenLC5925500 &микро; L
NuPAGE MES/SDS беговой буфер, 20xInvitrogenNP0002500 мл
GelCode Blue StainThermo Scientific24590500 мл
без азида

Ссылки

  1. Gupta, R. S., et al. The prevalence, severity, and distribution of childhood food allergy in the United States. Pediatrics. 128 (1), e9-e17 (2011).
  2. Sicherer, S. H., Munoz-Furlong, A., Godbold, J. H., Sampson, H. A. US prevalence of self-reported peanut, tree nut, and sesame allergy: 11-year follow-up. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (6), 1322-1326 (2010).
  3. Kim, E. H., et al. Sublingual immunotherapy for peanut allergy: clinical and immunologic evidence of desensitization. Journal of Allergy Clinical Immunology. 127 (3), 640-646 (2011).
  4. Vickery, B. P., et al. Sustained unresponsiveness to peanut in subjects who have completed peanut oral immunotherapy. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 133 (2), 468(2014).
  5. Jones, S. M., et al. Epicutaneous immunotherapy for the treatment of peanut allergy in children and young adults. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 139 (4), 1242(2017).
  6. Varshney, P., et al. A randomized controlled study of peanut oral immunotherapy: clinical desensitization and modulation of the allergic response. Journal of Allergy Clinical Immunology. 127 (3), 654-660 (2011).
  7. Anagnostou, K., et al. Assessing the efficacy of oral immunotherapy for the desensitisation of peanut allergy in children (STOP II): a phase 2 randomised controlled trial. Lancet. 383 (9925), 1297-1304 (2014).
  8. Sampson, H. A., et al. Effect of Varying Doses of Epicutaneous Immunotherapy vs Placebo on Reaction to Peanut Protein Exposure Among Patients With Peanut Sensitivity: A Randomized Clinical Trial. The Journal of the American Medical Association. 318 (18), 1798-1809 (2017).
  9. Bednar, K. J., et al. Human CD22 Inhibits Murine B Cell Receptor Activation in a Human CD22 Transgenic Mouse Model. Journal Immunology. 199 (9), 3116-3128 (2017).
  10. Macauley, M. S., et al. Antigenic liposomes displaying CD22 ligands induce antigen-specific B cell apoptosis. Journal Clinical Investigation. 123 (7), 3074-3083 (2013).
  11. Orgel, K. A., et al. Exploiting CD22 on antigen-specific B cells to prevent allergy to the major peanut allergen Ara h 2. Journal Allergy Clinical Immunology. 139 (1), 366-369 (2017).
  12. Smarr, C. B., Hsu, C. L., Byrne, A. J., Miller, S. D., Bryce, P. J. Antigen-fixed leukocytes tolerize Th2 responses in mouse models of allergy. Journal of Immunology. 187 (10), 5090-5098 (2011).
  13. Kulis, M., et al. The 2S albumin allergens of Arachis hypogaea, Ara h 2 and Ara h 6, are the major elicitors of anaphylaxis and can effectively desensitize peanut-allergic mice. Clinical and Experimental Allergy. 42 (2), 326-336 (2012).
  14. Dang, T. D., et al. Increasing the accuracy of peanut allergy diagnosis by using Ara h 2. Journal of Allergy Clinical Immunology. 129 (4), 1056-1063 (2012).
  15. Loughrey, H. C., Choi, L. S., Cullis, P. R., Bally, M. B. Optimized procedures for the coupling of proteins to liposomes. Journal Immunological Methods. 132 (1), 25-35 (1990).
  16. Sen, M., et al. Protein structure plays a critical role in peanut allergen stability and may determine immunodominant IgE-binding epitopes. Journal of Immunology. 169 (2), 882-887 (2002).
  17. Krall, N., da Cruz, F. P., Boutureira, O., Bernardes, G. J. Site-selective protein-modification chemistry for basic biology and drug development. Nature Chemistry. 8 (2), 103-113 (2016).
  18. Jimenez-Saiz, R., et al. Lifelong memory responses perpetuate humoral TH2 immunity and anaphylaxis in food allergy. Journal Allergy and Clinical Immunology. 140 (6), 1604-1615 (2017).
  19. Moutsoglou, D. M., Dreskin, S. C. Prolonged Treatment of Peanut-Allergic Mice with Bortezomib Significantly Reduces Serum Anti-Peanut IgE but Does Not Affect Allergic Symptoms. International Archives of Allergy and Immunology. 170 (4), 257-261 (2016).
  20. LaMothe, R. A., et al. Tolerogenic Nanoparticles Induce Antigen-Specific Regulatory T Cells and Provide Therapeutic Efficacy and Transferrable Tolerance against Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. Frontiers in Immunology. 9, 281(2018).
  21. Srivastava, K. D., et al. Investigation of peanut oral immunotherapy with CpG/peanut nanoparticles in a murine model of peanut allergy. J Allergy Clin Immunol. 138 (2), 536-543 (2016).
  22. Bellinghausen, I., Saloga, J. Analysis of allergic immune responses in humanized mice. Cellular Immunology. 308, 7-12 (2016).
  23. Pillai, S., Mattoo, H., Cariappa, A. B cells and autoimmunity. Curr Opin Immunol. 23 (6), 721-731 (2011).
  24. Mantegazza, R., Cordiglieri, C., Consonni, A., Baggi, F. Animal models of myasthenia gravis: utility and limitations. International Journal of General Medicine. 9, 53-64 (2016).
  25. Berman, P. W., Patrick, J. Experimental myasthenia gravis. A murine system. J Exp Med. 151 (1), 204-223 (1980).
  26. Berman, P. W., Patrick, J. Linkage between the frequency of muscular weakness and loci that regulate immune responsiveness in murine experimental myasthenia gravis. J Exp Med. 152 (3), 507-520 (1980).
  27. Derksen, V., Huizinga, T. W. J., van der Woude, D. The role of autoantibodies in the pathophysiology of rheumatoid arthritis. Seminars in Immunopathology. 39 (4), 437-446 (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Липосомальные наночастицыаллерген Ara h 2модель аллергии на арахисадоптивный переносвыделение спленоцитовпроточная цитометрияанализ потока ионов кальцияопределение методом ИФАэкструзия липосом
Антигенные липосом для поколения болезни специфические антитела
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.