Обнаружение и изоляция Apoptotic тел с высокой чистоты

Апоптоз, изученной форма запрограммированной смерти клетки, требуется для поддержания физиологического гомеостаза и удалить потенциально вредные клетки внутри человеческого тела¹. После индукции апоптоза apoptotic клетки (ApoCells) можно пройти ряд морфологических изменений и разбирать в малых мембраны прыгните везикулы, называют ApoBDs. В целом этот процесс известен как apoptotic клеток разборки и можно разделить в 3 отдельных шагов, основанный на морфологию^2,3. Шаг 1 (плазматической мембраны блеббинг) характеризуется образованием шар подобных структур на поверхности клеток, известный как шелесту^4,5. Шаг 2 (apoptotic выступ формирования) включает в себя создание длительного мембраны выступы как apoptopodia, apoptopodia бисером и микротрубочек шипов^6,7,8. И наконец шаг 3 (образование ApoBD) включает в себя фрагментация apoptotic выступов или ApoCells для создания ApoBDs^6,9. Предыдущие результаты предложили роль ApoBDs в пособничестве apoptotic клеток распродажа и посреднической межклеточные связи. Например предлагается, что фрагментация ApoCell на ApoBDs может создавать небольшие «укус-определенные размер» которые могут быть легко удалены путем окружать фагоциты^2,10,11. Кроме того ApoBDs может гавани серии биомолекул, такие как ДНК, РНК и белков, которые могут быть незаконно в окружающие клетки для облегчения ячеек связи^12,,1314. Функционально расследовать эти процессы, жизненно важно, чтобы подтвердить три ключевые параметры, включая (i) проверки индукции апоптоза и формирования ApoBD, (ii) изоляции ApoBDs и (iii) подтверждения чистоты ApoBD.

Ранее ряд методов, включая проточной цитометрии и электронной микроскопии были использованы для изучения апоптоза и ApoBDs^15,16,17,18. Однако ApoBD обнаружения и количественного определения зачастую трудно или упускается из виду. Например, наиболее широко используется поток на основе цитометрии апоптоз пробирного использует annexin V (A5, белок, который связывается externalized ' поесть-меня ' сигнала фосфатидилсерина (PtdSer)) и нуклеиновых кислот пятна пропидий йодидом (PI)¹⁹. Однако с помощью этой универсальной пятно комбинации, анализ предполагает, что есть только три типа клеток подмножеств (жизнеспособных клеток, ApoCells и отмершие клетки) в образце. Кроме того хотя рассматривается как «золотой стандарт» многими исследователями для apoptosis, assays проточной цитометрии и последующего анализа данных часто исключает ApoBDs через первоначальный стробирования шаг, выбрав FSC/SSC^{средний высокий} события. Таким образом мы недавно разработали пробирного цитометрии Роман потока, используя A5 и TO-PRO-3, другой нуклеиновых пятно, которое может быть выборочно take up каспазы-3/7-активированный Паннексины 1 (PANX1) каналы^207,. Как 3-индуцированной PANX1 активацию caspase предшествует PtdSer воздействия на ранней стадии апоптоза, TO-PRO-3 дифференциально пятна apoptotic и отмершие клетки. Кроме того, этот подход в сочетании с нашими Роман стробирования стратегия включает в себя все полученные события при анализе данных и в результате, определены шесть клеток/частиц подмножеств, включая: (i) жизнеспособных клеток (FSC/SSC^{средний/высокий}, A5^низкая , TO-PRO-3^низкий), (ii) A5^– ранней ApoCells (FSC/SSC^{средней/высокой}, A5^низкий, TO-PRO-3^{промежуточных}), (iii) A5⁺ ApoCells (FSC/SSC^{средний/высокий}, A5^{Высокая} , К-PRO-3^{промежуточных}), (iv) отмершие клетки или позднего ApoCells (FSC/SSC^{средней/высокой}, A5^{высокий}, TO-PRO-3^{высокий}), (v) ApoBDs (FSC/SSC^низкий, A5^{промежуточных}, TO-PRO-3^{низкая / промежуточные}) и (vi) мусора (FSC/SSC^низкий, A5^низкий, TO-PRO-3^низкий)²⁰. Наш подход подчеркивает важность анализа всех подмножеств клетки/частиц и, что более важно, разделение ApoBDs от клеток и мусора²⁰. Таким образом этот подход демонстрирует эффективную технику для проверки индукции апоптоза и формирования ApoBD одновременно.

Традиционно ApoBDs были выделены через разнообразные подходы дифференциального центрифугирования, whereby ApoBDs может быть отделена от клетки или другие внеклеточного везикулы, основанный на плотность. Однако такие методы Центрифугирование часто ограничивается низкой ApoBD чистота, отсутствие количественной оценки шаг для подтверждения чистоты образца, и/или неспособность отделить ячейки конкретного типа ApoBDs^17,21,22. Поэтому мы недавно разработали два подхода, основанного на СУИМ и новый дифференциального центрифугирования основанный подход, который может использоваться в сочетании с нашим ранее установленных потока цитометрии метод для проверки индукции апоптоза и образец чистоты²³. ApoBD изоляции через наш подход, основанный на СУИМ может обогатить ApoBDs до 99% чистоты и может использоваться в сочетании с разнообразием антител определенного типа клеток изолировать ApoBDs от смешанных клеточных популяций, образцы тканей и жидкостями²³. Кроме того, наш пересмотренный дифференциального центрифугирования подход демонстрирует эффективный метод для изоляции ApoBDs к > 90% чистоты²³.

В этой статье мы подробно описать нашей экспериментальной процедуры для проверки индукции апоптоза и для выявления и количественной оценки ApoBD формирования. ApoBD изоляции процессов на основе СУИМ и методами дифференциального центрифугирования основе также разработана и сравнить. Репрезентативных данных показывают, что описывается методология обеспечивает эффективный инструмент передовые для будущих исследований ApoBD.

1. индукции апоптоза

1. Образец клеток в центрифуге на 300 x g 5 мин и удалить супернатант удалить любые уже существующие клетки мусора.
   Примечание: При использовании адэрентных клеток, семян клетки заранее и мыть с 1 x фосфат амортизированное решение (PBS) до индукции апоптоза.
2. Определение количества клеток и собирать клетки.
   Примечание: В зависимости от изоляции после анализа, мы рекомендуем стартовый номер ячейки по крайней мере 1 x 10⁷ клеток.
3. Ресуспензируйте в полной СМИ (соответствующие среде, содержащей 10% (vol/vol) плода телячьей сыворотки, 50 МЕ/мл пенициллин, 50 мкг/мл стрептомицина смесь) для окончательного концентрации 1 х 10⁶ клеток/мл.
4. Аликвота ~ 2 x 10⁶ клеток на хорошо 6 пластины хорошо.
5. Чтобы индуцировать апоптоз, снимите крышку плита и облучить клетки на 150 МДж/см² с помощью УФ облучателя. Это должно занять около 30-60 сек.
   Примечание: До облучения, обеспечить сохранение ~0.5 x 10⁶ ячеек для элемента управления «Неочищенные» клеток.
   Примечание: Апоптоз может также быть наведено через другие методы, такие как анти ФАС или сыворотки голода⁶.
6. Инкубируйте при 37° C, 5% CO₂ на 2-8 часов, в зависимости от линии клеток.
7. С помощью верхнего света микроскопом скамейке, визуализируйте клетки, чтобы подтвердить наличие apoptotic морфологии, например блеббинг, apoptopodia формирования и ApoBD формирования.
   Примечание: 40 кратном достаточно
8. С помощью пипетки P1000, Пипетка и собирать образцы apoptotic.
9. Вымойте тарелку с ПБС и объединить с оставшихся образца для обеспечения максимальной доходности.
10. Сбор ~1/10^й для «Весь Apoptotic образец» (WAS) управления.
11. Собирайте «Лечения» образца.
12. Центрифугуйте образцы как была, так и неочищенные в 3000 x g за 6 мин.
13. Ресуспензируйте в 1 мл ПБС и отложите на льду.
14. Для ApoBD изоляции перейдите к шагу 2 или 3 с оставшихся образца apoptotic.

2. ApoBD изоляции через СУИМ

1. Центрифуга для всей выборки в 3000 x g за 6 мин.
2. Удалите часть супернатант без нарушения гранулы.
3. Ресуспензируйте в окрашивание раствора, содержащего 1 мл 1 x A5 привязки буфера, 75 мкл A5-FITC и 2 мкл TO-PRO-3 за 1 x 10-⁷ клеток.
4. Проинкубируйте образцы в темноте при комнатной температуре в течение 10 мин.
5. Добавить 1-2 мл 1 x A5 привязки буфера и центрифуги образца на 3000 x g 6 мин для удаления избыточных пятно.
   Примечание: Для смешанных клеточных популяций или образцов ткани, выполните антитело пятная шаг, используя комбинацию маркеров определенного типа клеток в 1 x A5 привязки буфера и инкубировать на льду для 20 мин (или согласно производителя протокол) перед центрифугированием на 3000 x g 6 мин.
6. Ресуспензируйте образца Пелле в 3 мл буфера СУИМ (ПБС, 1 x A5 привязки буфера, 10% FSC, 2 мм ЭДТА) за 1 x 10-⁷ клеток.
7. Фильтрация через стрейнер ячейки 70 мкм в раунд дно, трубы полипропилен (проточной цитометрии) и хранить пробы на льду и в темноте.
8. Включите машину СУИМ и выполнять стандартный набор с помощью насадкой 100 мкм, выполняют падение задержки и обеспечить стабильный поток.
9. Загрузить образец и установите скорость приобретения ~ 1000 событий/сек.
10. Отрегулируйте FSC, ГКС, APC (TO-PRO-3) и FITC (A5) напряжений и положение события в рамках СУИМ участков для обеспечения населения могут быть четко разделены.
11. Запись 20 000 событий.
12. Настройка стробирования стратегия как и части 4.
13. В макете сортировки добавьте окончательный ApoBD ворота в качестве желаемого сортировки населения.
14. Начинают приобретать образца и выполнить тест сортировку, собирая 5000-10000 ApoBDs в новой трубка, содержащая ~ 250 мкл буфера СУИМ.
15. Выполните систему обратно скрытой и нагрузки отсортировано ApoBDs.
16. Приобретать и запись тест сортировки ApoBDs.
17. Убедитесь, что чистота ApoBD ~ 99% сравнивая FSC (ось y) против A5 (оси x события).
    Примечание: A5 пятнать может уменьшить слегка когда повторно анализировать образцы благодаря лазерного отбеливания.
18. Как только достигается высокой чистоты, загрузить исходный образец и продолжить сортировки пока не было получено необходимое количество ApoBDs.
    Примечание: В случае необходимости, двойной сортировка может выполняться одновременно изолировать ApoCells и ApoBDs.
    Примечание: При сортировке по в течение долгого времени, мы рекомендуем инкубации коллекции трубки при 4 ° C.
19. После завершения сортировки собрать небольшую часть ApoBDs после сортировки, после сортировки ApoCells, неочищенные и была проверка апоптоз и подтвердить чистоту после сортировки.
    Примечание: Хотя тест Сортировка и чистоты после сортировки не должны существенно разнятся, это основано на параметров потока и стабильности.

3. ApoBD изоляции через дифференциального центрифугирования

1. Центрифуга для оставшихся apoptotic образца на 300 g x 10 мин.
2. Собирать супернатанта, оставляя ~ 500 мкл, чтобы избежать нарушения клеток Пелле и добавить в новой 15 мл Конические трубки.
3. Удалите оставшиеся 500 мкл и Ресуспензируйте Пелле клеток в 2 мл ПБС (это ApoCell обогащенный дроби.
4. Центрифуга собранные супернатант 20 мин в 3000 г.
5. Проверьте для гранул и тщательно удалить супернатант (супернатант может содержать небольшой внеклеточного везикулы, включая микровезикулы и exosomes).
6. Ресуспензируйте гранулы в 1 мл ПБС (это представляет «ApoBD обогащенный» фракция)
7. Сбор 100 мкл каждого жизнеспособные, WAS, обогащенный ApoCell, и ApoBD обогащенный образцов в новый раунд дно, полистирол (проточной цитометрии) трубки.
8. 100 мкл пятно, содержащих 2 x A5 привязки буфер, 1: 100 А5-FITC и 1:1,000 в-PRO-3
9. Инкубации при комнатной температуре в течение 10 минут в темноте.
10. Анализировать образцы проточной цитометрии, используя стробирования стратегию как описано выше для проверки успешного индукции апоптоза и чистоты обогащенный ApoBD фракции.

4. проточной цитометрии стробирования стратегия

1. Участок в-PRO-3 (ось y) против FSC (ось x), чтобы отделить отмершие клетки (TO-PRO-3^{высокий}) от всех остальных-permeabilized событий (^{низкий/средний}TO-PRO-3).
2. Выберите все события, не permeabilized и участок SSC против A5. Ворота две популяции, включая 1 (P1), ККК^{средний/высокий},^{низкий/средний} ячейки A5 и населения 2 (P2), все другие события.
3. P2 участок в-PRO-3 против A5 и выберите события^{средней/высокой} A5 для исключения всех клеток мусора.
4. Выберите все позитивные события, A5 и участок FSC против A5. Отдельные ApoBDs (FSC^низкий) от ApoCells (FSC^{средний/высокий}).
   Примечание: Когда стробирования ApoBDs для ApoBD изоляции через подход, основанный на СУИМ, мы рекомендуем последний шаг, выбрав ApoBDs и сравнение к-PRO-3 для A5 и выбрав все события. Это гарантирует, что окончательное сортировки ворота использует флуоресценции, вместо того, чтобы параметры FSC/SSC.
5. Для анализа жизнеспособных клеток выберите P1 и выполните одну из двух стратегий стробирования. Для анализа общего жизнеспособных клеток участок FSC против A5 и выберите все клетки^{средней/высокой} FSC, поэтому удаление мусора остальные ячейки. Кроме того, для углубленного анализа, жизнеспособных клеток могут быть отделены от A5^– ранней ApoCells путем построения TO-PRO-3 против FSC. Выберите кому-PRO-3^низкий, FSC^{средней/высокой} жизнеспособных клеток и TO-PRO-3^{промежуточные}, FSC^{средней/высокой} A5^– ранней ApoCells.

Используя процедуру, описанную здесь, индуцированного апоптоза Моноцит THP-1 и ApoBDs были обнаружены и изолированных либо через основанных на СУИМ или дифференциального центрифугирования подход (рис. 1). Во-первых апоптоз был под воздействием УФ-облучения и образцы были собраны после 2-3 ч инкубации при клетки выставлены apoptotic морфологии, включая блеббинг, формирования протрузии apoptotic мембраны и поколение ApoBDs6. TO-PRO-3 и основанные на A5 потока цитометрии метод был использован для подтверждения индукции апоптоза Моноцит и формирования ApoBD, разделив жизнеспособных клеток, отмершие клетки, ранние ApoCells, ApoCells, ApoBDs и мусора (рис. 2). Вместе взятые, поток cytometry анализ показал, что УФ лечение приводит к ~ 20% ApoCells (рис. 3).

Моноцит THP-1 ApoBDs затем были изолированы от WAS через два подхода. Во-первых, образцы были подготовлены для высокой чистоты подход, основанный на СУИМ, где только один центрифугирования шаг требуется Пелле весь apoptotic образца до окрашивания и СУИМ. Этот метод подходит для функциональных проб, когда значительно высокий образец чистоты не требуется (например, для анализа ПЦР), когда требуется определенное количество ApoBDs, или когда приобретения мобильных конкретного типа ApoBDs из образца комплекса. Используя эту методологию, ApoBDs были изолированы от ~ 99% чистоты (рис. 4).

Далее Моноцит THP-1 ApoBDs были также изолированы через двухэтапный подход дифференциального центрифугирования. Первый этап включает в себя изоляцию жизнеспособных клеток, ApoCells и отмершие клетки. Второй шаг включает в себя разделение больших ApoBDs от небольших внеклеточного везикулы например микровезикулы и exosomes, которые не могут быть гранулированных 3000 x g. проточной цитометрии затем была выполнена для подтверждения индукции апоптоза и ApoBD образец чистоты и продемонстрировал пример обогащенные ApoBD, содержащие ~ 97% ApoBDs (рис. 4). Это представляет быстрый и эффективный способ изолировать ApoBD относительно высокой чистоты и подходит, когда очистка ApoBDs от образцов, содержащих одну ячейку тип.

Рисунок 1 . Принципиальная схема ApoBD изоляции через подхода на основе СУИМ или дифференциального центрифугирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2 . Проточная цитометрия стробирования стратегии. Шесть клеток/частиц подмножеств (включая жизнеспособных клеток, A5– рано ApoCells, A5+ ApoCells, отмершие клетки, ApoBDs и мусор) были определены и использованы для выбора ApoBD для изоляции на основе СУИМ. (a) мембраны permeabilised некротических клеток отделены от не permeabilised событий. (b) A5низкий средний, SSCнизкая высокая клетки отделены от A5низкая высокая событий. (b.i) за глубокий анализ, TO-POR-3низкий жизнеспособных клеток может быть отделена от TO-PRO-3промежуточных A5– ранней ApoCells. (b.ii) в качестве альтернативы, когда просто расчете ApoBD чистоту, жизнеспособных клеток могут быть отделены отнизкой событий FSC. (c) A5низкой мусора исключаются. (d) FSCсредней/высокой ApoCells отделены от FSCнизкой ApoBDs. (e) все A5-к-PRO-3средней/высокой ApoBDs выбираются для сортировки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. 

Рисунок 3 . Проверка апоптоза Моноцит THP-1. Был проведен анализ цитометрии потока необработанных или УФ облучению моноцитов THP-1 для определения уровней жизнеспособных клеток, A5– рано ApoCells, A5+ ApoCells и отмершие клетки.

Рисунок 4 . Очистка THP-1 моноцитарных ApoBDs. Потока cytometry анализ проводился на изолированных THP-1 моноцитарных ApoBDs через либо на основе СУИМ или дифференциального центрифугирования на основе подхода, показаны в обогащение ApoBDs из жизнеспособных клеток, ApoCells и отмершие клетки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Авторы не имеют ничего сообщать.