Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Ламинэктомия и имплантация окна спинного мозга в мыши

12.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/58330

⸱

23 октября 2019 г.

 ,  ,  , 
1Department of Anatomy and Cell Biology, University of Illinois at Chicago College of Medicine, 2Medical Scientist Training Program, University of Illinois at Chicago College of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает имплантацию стеклянного окна на спинной мозг мыши для облегчения визуализации с помощью внутривитой микроскопии.

Аннотация

Этот протокол описывает метод для ламинэктомии спинного мозга и имплантации стекла окна для in vivo изображения спинного мозга мыши. Интегрированный цифровой испаритель используется для достижения стабильной плоскости анестезии при низкой скорости потока изолюран. Удаляется один позвоночник позвонка, а на тонкой агарозной кровати накладывается коммерчески доступное крышка. 3D-печатной пластиковой задней панели затем крепится к соседним позвоночника моль с помощью ткани клея и зубного цемента. Платформа стабилизации используется для уменьшения артефакта движения от дыхания и сердцебиения. Этот быстрый и без зажимов хорошо подходит для острой мультифотоновой флуоресценции микроскопии. Репрезентативные данные включены для применения этого метода к двухфотонической микроскопии сосуды спинного мозга у трансгенных мышей, выражающих eGFP:Claudin-5 - плотный протеин соединения.

Введение

Трансгенные модели животных, выражающие флуоресцентные белки, в сочетании с интравитальной микроскопией, обеспечивают мощную платформу для решения биологии и патофизиологии. Чтобы применить эти методы к спинному мозгу, специальные протоколы необходимы для подготовки спинного мозга для визуализации. Одной из таких стратегий является проведение имплантации ламинэктомии и окна спинного мозга. Ключевыми особенностями идеального протокола ламинэктомии для микроскопии являются сохранение структуры и функции родной ткани, стабильность поля изображения, быстрое время обработки и воспроизводимость результатов. Особая задача заключается в стабилизации поля изображения против движения, вызванного дыханием и сердцебиением. Несколько ex vivo и in vivo стратегии, как сообщается, для достижения этихцелей 1,2,3,4,5. Большинство методов in vivo включают зажим сторонпозвоночника2,4 и часто сопровождается имплантированием жесткого металлического аппарата3,4 для стабильности во время операции и приложения для визуализации ниже по течению. Зажим позвоночника может потенциально поставить под угрозу кровоток и вызвать гематоэнцефалический барьер (BBB) белка ремоделирования.

Цель этого метода состоит в том, чтобы сделать неповрежденный спинной мозг доступным для оптической визуализации в живой мыши, минимизируя инвазивность протокола и улучшая результаты. Мы описываем одну процедуру имплантации ламинэктомии и крышки стекла в паре с минимально инвазивной овальной пластиковой 3D-печатной задней панелью, которая все еще достигает надежной механической стабильности. Задняя панель непосредственно прилипает к передней и задней позвоночника с зубным цементом. Задняя панель оснащена боковыми удлинительными руками с винтовыми отверстиями, которые жестко прикрепляются к стадии микроскопа через металлическую руку. Это эффективно якоря нетронутыми переднего и заднего позвонка на стадии микроскопа, обеспечивая механическое сопротивление движения артефакт, который в противном случае были бы введены дыхание и сердцебиение. Метод был оптимизирован для ламинэктомии одного позвонка на грудном уровне 12, опуская зажимы, используемые в альтернативных стратегиях стабильности во время in vivo изображений. Процедура быстрая, принимая приблизительно 30 минут в мышь.

Этот протокол может быть использован для изучения механизмов заболевания BBB. BBB является динамической микрососудистой системы, состоящей из эндотелиальных клеток, сосудистой гладкой мышцы, перицитов и астроцитов ноги процессов, которые обеспечивают весьма селективную среду для центральной нервной системы (ЦНС). Представительные данные изображают применение этого протокола в трансгенных мышах, разработанных для выражения повышенного зеленого флуоресцентного белка (eGFP):Claudin-5, плотный белок соединения BBB. Предоставленные файлы печати задней панели также могут быть настроены для альтернативных приложений.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все эксперименты следуют протоколам Комитета по институциональному уходу и использованию животных ВУЗа. Это терминальная процедура.

1. Подготовка реагента

  1. Подготовка искусственного спинного мозга (aCSF), чтобы содержать 125 мМ NaCl, 5 мм KCl, 10 мм глюкозы, 10 мМ HEPES, 2 мМ MgCl26H2O, 2 мМ CaCl22H2O в ddH2O. Стерильный фильтр и заморозить в индивидуальном использовании aliquots. Теплый aCSF в водяной бане до 39 градусов по Цельсию перед использованием.
  2. Теплая агароза с низкой температурой плавления (2%) в aCSF до полного растворения в водяной бане, установленной до 65 градусов по Цельсию. Во время ламинэктомии, охладить расплавленный агарозный аликот до 39 градусов по Цельсию в водяной бане, так что он может быть готов при близкой к физиологии температуры для шага 5.2.
    Примечание: Раствор агарозы может храниться при -20 градусов по Цельсию в одноразовых aliquots.
  3. Приготовьте стерильный 50 мг/мл карпрофена в бактериостатической воде. Хранить при 4 градусах по Цельсию.
  4. Чистые крышки с 70% этанолом, три стира ddH2O, и хранить сухие в контейнере без пыли.

2. Задняя панель 3D-печати

  1. Использование программного обеспечения 3D CAD используется для создания модели для размеров, показанных на рисунке 1. Интерьер эллипс широкий на нижней поверхности по отношению к принтеру и вырезать с lofted вырезать на меньший эллипс формирования просвет на противоположной поверхности. Два проецирующих оружия с отверстиями для приема винтов простираются слажен, для крепления к вилке для удержания задней панели. Из этой 3D-структуры создайте триангуляционный 3D-файл сетки (. Файл STL).
    Примечание: См. Рисунок 1Bqu2012D и дополнительные файлы 1 и 2.
  2. Загрузите триангуляционный 3D-файл сетки на 3D-принтер.
  3. Печать задних пластин с использованием 0,4 мм горячего напла и высоты слоя 0,2 мм. Выберите температуру сопла 205 градусов по Цельсию, температуру кровати 45 градусов по Цельсию, и скорость печати 45 мм/с.
  4. Оцените резонирующую 3D-печатную заднюю панели визуально для структурной целостности(рисунок 1E); грубый структурный сбой (отсутствует просвет, рухнувщая стена) указывает на дефекты печати(рисунок 1F).

3. Хирургическая подготовка

  1. Разогреть грелку.
  2. Нагрузка isoflurane в доставку шприц во время работы в химическом капоте дыма. Прикрепите шприц доставки к изолюрану.
  3. Выберите мышь 8'u201212-недельной давности. Взвесьте животное. Индуцировать анестезию с использованием 2% изолюран в индукционной камере. Вводят карпрофен при подкожном колотике 5 мг/кг.
  4. Расположите носовой конус и доставьте изофлуран на 2% со скоростью потока 150 мл/мин для обслуживания хирургической плоскости анестезии(рисунок 2Aqu2012E). Оберните грелку с одноразовой абсорбцивент площадку для удобства очистки.
  5. Расположите животное на грелке на хирургической станции и установите носовой конус. Смазать термометр с вазелин и вставить его 5 мм в прямую кишку. Лента термометр зонд акбар для стабильности. Нанесите офтальмологическую мазь на глаза мыши.
  6. Для поддержания гидратации нанесите 200 лактационного раствора Ringer путем подкожной инъекции каждые 30 минут до окончания эксперимента.
  7. Спрей снизить синицу с 70% этанола, удалить мех с клиперами, и очистить сайт с повидон-йод.

4. Ламинэктомия

  1. Расположите животное между ушными прутьями; они поддерживают положение головы мыши по отношению к носу-конусу.
  2. Подтвердите, что животное глубоко обезглавлено, как оценивается отсутствием межцифрового рефлекса щепотки и устойчивой дыхательной паттерн.
  3. Сделайте 1,5 см рострал-каудальный разрез в средней линии над нижней грудной/верхней поясничной областью, используя #11 лезвие(рисунок 2). Разделите кожу, схватив ее тупыми зубчатыми щипками и/или перчатками. Используйте щиптем, чтобы отделить и очистить назад любые оставшиеся прозрачные соединительной ткани под кожей. Поверхностная мускулатура теперь должна быть разоблачена; вытеснить это с пеной хирургического копья.
  4. Используйте пены хирургических копий (или кюретт), чтобы очистить от оставшихся, более глубокие мускулатуры целевого позвонка (торакальный 12). Чтобы создать место для задней панели, а также очистить мышцы от заднего аспекта грудной 11, и передний аспект грудной 13. Контролируйте любое кровотечение, применяя мягкое давление с помощью хирургического копья или используйте минимальный пульс с помощью каутери. Продолжайте удалять оставшиеся мышцы от сухожилий с помощью щипцы
  5. После того, как мышцы удаляются, тщательно отсоединить сухожилия, разрезая щипцы. Там должно быть много места для визуализации и манипулирования шнур, когда этот шаг будет завершен. Убедитесь, что дюра материи межпозвонкового пространства, полупрозрачной ламинар кости, центрального поверхностного кровеносных сосудов под костью, и передней излучающей артерии в настоящее время хорошо видны.
  6. Влажный регион с теплым aCSF. Используйте microdrill, чтобы повторно тонкие ламинар кости с помощью прямых ударов параллельно длинной оси спинного мозга(Рисунок 2, Рисунок 3). При желании используйте этап скольжения для вращения хирургической платформы для повышения эргономичного комфорта (например, оператор правой руки может вращать хирургическую платформу против часовой стрелки для этапа бурения).
    Примечание: Используемый этап скольжения построен из верхней алюминиевой пластины, которая скользит 15 мм по отношению к фиксированной базовой пластине.
  7. Аккуратно схватить поверхностный спинной процесс с щипками и поднять позвонок; кость должна легко отойти. Если есть сопротивление, повторить истончение костей с дрелью и при необходимости использовать ножницы радужной оболочки глаза, стараясь направить ножницы наконечники вверх, чтобы избежать повреждения ткани.
    Примечание: Для того, чтобы сохранить dura нетронутыми, важно не буксир на кости.
  8. Используйте #4 щипцы, чтобы очистить любые кости осколки. Используйте хирургическое копье, чтобы применить мягкое устойчивое давление, чтобы контролировать любое кровотечение. Промыть ткань теплым aCSF. Не допускайте высыхания тканей.

5. Имплантация крышки стекла

  1. Аккуратно нанесите 3 мм боросиликатного крышки на открытый шнур.
  2. Убедитесь, что агароуз охлаждается до 39 градусов по Цельсию. Используя небольшой шпатель, нанесите теплый 2% агарозы /ACSF к краю крышки стекла и позволяют капиллярного действия, чтобы привлечь его под поверхностью.
    Примечание: При температурах ниже 39 градусов по Цельсию агарозможет начать геля. Если это происходит, разогреть с помощью водяной ванны или микроволновой печи. Некоторые операторы предпочитают сначала применить одну каплю агарозы и заложить крышку стекла на вершине.
  3. Нанесите клей ткани к открытым костлявым суставным процессам нетронутого смежного позвонка на грудном уровне 11 позвоночной позвоночника и грудного уровня 13 позвоночной позвоночника. Нанесите дополнительный клей ткани в кольцо вокруг участка ламинэктомии, над соседним сухожилием и поперечным процессом.
    Примечание: Ткань клей требуется для надлежащего присоединения зубного цемента в последующие шаги. Суставные процессы образуют естественное сиденье, на котором задняя панель может лежать(рисунок 3). Присоединение к суставным процессам будет образовывать сильные точки привязанности.
  4. Смешайте зубной цемент с ускорителем в фарфоровом подносе для смешивания. Используйте небольшой шпатель для передачи зубного цемента на ткань клеевого слоя. Используйте зубной цемент, чтобы придерживаться задней панели к хирургическому полю, по центру над окном. Разрешить 10 минут для зубного цемента для лечения.
    Примечание: Твердая прижатка задней панели к передней и задней суставных процессам обеспечивает фундаментальную структурную стабильность имплантата.
  5. Используйте дополнительный зубной цемент для заполнения внутренней базы задней панели, и нижней части задней панели : ткань интерфейса.
    Примечание: Дополнительное применение зубного цемента улучшает присоединение и снижает риск утечки микроскопа объективного погружения жидкости (солин) из нижней части задней панели.
  6. Предварительно раздвитом держателя задней панели в соответствующее положение над окном. Закрепите заднюю панель в держатель задней панели с винтами.
    Примечание: В этом протоколе использовался пользовательский держатель задней панели(Рисунок 2Gnou2012H).
  7. Применить солин на задней панели для проверки на утечку. Если какая-либо жидкость протекает, высушите область и нанесите больше зубного цемента.

6. Подготовка изображений

  1. Перенесите животное на хирургическую платформу на оптический стол.
    Примечание: Наша хирургическая платформа, держатель задней панели, и изофларан нос-конус держатель может быть транспортирован между хирургическими и двух-фотонных станций визуализации, как один блок, при применении непрерывной изолюранской анестезии (Рисунок 2D,H). Аналогичные единицы могут быть собраны из холдинга вилки, балки, и вспомогательные столба должности, полученные из коммерческих источников(например. ThorLabs). Для интравитальной микроскопии, должно быть по крайней мере 11 дюймов зазора между целью микроскопа и оптическим столом для приспособления высоты хирургической платформы.
  2. Прикрепите хирургическую платформу к оптическому столу с помощью монтажного столба из нержавеющей стали и контрскучной зажимной вилки.
  3. Нанесите свежий сосуд в колодец задней панели. Опустите в колодец объектив погружения.
  4. Используйте передаваемый или эпифлуоресценционный свет для определения области интереса и фокусировки. Переключитесь на режим лазерного сканирования и выполняйте виво-изображение в соответствии с соответствующими двухфотонными лазерными волничными волновыми длинами, дихроками и фильтрами пласта для флюорофоров, присутствующих в ткани6.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Имплантированные стеклянные окна и интравитальная двухфотонная микроскопия являются полезным инструментом для оценки динамических изменений белков ЦНС. На функциональную целостность BBB влияет экспрессия, субклеточная локализация и скорость текучести плотных соединений7. Предыдущие исследования показали, что плотные белки соединения проходят быструю и динамичную ремоделирование при стабильном состоянии8. В настоящее время описано ламинэктоми...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Описанный здесь метод позволяет стабильно сделать визуализацию спинного мозга у мышей через стеклянное окно. Этот метод был применен для оценки BBB ремоделирования в трансгенных eGFP: Claudin5 /- мышей, которые выражают флуоресцентный BBB плотный белок соединения, но он может быть применен одинаково хорошо для исследований любых флуоресцентных белков или клеток в спинном мозге.

Разработано несколько методов ламинэктомии и стабилизации спинного мозга. Все протоколы касаются стабилизации спинног...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

S.E. Lutz поддерживается Национальным центром продвижения трансляционных наук, Национальными институтами здравоохранения под руководством Гранта KL2TR002002 и начального медицинского фонда Чикагского медицинского колледжа. Саймона Алфорда поддерживает RO1 MH084874. Содержание является исключительно ответственностью авторов и не обязательно отражает официальные взгляды NIH. Авторы благодарят Дритан Agalliu в кафедре неврологии в Колумбийском университете медицинский центр для Tg eGFP: Claudin-5 мышей, научных дискуссий, а также понимание развития хирургического протокола и изображений приложений. Авторы благодарят Сунила. Ганди на кафедре нейробиологии и поведения Калифорнийского университета в Ирвине за разработку первого прототипа стереотаксического аппарата и контроллера температуры животных, обсуждение хирургического протокола и обучение двухфотонной микроскопии. Авторы также благодарят Стива Пикенса (W. Nuhsbaum, Inc.) за помощь в настройке хирургического стереомикроскопа и Рона Липински (Производство китов) за обработку стереотактических деталей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
3D-принтерRaise3DPro2Для печати опорных пластин
PLA Нить для 3D-печатиInlandPLA+-175-BМатериал для 3D-печати из черного
пластика Программное обеспечение 3D CADDassault SystemesSolidworks программное обеспечениепроектирования 3D-форм
Программное обеспечение для 3D-принтераПрограммное обеспечение Raise3DIdeamakerдля взаимодействия с 3D-принтером
3D-печатная овальная задняя пластинана заказСтабилизирующее поле визуализации
Хирургический препарирующий микроскопLeicaM205 CОснащен Leica FusionOptics, объективом Planapo 0,63x M-серии и камерой для скользящего стола
Камера для микроскопаLeicaMC170HD цветная камера для визуализации хирургического поля
Скользящая сценаLeica10446301Скользящая ступень сконструирована из двух металлических пластин. Опорная плита фиксируется. Верхняя пластина скользит по смазанному интерфейсу, обеспечивая вращательное и линейное перемещение.
Хирургическая станция и стабилизационная вилкаКитовое производствопо индивидуальному заказуЛаминэктомия
SomnoSuite Низкопоточная установка для доставки изофлуранаKent ScientificSS-01Хирургическое введение анестезии со встроенным цифровым испарителем
Нержавеющая сталь 1,5-дюймовый монтажный постThorLabsP50/MДля монтажа хирургической станции на оптический стол для двухфотонной визуализации
Котованная зажимная вилка для монтажа 1,5" PostThorLabsPF175Для стабилизации хирургической станции для крепления на оптическом столе для двухфотонной визуализации
Идеальная костная микродрельГарвардский аппарат72-6065Истончающая кость для ламинэктомии
Водяная баняFisher Scientific15-462-10Согревающий солевой
пистолет для прижиганияFST18010-00Прижигание малого bleeds
ГрелкаBenchmarkBF11222силиконовый нагреватель 1,9 x 4,5 дюйма с диагональю 20 дюймов Тефлоновые провода, 10 Вт, 5
В типа K Термосопряженный ректальный зондPhysitempRET3Измерение температуры тела мыши
вазелинSigma8009-03-8Смазывающий ректальный зонд
Терморегулятор с обратной связьюна заказNAКоммерчески доступные альтернативы включают серию Physitemp TCAT
PVA Хирургические глазные копьяBeaver-visitec international40400-8Электрический
триммерWahl41590-0438Обрезка шерсти мыши
Лезвие, #11FST14002-14Хирургический инструмент
Щипцы, #5FST11254-20Хирургический инструмент
Щипцы, #4FST14002-14Хирургический инструмент
Titatnium зубчатые щипцыWPI555047FTХирургический инструмент
Титановые ирисовые ножницыWPI555562SХирургический инструмент
Vetbond тканевый клей3M084-1469SBПодготовка поверхности ткани для стоматологического акрила
Керамический лоток для смешиванияJack Richeson420716Смешивание стоматологического акрилового средства с ускорителем
Orthojet стоматологический акриловыйLang Dental1520BLK, 1503BLKПостоянное приклеивание задней пластины к ткани
Маленькое круглое защитное стекло, толщина #1, 3 ммГарвардский аппарат64-0720оптическое окно
NaClFisher Scientific7647-14-5Для aCSF
KClFisher Scientific7447-40-7Для aCSF
ГлюкозаFisher Scientific50-99-7Для aCSF
HEPESSigma7365-45-9Для aCSF
MgCl2& миддот; 6H2OFisher Scientific7791-18-6Для aCSF
CaCl2· 2H2OFisher Scientific10035-04-8Для aCSF
КарпрофенРимадилQM01AE91Анальгезия
Бактериостатическая водаГенри Шейн2587428Разбавитель для карпрофена
ИзофлуранГенри Шейн11695-6776-2Анестезия
Лактатный раствор РингераBaxter0338-0117-04Гидратация для мыши
Agarose High EEOSigmaA9793гелевая точка 34-37 градусов
C Офтальмологическая смазывающая мазьAkwa Tears68788-0697Предотвратить высыхание роговицы
MOM Двухфотонный микроскопSutter
для для впитывания крови

Ссылки

  1. Weinger, J. G., et al. Two-photon imaging of cellular dynamics in the mouse spinal cord. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
  2. Davalos, D., Akassoglou, K. In vivo imaging of the mouse spinal cord using two-photon microscopy. Journal of Visualized Experiments. (59), (2012).
  3. Farrar, M. J., Schaffer, C. B. A procedure for implanting a spinal chamber for longitudinal in vivo imaging of the mouse spinal cord. Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).
  4. Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G., Debarbieux, F. Implanting glass spinal cord windows in adult mice with experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Visualized Experiments. (82), e50826(2013).
  5. Figley, S. A., et al. A spinal cord window chamber model for in vivo longitudinal multimodal optical and acoustic imaging in a murine model. PLOS ONE. 8 (3), e58081(2013).
  6. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  7. Liebner, S., et al. Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease. Acta Neuropathologica. 135 (3), 311-336 (2018).
  8. Shen, L., Weber, C. R., Turner, J. R. The tight junction protein complex undergoes rapid and continuous molecular remodeling at steady state. Journal of Cell Biology. 181 (4), 683-695 (2008).
  9. Knowland, D., et al. Stepwise recruitment of transcellular and paracellular pathways underlies blood-brain barrier breakdown in stroke. Neuron. 82, 1-15 (2014).
  10. Lutz, S. E., et al. Caveolin1 Is Required for Th1 Cell Infiltration, but Not Tight Junction Remodeling, at the Blood-Brain Barrier in Autoimmune Neuroinflammation. Cell Reports. 21 (8), 2104-2117 (2017).
  11. Harrison, M., et al. Vertebral landmarks for the identification of spinal cord segments in the mouse. Neuroimage. 68, 22-29 (2013).
  12. Cupido, A., Catalin, B., Steffens, H., Kirchhoff, F. Laser Scanning Microscopy and Quantitative Image Analysis of Neuronal Tissue. Bakota, L., Brandt, R. , Springer. New York. 37-50 (2014).
  13. Sekiguchi, K. J., et al. Imaging large-scale cellular activity in spinal cord of freely behaving mice. Nature Communications. 7, 11450(2016).
  14. Nadrigny, F., Le Meur, K., Schomburg, E. D., Safavi-Abbasi, S., Dibaj, P. Two-photon laser-scanning microscopy for single and repetitive imaging of dorsal and lateral spinal white matter in vivo. Physiological Research. 66 (3), 531-537 (2017).
  15. Adelsperger, A. R., Bigiarelli-Nogas, K. J., Toore, I., Goergen, C. J. Use of a Low-flow Digital Anesthesia System for Mice and Rats. Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).
  16. Damen, F. W., Adelsperger, A. R., Wilson, K. E., Goergen, C. J. Comparison of Traditional and Integrated Digital Anesthetic Vaporizers. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (6), 756-762 (2015).
  17. Miyamoto, K., et al. Selective COX-2 inhibitor celecoxib prevents experimental autoimmune encephalomyelitis through COX-2-independent pathway. Brain. 129 (Pt 8), 1984-1992 (2006).
  18. Muthian, G., et al. COX-2 inhibitors modulate IL-12 signaling through JAK-STAT pathway leading to Th1 response in experimental allergic encephalomyelitis. Journal of Clinical Immunology. 26 (1), 73-85 (2006).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Процедура ламинэктомииспинной мозг мышивизуализация in vivoдвухфотонная микроскопия3D-печатная пластина для фиксацииадгезия стоматологическим цементомстабилизация в агарозном слоеимплантация покровного стеклавизуализация клаудина-5
Ламинэктомия и имплантация окна спинного мозга в мыши
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.