Этот протокол описывает имплантацию стеклянного окна на спинной мозг мыши для облегчения визуализации с помощью внутривитой микроскопии.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Ламинэктомия и имплантация окна спинного мозга в мыши
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Этот протокол описывает метод для ламинэктомии спинного мозга и имплантации стекла окна для in vivo изображения спинного мозга мыши. Интегрированный цифровой испаритель используется для достижения стабильной плоскости анестезии при низкой скорости потока изолюран. Удаляется один позвоночник позвонка, а на тонкой агарозной кровати накладывается коммерчески доступное крышка. 3D-печатной пластиковой задней панели затем крепится к соседним позвоночника моль с помощью ткани клея и зубного цемента. Платформа стабилизации используется для уменьшения артефакта движения от дыхания и сердцебиения. Этот быстрый и без зажимов хорошо подходит для острой мультифотоновой флуоресценции микроскопии. Репрезентативные данные включены для применения этого метода к двухфотонической микроскопии сосуды спинного мозга у трансгенных мышей, выражающих eGFP:Claudin-5 - плотный протеин соединения.
Введение
Трансгенные модели животных, выражающие флуоресцентные белки, в сочетании с интравитальной микроскопией, обеспечивают мощную платформу для решения биологии и патофизиологии. Чтобы применить эти методы к спинному мозгу, специальные протоколы необходимы для подготовки спинного мозга для визуализации. Одной из таких стратегий является проведение имплантации ламинэктомии и окна спинного мозга. Ключевыми особенностями идеального протокола ламинэктомии для микроскопии являются сохранение структуры и функции родной ткани, стабильность поля изображения, быстрое время обработки и воспроизводимость результатов. Особая задача заключается в стабилизации поля изображения против дв....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все эксперименты следуют протоколам Комитета по институциональному уходу и использованию животных ВУЗа. Это терминальная процедура.
1. Подготовка реагента
- Подготовка искусственного спинного мозга (aCSF), чтобы содержать 125 мМ NaCl, 5 мм KCl, 10 мм глюкозы, 10 мМ HEPES, 2 мМ MgCl26H2O, 2 мМ CaCl22H2O в ddH2O. Стерильный фильтр и заморозить в индивидуальном использовании aliquots. Теплый aCSF в водяной бане до 39 градусов по Цельсию перед использованием.
- Теплая агароза с низкой температурой плавления (2%) в aCSF до полного растворения в водяной бане, установленной до ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Имплантированные стеклянные окна и интравитальная двухфотонная микроскопия являются полезным инструментом для оценки динамических изменений белков ЦНС. На функциональную целостность BBB влияет экспрессия, субклеточная локализация и скорость текучести плотных соединений7. Предыдущие исследования показали, что плотные белки соединения проходят быструю и динамичную ремоделирование при стабильном состоянии8. В настоящее время описано ламинэктоми.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Описанный здесь метод позволяет стабильно сделать визуализацию спинного мозга у мышей через стеклянное окно. Этот метод был применен для оценки BBB ремоделирования в трансгенных eGFP: Claudin5 /- мышей, которые выражают флуоресцентный BBB плотный белок соединения, но он может быть применен одинаково хорошо для исследований любых флуоресцентных белков или клеток в спинном мозге.
Разработано несколько методов ламинэктомии и стабилизации спинного мозга. Все протоколы касаются стабилизации спинног.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
S.E. Lutz поддерживается Национальным центром продвижения трансляционных наук, Национальными институтами здравоохранения под руководством Гранта KL2TR002002 и начального медицинского фонда Чикагского медицинского колледжа. Саймона Алфорда поддерживает RO1 MH084874. Содержание является исключительно ответственностью авторов и не обязательно отражает официальные взгляды NIH. Авторы благодарят Дритан Agalliu в кафедре неврологии в Колумбийском университете медицинский центр для Tg eGFP: Claudin-5 мышей, научных дискуссий, а также понимание развития хирургического протокола и изображений приложений. Авторы благодарят Сунила. Ганди на кафедре нейробиологии и поведения Кали....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 3D-принтер | Raise3D | Pro2 | Для печати опорных пластин |
| PLA Нить для 3D-печати | Inland | PLA+-175-B | Материал для 3D-печати из черного |
| пластика Программное обеспечение 3D CAD | Dassault Systemes | Solidworks программное обеспечение | проектирования 3D-форм |
| Программное обеспечение для 3D-принтера | Программное обеспечение Raise3D | Ideamaker | для взаимодействия с 3D-принтером |
| 3D-печатная овальная задняя пластина | на заказ | Стабилизирующее поле визуализации | |
| Хирургический препарирующий микроскоп | Leica | M205 C | Оснащен Leica FusionOptics, объективом Planapo 0,63x M-серии и камерой для скользящего стола |
| Камера для микроскопа | Leica | MC170 | HD цветная камера для визуализации хирургического поля |
| Скользящая сцена | Leica | 10446301 | Скользящая ступень сконструирована из двух металлических пластин. Опорная плита фиксируется. Верхняя пластина скользит по смазанному интерфейсу, обеспечивая вращательное и линейное перемещение. |
| Хирургическая станция и стабилизационная вилка | Китовое производство | по индивидуальному заказу | Ламинэктомия |
| SomnoSuite Низкопоточная установка для доставки изофлурана | Kent Scientific | SS-01 | Хирургическое введение анестезии со встроенным цифровым испарителем |
| Нержавеющая сталь 1,5-дюймовый монтажный пост | ThorLabs | P50/M | Для монтажа хирургической станции на оптический стол для двухфотонной визуализации |
| Котованная зажимная вилка для монтажа 1,5" Post | ThorLabs | PF175 | Для стабилизации хирургической станции для крепления на оптическом столе для двухфотонной визуализации |
| Идеальная костная микродрель | Гарвардский аппарат | 72-6065 | Истончающая кость для ламинэктомии |
| Водяная баня | Fisher Scientific | 15-462-10 | Согревающий солевой |
| пистолет для прижигания | FST | 18010-00 | Прижигание малого bleeds |
| Грелка | Benchmark | BF11222 | силиконовый нагреватель 1,9 x 4,5 дюйма с диагональю 20 дюймов Тефлоновые провода, 10 Вт, 5 |
| В типа K Термосопряженный ректальный зонд | Physitemp | RET3 | Измерение температуры тела мыши |
| вазелин | Sigma | 8009-03-8 | Смазывающий ректальный зонд |
| Терморегулятор с обратной связью | на заказ | NA | Коммерчески доступные альтернативы включают серию Physitemp TCAT |
| PVA Хирургические глазные копья | Beaver-visitec international | 40400-8 | Электрический |
| триммер | Wahl | 41590-0438 | Обрезка шерсти мыши |
| Лезвие, #11 | FST | 14002-14 | Хирургический инструмент |
| Щипцы, #5 | FST | 11254-20 | Хирургический инструмент |
| Щипцы, #4 | FST | 14002-14 | Хирургический инструмент |
| Titatnium зубчатые щипцы | WPI | 555047FT | Хирургический инструмент |
| Титановые ирисовые ножницы | WPI | 555562S | Хирургический инструмент |
| Vetbond тканевый клей | 3M | 084-1469SB | Подготовка поверхности ткани для стоматологического акрила |
| Керамический лоток для смешивания | Jack Richeson | 420716 | Смешивание стоматологического акрилового средства с ускорителем |
| Orthojet стоматологический акриловый | Lang Dental | 1520BLK, 1503BLK | Постоянное приклеивание задней пластины к ткани |
| Маленькое круглое защитное стекло, толщина #1, 3 мм | Гарвардский аппарат | 64-0720 | оптическое окно |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | Для aCSF |
| KCl | Fisher Scientific | 7447-40-7 | Для aCSF |
| Глюкоза | Fisher Scientific | 50-99-7 | Для aCSF |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | Для aCSF |
| MgCl2& миддот; 6H2O | Fisher Scientific | 7791-18-6 | Для aCSF |
| CaCl2· 2H2O | Fisher Scientific | 10035-04-8 | Для aCSF |
| Карпрофен | Римадил | QM01AE91 | Анальгезия |
| Бактериостатическая вода | Генри Шейн | 2587428 | Разбавитель для карпрофена |
| Изофлуран | Генри Шейн | 11695-6776-2 | Анестезия |
| Лактатный раствор Рингера | Baxter | 0338-0117-04 | Гидратация для мыши |
| Agarose High EEO | Sigma | A9793 | гелевая точка 34-37 градусов |
| C Офтальмологическая смазывающая мазь | Akwa Tears | 68788-0697 | Предотвратить высыхание роговицы |
| MOM Двухфотонный микроскоп | Sutter |
Ссылки
- Weinger, J. G., et al. Two-photon imaging of cellular dynamics in the mouse spinal cord. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
- Davalos, D., Akassoglou, K. In vivo imaging of the mouse spinal cord using two-photon microscopy. Journa....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
