Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

3-D клетки культуры системы для изучения вторжения и оценки терапии рака мочевого пузыря

8.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/58345

⸱

13 сентября 2018 г.

 ,  ,  , 
1Departments of Internal Medicine, Hematology/Oncology Division, Rogel Cancer Center, University of Michigan Medical Center, 2Department of Urology, Division of GU Oncology, Rogel Cancer Center, University of Michigan Medical Center, 3Departments of Surgery and Pathology, Perlmutter Cancer Center, NYU Langone Health

В этой статье

Краткое содержание

Процессы, регулирующие вторжения рака мочевого пузыря представляют возможности для биомаркеров и терапевтические развития. Здесь мы представляем модели вторжения рака мочевого пузыря, которая включает 3-D культуры сфероидов опухоли, покадровой изображений и confocal микроскопии. Этот метод полезен для определения особенностей процесса инвазивных и скрининг терапевтических агентов.

Аннотация

Рак мочевого пузыря является проблемой значительного здравоохранения. Предполагается, что более чем 16.000 человек умрет в этом году в Соединенных Штатах от рака мочевого пузыря. В то время как 75% рака мочевого пузыря, неинвазивная и вряд ли могут метастазировать, около 25% прогресс для инвазивного роста. До половины пациентов с инвазивным раком будет развивать смертоносного метастатического рецидива. Таким образом понимание механизма инвазивных прогрессии рака мочевого пузыря имеет решающее значение для прогнозировать исходы и предотвращения смертоносных метастазов. В этой статье мы представляем трехмерной рака вторжения модель, которая позволяет включение опухолевых клеток и стромы компонентов для имитации условий в vivo происходящих в микроокружения опухоли мочевого пузыря. Эта модель обеспечивает возможность наблюдать инвазивных процесс в режиме реального времени с использованием промежуток времени визуализации, допрашивать молекулярные пути, связанные с помощью конфокальной immunofluorescent изображений и экран соединений с потенциалом для блока вторжения. Хотя этот протокол фокусируется на рак мочевого пузыря, вполне вероятно, что подобные методы могут использоваться для изучения вторжения и подвижности в других типов опухолей, а также.

Введение

Вторжение является важнейшим шагом в прогрессии рака, который необходим для метастазов и связан с нижней выживания и плохим прогнозом у больных. В человеческой мочевого пузыря рак, наиболее распространенных злокачественных мочевых путей, которое вызывает около 165 000 смертей в год во всем мире, непосредственно связаны с наличие или отсутствие вторжения1стадия рака, лечение и прогноз. Около 75% случаев рака мочевого пузыря мышц инвазивных и являются управляемые с местными резекции. Напротив неинвазивного мышц мочевого пузыря рак (около 25% всех случаев) являются агрессивные опухоли с высокой метастатических и обрабатываются с агрессивным мультимодальность терапии2,3. Таким образом важно понимание того молекулярные пути, которые вызывают вторжения лучше характеризуют риска инвазивного прогрессии и разработать терапевтические вмешательства, которые могут предотвратить инвазивное прогрессии.

Инвазивные прогрессии опухоли происходит в среде сложной трехмерной (3-D) и включает в себя взаимодействие клеток опухоли с другие опухолевые клетки, строма, базальной мембраны и других типов клеток, в том числе иммунных клеток, фибробластов, мышечных клеток и сосудов эндотелиальные клетки. Проницаемых поддержки (например, Transwell) анализа систем обычно используются, чтобы quantitate раковых клеток вторжения4, но эти системы ограничены, потому что они не позволяют микроскопических мониторинг процесса вторжения в режиме реального времени и получение образцов для дальнейшего окрашивания и молекулярный анализ является сложной задачей. Разработка системы сфероида опухоли 3-D мочевого пузыря для изучения вторжения желательно, потому что она позволяет включение определенных microenvironmental компонентов с удобством в vitro системах.

В этом протоколе, мы описать систему допросить инвазивных процессов человека пузыря раковых клеток с помощью пробирного вторжения 3-D сфероида, включающих матрицы геля на основе коллагена и confocal микроскопии позволяет следователям для мониторинга клетки моторики и вторжение в режиме реального времени (рис. 1А). Эта система является универсальным и может быть изменено для допроса различных стромальные опухоли/параметры. Это может включать большинство линий клеток рака мочевого пузыря или опухоли мочевого пузыря первичных и дополнительных стромальные клетки, таких, как рак, связанные фибробластов и иммунные клетки5,6,7. Этот протокол описывает матрицы состоит из коллагена типа-1, но может быть изменен для включения других молекул, например, фибронектин, Ламинин или других белков коллагена. Инвазивных процессов может следовать за 72 ч или больше в зависимости от возможности микроскопа и используемой системы. Фиксация и иммунофлюоресценции окрашивание опухоли, встроенные в матрице 3-D до, во время и после вторжения позволяет допроса upregulated белков в инвазивных клеток, обеспечивая тем самым важную информацию, которая обычно отсутствует или собрать трудно использование других моделей 3-D культуры. Эта система также может использоваться для экрана соединений, которые блокируют вторжение и разграничить сигнальных путей, пострадавших от таких соединений.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. рост рака сфероидов

  1. Растущий из клеточных линий
    1. Культура человека пузыря раковые клетки под обычными приверженца клетки культуры условий и поддерживать в инкубаторе 37 ° C, поставляется с 5% CO2. Сохранить клетки в < 90% confluency.
      Примечание: носители культуры является Дульбекко изменение минимальных основных СМИ (DMEM), содержащий 4,5 г/Л D-глюкоза, L-глютамин, пируват натрия 110 мг/Л и поставляется с 10% плода бычьим сывороточным (ФБС) на протяжении всего настоящего Протокола.
    2. Один день до начала эксперимента, trypsinize (с помощью 0,25% трипсина-ЭДТА) клетки, количественного определения концентрации клеток и распространять 1 х 106 клеток в 3 мл культуры средств массовой информации в каждой скважине 6-ну сверхнизкие крепежной пластиной.
    3. Инкубации клеток в условиях низкой вложений при 37 ° C для ≥16 h. Это должно позволить достаточное время для ячеек в совокупности в сфероидов для большинства линий клетки рака мочевого пузыря.
      Примечание: Формирование сфероидов можно наблюдать Перевернутый светлые области микроскопа. Оптимальный размер и количество сфероидов может зависеть от отдельных экспериментов, но мы находим, что сфероидов с диаметрами от 50 мкм до 150 мкм, обычно подходят для покадровой изображений с использованием 20 X объектив.
    4. Включить дополнительные ячейки типы, такие как фибробластов или иммунные клетки в сфероидов, смешивать нужные ячейки с раковых клеток на нужное соотношение (1:1, 1:10, и т.д.) в ультра-низким уровнем вложения пластины и инкубировать при 37 ° C для ≥16 h разрешить формирование смешанные клетки типа сфероидов.
  2. Рост от первичной опухоли
    Примечание: Опухоль сфероидов также могут быть получены от опухоли мочевого пузыря первичных источников, например опухоли превратилось от опухоли мочевого пузыря канцероген индуцированной модели8. Например, опухоли мочевого пузыря, созданные от мышей кормили с N-бутила (4-hydroxybutyl) - N - нитрозамины (BBN), может быть собран и фарш на мелкие кусочки (около 0,5 мм3) используя стерильные хирургические инструменты. Переваривается первичные пробы человека мочевого пузыря, рак может также учился в этой системе.
    1. Собирать и мыть 0,5 мм3 опухоли штук в 5 мл ледяной фосфат амортизированное saline (PBS). Центрифугирование в 200 x g 5 мин при 4 ° C. Повторите этот шаг Стиральная один раз.
    2. Собирать кусочки опухоли центрифугированием на 200 x g 10 мин при 4 ° C. Удалить супернатант и добавьте 5 мл DMEM, содержащие 10% FBS. Передать опухоли сфероида/СМИ смесь 6-ну сверхнизкие крепежной пластиной. Инкубировать при 37 ° C для ≥16 h до встраивания в коллагеновой матрицы (см. шаг 2.3).

2. Подготовка камеры 3-D культуры

  1. Разбавить тип-1 коллагена (производный от крыс хвост) в среде DMEM, содержащие 10% FBS сделать 2 мг/мл смеси согласно инструкциям производителя.
    1. Короче говоря Смешайте коллаген с соответствующим количеством 1 N NaOH решения и DMEM нежный дозирование по инструкциям производителя для достижения физиологический рН.
    2. После смешивания коллагена и DMEM, быстро пальто скважин слайд камеры (для большинства приложений, палата слайды с число 1,5-стеклом является оптимальным) с коллагена DMEM смеси до затвердевания (200 мкл/хорошо). Разрешить покрытием палата слайд, чтобы быть стационарные при комнатной температуре в течение 15 мин.
      Примечание: Состав коллагена основе матрицы можно изменять, добавляя другие ингредиенты внеклеточного матрикса, например фибронектин или Ламинин, согласно целей эксперимента.
  2. Аккуратно накапайте 500 мкл СМИ, содержащий сфероидов (или опухоль штук, если используется образец первичной опухоли) из 6-ну сверхнизкие крепежную пластину в пробки microcentrifuge пустой 1,5 мл. Подождите 2 мин, чтобы поселиться в нижней части трубки сфероидов.
  3. Осторожно удалите супернатант из трубки. Подготовить другой трубки типа-1 коллагена (2 мг/мл) смешивается с DMEM, содержащие 10% FBS и быстро добавить 500 мкл этой смеси сфероидов. Осторожно Смешайте сфероидов и коллагена, Медленное дозирование.
  4. Добавьте 250 мкл сфероидов/коллаген смесь в хорошо коллагена pre покрытием палата слайда. Разрешить коллагеновой матрицы, содержащие сфероидов закрепить полностью (около 30 минут при 37 ° C).
  5. После затвердевшим коллагеновой матрицы, добавьте 1 mL DMEM, содержащие 10% FBS для каждой скважины (рис. 1Б). Инкубируйте в камере слайд инкубатора 37 ° C, поставляется с 5% CO2 до готовности для изображений.

3. живой клетки покадровой изображений

  1. Включите Конфокальный микроскоп следуя инструкциям производителя и убедитесь, что климатической камере достигает 37 ° C и поставляется с 5% CO2.
    Примечание: Наш микроскоп и камеры обычно требуют 1 h достичь равновесия системы.
  2. Тщательно передачи палата слайд слайд-адаптер, прилагается к Микроскоп.
  3. Найдите сфероидов интерес с использованием малой мощности цели (например, 5 X) и начать изображений с тем более высокой мощности (в текущем протоколе, 20 X цель используется для большинства изображений живой клетки для лучшего качества изображения).
    Примечание: Для первичной пузыря опухоли образцов, 5 X и 10 X целей могут быть необходимы для того, чтобы покрыть большую площадь изображений. Для наших покадровой изображений, изображений интервал задан как 30 мин и стек Z используется для изображения всего сфероида. Обычно расстояние между Z-ломтики присваивается 4 μm 20 X цели и общее расстояние оси Z — около 200 µm. изображения могут быть получены с помощью DIC и с флуоресценцией если клеток/тканей гавани флуоресцентный белок маркеров.
  4. Выполните покадровый изображений для 24-72 ч.
    Примечание: Продолжительность определяется тип ячейки и потребности эксперимента.

4. Подготовка образца блока, содержащего сфероидов рака для разрезания замороженные ткани

  1. Аккуратно поднимите блок гель коллагена и сфероидов от камеры слайды с помощью небольших щипцами. Поместите блок гель коллагена в пластиковых гистология плесень.
  2. Промойте гель коллагена с ПБС кратко и затем исправить ее с параформальдегида 4% (PFA) в PBS на 30 минут при комнатной температуре.
    Предупреждение: PFA является потенциальным канцерогеном и должны быть обработаны с осторожностью.
  3. Промойте гель коллагена с 1,5 мл 1 x PBS на шейкер на 15 мин заменить PBS и повторите предыдущий шаг, Стиральная 3 x.
  4. Нанесите тонкий слой (около 3 мм) оптимального раскроя температуры (OCT) соединение для покрытия нижней части новой формы пластиковые гистологии. Место фиксированной и промывают гель коллагена на вершине OCT соединение, затем тщательно внедрить весь гель, заполнив форму с октября составные избегая формирование любых воздушных пузырьков в центре развертывания Office.
  5. Оставьте плесень на 4 ° C на 1 час.
  6. Место плесень, содержащий образец и октября соединения на чашку Петри 100 мм, плавающей на жидком азоте. Разрешить для флэш заморозить полностью образца.
  7. Храните замороженные образец блока на-80 ° C для использования в будущем.

5. иммунофлюоресценции изображений для замороженных секционного рака сфероидов

  1. Замороженные образец блок передачи из морозильной камеры-80 ° C-20 ° C палаты криостата.
  2. Выполнение обычных замороженных секционирование, установив интервал раздел 7 мкм. Пусть секционного образцы придают стекла слайд без морщин или ловушку воздуха.
    1. Храните слайды при температуре-80 ° C до выполнения дальнейшего окрашивания.
      Примечание: Различные интервалы времени могут использоваться для экспериментальной потребностям.
  3. Воздух сухой слайды для 1 ч при комнатной температуре.
  4. Разрушения образцов с PBS, содержащих 0,5% Тритон X-100 за 15 мин.
  5. Мыть образцов 3 x 10 мин в мыть с PBS.
  6. Окружить образцы на слайде с гидрофобным барьеров с помощью пера гидрофобный барьер.
  7. Лечить образцов раствором блокировки (ПБС содержащие 5% бычьим сывороточным альбумином (БСА)), за 1 ч при комнатной температуре.
  8. Применить 40 мкл раствора первичного антитела содержащих (1 x PBS, содержащих 5% BSA с разбавления 1: 100 первичных антител) для каждого образца на слайде.
  9. Инкубируйте слайды в первичных антител при 37 ° C за 1 ч или при комнатной температуре на ночь (время инкубации и условий зависит от основного антитела).
  10. Мыть образцов 3 x 15 мин (в мыть) с PBS.
  11. Применить 40 мкл раствора вторичных антител содержащих (1 x PBS, содержащих 5% BSA с вторичное антитело разбавления 1: 300) для каждого образца на слайде.
  12. Мыть образцов 3 x 15 мин (в мыть) с PBS.
  13. Пятно образцы с Hoechst 33342 раствором (1 мкг/мл, разбавленных в PBS) при комнатной температуре в течение 10 мин. Затем промойте образцы с PBS на 5 мин.
  14. Маунт образцы с монтажа средних и покрыть их с соответствующего размера обложки скользит. Оставьте слайды в темноте при комнатной температуре на 24 часа и затем выполнить confocal микроскопии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Успешное создание инвазивных мочевого пузыря рак опухоли сфероида требует формирования соответствующего размера опухоли сфероидов от клеточных линий или первичной опухоли. Рисунок 2 A показывает размера сфероидов превратилось от четыре человека мочевого пузыря рак клеточных линий (UM-UC9, UM-UC13, UM-UC14, 253J и UM-UC18). Рисунок 2 B показывает опухоль сфероида от опухоли мочевого пузыря генерир...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Здесь мы описываем 3-D опухоли сфероида модель, которая позволяет в реальном времени наблюдения вторжения рака мочевого пузыря, которая имеет решающее значение для прогрессии рака и метастаз. Эта система поддается включение различных стромы и клеточных компонентов разрешить следователям лучше напомнить микроокружения ткани где происходит вторжение рака мочевого пузыря. Сфероидов рака мочевого пузыря могут быть получены из различных источников, таких как клеточные линии (включая генетически измененные клеточные линии поле...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют не конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить лаборатории д-р Ховард Кроуфорд (Мичиганский университет) для технической поддержки и предоставление материалов и оборудования для этого исследования и Алан Kelleher для технической поддержки.

Эта работа финансировалась грантов из университета Мичигана с Рак центр Core Грант CA046592-26S3, низ K08 CA201335-01A1 (ПЛП), BCAN YIA (ПЛП), низ R01 CA17483601A1 (DMS).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Клеточные линии рака мочевого пузыря человека UM-UC9, UM-UC13, UM-UC14, UM-UC18, 253J
Среда для культивирования клетокDMEM Thermo Fisher Scientific11995065
Фетальная бычья сыворотка Thermo Fisher Scientific26140079
Антибиотик-антимикотик (100x)Thermo Fisher Scientific15240062
Трипсин-ЭДТА (0,25%), феноловый красныйThermo Fisher Scientific25200056
Бычий сывороточный альбумин (БСА)Sigma-AldrichA3803
Фосфатно-солевой буфер (PBS), pH 7,4 Thermo Fisher Scientific10010023
Costar Ultral-low насадка 6-луночный кластер Corning3471
Обычный инвертированный микроскоп Carl Zeiss491206-0001-000Общее применение для культивирования клеток и проверки сфероидов
Коллаген 1 типа из крысиного хвоста, высокая концентрация Corning354249
Nunc Lab-Tek II Камерное защитное стеклоThermo Fisher Scientific155382
конфокальный микроскоп Carl ZeissLSM800Конфокальный мискоскоп с климатической камерой, многопозиционной визуализацией и функцией сканирования Z-стека 
Криостат микромтомLeica BiosystemsCM3050 S
Zen 2 Программное обеспечение для обработки изображений Carl Zeiss
Раствор параформальдегидаЭлектронная микроскопия Sciences15710
ImmEdge Гидрофобный барьер PAP PenVector Laboratories H4000
O.C.T compound Thermo Fisher Scientific23730571
Hoechst 33342 раствор Thermo FisherScientific 62249
Антитело против ATDC (Trim29)Sigma-AldrichHPA020053
Антитело против цитокератина 14 Abcamab7800
Антитело против ВиментинаAbcamab24525
ProLong Diamond Монтажный материал

Ссылки

  1. American Cancer Society. The Society. , Atlanta, GA. (2018).
  2. Knowles, M. A., Hurst, C. D. Molecular biology of bladder cancer: new insights into pathogenesis and clinical diversity. Nature Reviews Cancer. 15 (1), 25-41 (2015).
  3. DeGeorge, K. C., Holt, H. R., Hodges, S. C. Bladder Cancer: Diagnosis and Treatment. American Family Physician. American Family Physician. 96 (8), 507-514 (2017).
  4. Repesh, L. A. A new in vitro. assay for quantitating tumor cell invasion. Invasion Metastasis. 9 (3), 192-208 (1989).
  5. Doillon, C. J., Gagnon, E., Paradis, R., Koutsilieris, M. Three-dimensional culture system as a model for studying cancer cell invasion capacity and anticancer drug sensitivity. Anticancer Research. 24 (4), 2169-2177 (2004).
  6. Duong, H. S., Le, A. D., Zhang, Q., Messadi, D. V. A novel 3-dimensional culture system as an in vitro. model for studying oral cancer cell invasion. International Journal of Expermintal Pathology. 86 (6), 365-374 (2005).
  7. Rebelo, S. P., et al. 3D-3-culture: A tool to unveil macrophage plasticity in the tumour microenvironment. Biomaterials. , 185-197 (2018).
  8. Vasconcelos-Nobrega, C., Colaco, A., Lopes, C., Oliveira, P. A. Review: BBN as an urothelial carcinogen. In Vivo. 26 (4), 727-739 (2012).
  9. Palmbos, P. L., et al. ATDC/TRIM29 Drives Invasive Bladder Cancer Formation through miRNA-Mediated and Epigenetic Mechanisms. Cancer Research. 75 (23), 5155-5166 (2015).
  10. Wang, L., et al. ATDC induces an invasive switch in KRAS-induced pancreatic tumorigenesis. Genes & Development. 29 (2), 171-183 (2015).
  11. Fife, C. M., McCarroll, J. A., Kavallaris, M. Movers and shakers: cell cytoskeleton in cancer metastasis. British Journal of Pharmacology. 171 (24), 5507-5523 (2014).
  12. Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Control of microtubule organization and dynamics: two ends in the limelight. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (12), 711-726 (2015).
  13. Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
  14. Kidd, M. E., Shumaker, D. K., Ridge, K. M. The role of vimentin intermediate filaments in the progression of lung cancer. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (1), 1-6 (2014).
  15. Lowery, J., Kuczmarski, E. R., Herrmann, H., Goldman, R. D. Intermediate Filaments Play a Pivotal Role in Regulating Cell Architecture and Function. Journal of Biological Chemistry. 290 (28), 17145-17153 (2015).
  16. Papafotiou, G., et al. KRT14 marks a subpopulation of bladder basal cells with pivotal role in regeneration and tumorigenesis. Nature Communications. 7, 11914(2016).
  17. Sun, W., Lim, C. T., Kurniawan, N. A. Mechanistic adaptability of cancer cells strongly affects anti-migratory drug efficacy. Journal of the Royal Society Interface. 11 (99), (2014).
  18. Goddette, D. W., Frieden, C. Actin polymerization. The mechanism of action of cytochalasin D. Journal of Biological Chemistry. 261 (34), 15974-15980 (1986).
  19. Berrier, A. L., Yamada, K. M. Cell-matrix adhesion. Journal of Cellular Physiology. 213 (3), 565-573 (2007).
  20. Lee, J. H., et al. Collagen gel three-dimensional matrices combined with adhesive proteins stimulate neuronal differentiation of mesenchymal stem cells. Journal of the Royal Society Interface. 8 (60), 998-1010 (2011).
  21. LeBleu, V. S., Macdonald, B., Kalluri, R. Structure and function of basement membranes. Experimental Biology and Medicine. 232 (9), 1121-1129 (2007).
  22. Rakha, E. A., et al. Invasion in breast lesions: the role of the epithelial-stroma barrier. Histopathology. , (2017).
  23. Erler, J. T., Weaver, V. M. Three-dimensional context regulation of metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. 26 (1), 35-49 (2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

3-D клетки культуры системы для изучения вторжения и оценки терапии рака мочевого пузыря
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.