Методическая статья

Автоматизированный метод для определения производительности дрозофила в ответ на изменения температуры в пространстве и времени

6.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/58350

⸱

12 октября 2018 г.

 ,  ,  ,  , 
1Groningen Institute for Evolutionary Life Sciences, University of Groningen, 2Department of Cell Biology, University of Groningen, University Medical Center Groningen, 3Ruijsink Dynamic Engineering, 4Department of Psychology, University of Groningen

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол автоматически определять опорно производительность дрозофилы на изменение температуры, с использованием программируемой температуры Арена, которая производит быстрой и точной температуры изменения во времени и пространстве.

Аннотация

Температура является повсеместно экологический фактор, который влияет как видов распространять и вести себя. Различные виды фруктов мухи дрозофилы имеют конкретные ответы на изменение температуры согласно их физиологической терпимости и адаптируемость. Мухи дрозофилы также обладают температуры системы, которая стала основой для понимания нейронной основе температуры обработки в ectotherms. Мы представляем здесь температуры Арена, который позволяет быструю и точную температуру изменения с временных и пространственных управления для изучения реакции отдельных летит к изменению температуры. Индивидуальные мух помещаются на арене и подвергается запрограммированные температуры вызовы, такие, как единообразные постепенное увеличение температуры для определения нормы реакции или пространственно распределенных температур в то же время для определения предпочтений. Люди автоматически отслеживаются, позволяя количественная оценка скорости или расположение предпочтения. Этот метод может использоваться для быстро подсчитать ответ над большой диапазон температур для определения температурных кривых производительности в дрозофила или других насекомых, аналогичного размера. Кроме того она может использоваться для генетических исследований для количественного определения температуры предпочтения и реакции мутанты или одичал тип мух. Этот метод может помочь выявить основу тепловой видообразования и адаптации, а также нейронные механизмы за температуры обработки.

Введение

Температура является постоянной экологический фактор, который влияет как организмы работать и вести себя1. Различия в широты и высоты приводят к различиям в типе климатов, подвергаются организма, что приводит к эволюционного отбора для их ответы на температуры2,3. Организмов реагировать на различные температуры через морфологические, физиологические и поведенческие адаптации, которые обеспечивают максимальную производительность в их конкретных условиях4. Например в плодовой мушки Drosophila melanogaster, население из разных регионов имеют различные температуры предпочтения, размеров тела, развития раз, долговечность, плодовитость и пешеходных производительность при разных температурах2 ,5,6,7. Разнообразие наблюдается между мух различного происхождения частично объясняется генетической изменчивости и пластиковые ген выражение8,9. Аналогичным образом дрозофила видов из разных областей по-разному распределить среди температурных градиентов и показать различия в сопротивление жары и холодные испытания10,,1112.

Дрозофилы также недавно стала модель выбора для понимания генетических и нейронных основы температуры восприятие13,14,,1516,17. Широко взрослых мух воспринимают температуры через холодные и горячие периферийных температурных датчиков в усики и датчики температуры в мозг13,14,,1516 , 17 , 18 , 19 , 20. на периферии рецепторы для горячей температуры Экспресс Gr28b.d16 или пирексия21, то время как периферия холодной рецепторов характеризуются Brivido14. В головном мозге температура обрабатывается нейронов, выражая TrpA115. Поведенческие исследования на мутантов этих путей улучшение нашего понимания как обрабатывается температуры и дать понимание механизмов, которые варьируются среди популяций Drosophila из разных регионов.

Здесь мы описываем температуры Арена, который производит изменения быстрой и точной температуры. Следователи предварительно запрограммировать эти изменения, который позволяет для температуры стандартизированных и повторяемые манипуляции без вмешательства человека. Мух записываются и считано со специализированным программным обеспечением, чтобы определить их положение и скорость на различных этапах эксперимента. Основные измерения, представленные в настоящем Протоколе является пешеходной скорость при разных температурах, потому что это экологически соответствующий индекс физиологических производительности, который может идентифицировать отдельных тепловых адаптируемость5. Вместе с температурой рецептор мутантов эта техника может помочь выявить механизмы тепловой адаптации на клеточном и биохимических уровнях.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка летать пищевой среды

  1. Налейте стакан стекло 2 Л 1 Л воды и добавьте магнитные перемешать бар. Поставил стакан на магнитной плитой на 300 ° C, до тех пор, пока температура кипения достигнута.
  2. Движение на 500 выстрелов/мин и добавьте следующее: 10 g агар, 30 г глюкозы, 15 г сахарозы, 15 г кукурузной муки, 10 г пшеничных зародышей, 10 г соевой муки, 30 г патоки и 35 g активных сухих дрожжей.
  3. Когда смесь энергично пены, поверните вниз плита температур до 120 ° C продолжая перемешивание.
  4. Свернув терморегуляцией температуры далее до 30 ° C после 10 минут, помешивая, пока смесь остывает до 48 ° C. Измерьте температуру, вставив термометр непосредственно в пищу не касаясь стены стакан.
  5. Растворите 2 g p гидрокси бензойная кислоты метилового эфира в 10 мл 96% этанола и добавить его в смесь, вместе с 5 мл 1 М пропионовой кислоты. Продолжить помешивая в течение 3 мин.
  6. Выключите конфорку и вылить 45 мл пищи в воспитании бутылки и 6,5 мл пищи в коллекции флаконов.

2. Подготовка мух

  1. Место 20 мужчин и 20 женщин мухи в воспитании бутылки, содержащие 45 мл среды покупать продукты питания. Передача мух в новые бутылки после 3 до 4 дней путем выстукивать их вниз и затем выстукивать их в свежий бутылки. Отказаться от мух после трех изменений.
    1. Поместите бутылки внутри инкубатор под 12-h свет/12-h темные циклы с постоянной температурой 25 ° c.
      Примечание: Новое поколение мух будет Эклоз через десять дней.
  2. Анестезировать недавно eclosed мух на двуокиси углерода колодки для максимум 4 мин и собрать их в 2,5 х 9,5 см летают воспитания флаконах с 6,5 мл летать пищевой среды с помощью кисти.
    1. Собирают только девственной мух и разделить их по признаку пола на группы 20 мух на воспитание во флаконе.
    2. Место флаконы внутри инкубаторы для 5-7 дней, изменив мух новых флаконах каждые 2-3 дня и в дни перед экспериментов.

3. рамка фары

  1. Сделать деревянную раму длиной 10 см, ширина 4 см, высота 4 см и толщиной 0,5 см.
  2. На каждом из короткого края, создание границы длиной 4 см, высота 4 см и шириной 1,5 см к внутренней области деревянной раме. Оставьте внутренних торцевых открыть границы.
  3. Два отверстия диаметром 0,5 см на пересечении одной из длинные края деревянной рамы и на каждой из границ на короткого края.
  4. Место 10 см теплый белый светодиодные полосы внутри каждой из границ на короткой кромках. Пил задней светодиодные полосы немедленно клеить его на месте.
    Примечание: Для экспериментов, в которых освещение необходимо ликвидировать, теплый белый Светодиодная лента может быть заменен на инфракрасный светодиод полосы.
  5. Подключите один конец светодиодные полосы в одну из границ импульсный источник питания и его другой конец светодиодные полосы на противоположной границы.
  6. Включите импульсный источник питания, чтобы убедиться, что оба светодиодные полосы включите.
  7. Обложка открытой стороне каждой границы с куском белой бумаги.
  8. Приклейте другой листок бумаги для каждого из внутренних фаз длинные края.

4. температуры Арена

  1. Включите температуры Арена (рис. 1A и 1 C). Убедитесь, что Вентилятор запускается и алюминиевое кольцо начинается разминка.
  2. Используйте USB-кабель для подключения температурного Арена на компьютер управления скрипта TemperaturePhases с последовательностями температуры.
  3. Откройте сценарий TemperaturePhases в управляющего компьютера и убедитесь, что температура последовательности правильно настроена (1 видео).
    1. Проверьте, что продолжительность каждой экспериментальной фазы равным 60 s, убедившись, что «пар. StimulusDur» равен 60 s.
    2. Проверьте, что равным 1) число желаемое число фаз, 2) итерационный ON/OFF set-up ориентировочные красный свет диоды (СИД), повышение температуры 3) 2 ° C на фазу, и 4) 16 ° C в качестве стартовой температуры все правильно под «начать экспериментальный блок» раздел.
      Примечание: Разрешить мух, чтобы акклиматизироваться летать арену для 7 мин на 16 ° C, с тем чтобы избежать искусственного увеличения скорости во время первой экспериментальной фазы (рис. 2).
    3. Запустите сценарий TemperaturePhases . Программное обеспечение будет инициализировать на 5 секунд, как это определено в «арене. Подождите» и затем остановить.
    4. Нажмите пробел клавиатуры, чтобы начать выполнение экспериментальной фазы после того, как был взорван летать летать арену (шаг 5.3).
      Примечание: TemperaturePhases является текущий сценарий, контролируя поле; Однако это можно создать другие пользовательские сценарии для использования этого устройства, которые приспосабливаться к требованиям различных экспериментов.
  4. Подключите камеру на вершине Арена к записи компьютер с помощью USB-кабеля камеры.
  5. Откройте программу записи видео (см. Таблицу материалы) в записи компьютер, выбрав «файл | Новая видеозапись». Откроется экран показывая изображение от камеры.
    1. Убедитесь, что изображение камеры захватывает все края арены и ориентировочные красные светодиоды.
    2. Начните запись, нажав на красную кнопку в середине нижнего края экрана показаны изображение с камеры после кадра света вокруг арены (шаг 5.4).
      Примечание: небольшие изменения в освещение может повлиять на точность отслеживания. Рекомендуется для поддержания постоянной освещение температуры Арена, фиксируя расположение аппарата.

5. Температура поведенческих эксперименты

  1. Подготовьте летать Арена (рис. 1 c).
    1. Поместите прядь белых проводящие ленты на вершине медных плиток, обеспечение того, что все углы покрываются.
    2. Место с подогревом алюминиевое кольцо вокруг медных плиток. Край кольца идеально подходит вокруг медного плитки, так что она всегда находится в том же месте.
    3. Очистите крышку стекла с чистой ткани и поместите его на вершине алюминиевое кольцо, оставляя разрыв, через который мухи могут быть ветром в.
      Примечание: Перед эксперименты, пальто стеклянная крышка с siliconizing агента для создания скользкой поверхности. Применить siliconizing агент для 24 h и промойте его водой перед использованием.
  2. Запустите сценарий TemperaturePhases (шаг 4.3.3) и откройте программу записи видео (шаг 4.5).
  3. Удар лету от выращивания флакона (шаг 2.2.2) в арену летать (например., 1 кобель летать на рис. 3).
    1. Возьмите флакон мух от инкубатора, нажмите его дважды для того, чтобы заставить их пойти на дно, ловушка одной мухи с аспиратором рот и закройте флакон и положил его обратно в инкубаторе.
    2. Место лету на арене через пробел, который оставил между стеклянной крышкой и алюминиевое кольцо (шаг 5.1.3).
    3. Разрыва между стеклянной крышкой и алюминиевое кольцо, нажав стеклянную крышку, пока он не достигнет края алюминиевое кольцо как только лету вводится на арену, летать.
  4. Поместите кадр огней вокруг арены для обеспечения симметричных освещения.
    1. Марк местоположение (например., с помощью постоянного маркера) кадра света вокруг арены летать (рис. 1 c) для обеспечения, что кадр всегда размещается в том же месте.
  5. Начать запись с видео записи программы (шаг 4.5.2) и нажмите клавишу пробела на клавиатуре компьютера для запуска экспериментального этапа (шаг 4.3.4).
  6. После всех экспериментальных этапов сделали, сохранить видео в формате .mp4 или .avi и удалить лету от Fly Арена с аспиратором рот.
    Примечание: В конце экспериментального этапа может быть определен как ориентировочные красные светодиоды, выключения или остановки скрипта TemperaturePhases .
    1. Остановите запись, нажав кнопку Остановить в середине нижнего края экрана в программе записи видео. Нажмите «файл | Сохранить как», чтобы сохранить видео.

6. видео отслеживание и анализ данных

  1. Используйте FlySteps отслеживания программного обеспечения (2 видео) для отслеживания видео.
    1. Откройте «configuration_file.ini» внутри папки «FlyTracker».
    2. Задайте расположение видео в «video_folder» и имена видео в «video_files».
    3. Укажите границы летать арены в «arena_settings», основанный на (x, y) координаты пикселя нескольких точек на краю арены.
    4. Укажите местоположение ориентировочные красные светодиоды в «led_settings», основанный на (x, y) пиксельные координаты местоположения в центре светодиодов.
    5. Проверьте местоположение границ летают Арена, установив «Отладка» значение «true» в «arena_settings», нажав кнопку «Сохранить» и запуск сценария в терминале. Экран захвата видео появится синий квадрат, образованный координаты введены в «arena_settings».
      Примечание: Этот квадрат окружает области, чтобы быть считано.
    6. Измените «Отладка» в «arena_settings» на «false», нажмите «Сохранить» и еще раз запустить экран в терминале.
      Примечание: Это будет начать процесс отслеживания.
      Примечание: Мухи могут выйти из области отслеживания на подогревом алюминиевое кольцо. Это происходит в течение первых секунд эксперимента, после чего мух остановить трогательно подогревом кольцо и остаются внутри области отслеживания.
      Примечание: Видео могут быть отслежены с другими отслеживания программного обеспечения согласно предпочтениям экспериментатора.
  2. Использование (x, y) местоположение каждого полета, предоставляемый отслеживания программного обеспечения для расчета меру интерес для температуры производительности. Пользовательские сценарии (например., FlyStepsAnalysis в дополнительных) могут быть использованы.
  3. Сравните производительность градуировки летать различных групп, используя повторные измерения (RM) дисперсионный анализ (ANOVA) и пост hoc несколько сравнений с использованием статистического программного обеспечения (см. Таблицу материалы).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Температуры Арена (рис. 1A) состоит из трех меди плитки, температура которой может управляться индивидуально через программируемый цепи. Каждый медная черепица обладает температурный датчик, который дает обратную связь для программируемых цепи. Цепь активирует питания для повышения температуры каждой плитки. Пассивные термоэлектрические элементы выступать в качестве элементов постоянного нагрева для поддержания нужной температуры, в то время как теплоотвод ох...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Здесь мы представили автоматизированный температуры Арена (рис. 1) которая производит точной температуры изменения во времени и пространстве. Этот метод позволяет воздействия отдельных дрозофилы не только для запрограммированных постепенное повышение температуры (рис. 2 и рис. 3), но и вызовы динамических температуры, в которые каждая плитка летать арены был нагрет самостоятельно для разной температуры (

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана в части стипендию от поведенческих и когнитивных нейронаук программа Университета Гронингена и аспирантов стипендии от Consejo Nacional de науки y Tecnología (КОНАСИТ) из Мексики, предоставленных Андреа Сото-Падилья и Грант от Фонда Джон Templeton для изучения времени награждены Hedderik Ван Рейн и Жан-Кристоф Биллетер. Мы благодарны также Питер Gerrit Босма за его участие в разработке FlySteps tracker.

Скрипты TemperaturePhases, FlySteps и FlyStepAnalysis можно найти дополнительную информацию и временные и публично доступна по этой ссылке:
HTTPS://dataverse.nl/privateurl.XHTML?Token=c70159ad-4d92-443d-8946-974140d2cb78

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Arduino DueArduinoA000062программное обеспечение RUG
Electronics BoardRuijsink Dynamic EngineeringFF-Main-02-2014
Блок питания BoostXP-Power 48. V 65 ВтECS65US48установлено на 53 вольта
источник питания Подогрев плиткиXP-Power 15. V 80 ВтVFT80US15
Блок питания ОхлаждениеXP-Power 15. V 130 ВтECS130U515
элементы ПельтьеMarlow IndustriesRC12-42 элемента, управляемая подача постоянного тока
РадиаторFisher TechnikLA 9/150-230VРазвязанный для вибрации
Датчики температурыСпециальностиизмерения MCD_10K3MCD1Микротермисторный зонд
Медный блок/плиткаRuijsink Dynamic EngineeringFF-CB-01-2014
Ауминумовое кольцоRuijsink Dynamic EngineeringFF-RoF-02-2015
Tesa 4104 белая лента 25 x 66 ммRS Компоненты111-2300 Белая проводящая лента
Красные светодиодыLucky Ligtll-583vc2c-v1-4daДлина волны от 625 нм, 20 мА до 6
В Теплая белая светодиодная лентаLedstripkoningHQ-3528-SMD60 светодиодов на метр
Коммутационный блок питанияОбщийT-36-12
Logitech c920Logitech Europe S.APN960-001055
QuickTime PlayerЗапись на компьютере
программа Программное обеспечение для анализа слеженияRПакеты: pacman
Программное обеспечение для анализа слеженияMATLAB
Тепловизионная системаFLIR T400sc
Графики и статистика Программное обеспечениеGraph Pad Prism
SigmacoteSigma-AldrichSL2-100MLСиликонизирующий агент
Бутылки для выращивания мухFlystuff32-1306oz Бутылочка с дрозофилой
FlypadFlystuff59-114
Флаконы для выращивания мухDominique Dutscher789008Пробирки Drosophila узкие 25x95 мм
ИнкубаторSanyoMIR-154
Магнитная конфоркаHeidolph505-20000-00MR Hei-Standard
АгарКальдик Ингредиенты Б.В.010001.26.0
ГлюкозаГезонд wel1019155Dextrose/Druivensuiker
SucroseVan GilseСахарный песок
Кукурузная мукаFlystuff62-100
Зародыши пшеницыGezond& вел1017683
Соевая мукаFlystuff62-115
ПатокаFlystuff62-117
Активные сухие дрожжиRed Star
TegoseptFlystuff20-258100%
Apple

Ссылки

  1. Abram, P. K., Boivin, G., Moiroux, J., Brodeur, J. Behavioural effects of temperature on ectothermic animals unifying thermal physiology and behavioural plasticity. bioRxiv. , (2016).
  2. Rajpurohit, S., Schmidt, P. S. Measuring thermal behavior in smaller insects: A case study in Drosophila melanogaster demonstrates effects of sex, geographic origin, and rearing temperature on adult behavior. Fly. 10 (4), 149-161 (2016).
  3. Jezovit, J. A., Levine, J. D., Schneider, J. Phylogeny environment and sexual communication across the Drosophila genus. The Journal of Experimental Biology. 220 (1), 42-52 (2017).
  4. Sinclair, B. J., Williams, C. M., Terblanche, J. S. Variation in Thermal Performance among Insect Populations. Physiological and Biochemical Zoology. 85 (6), 594-606 (2012).
  5. Gibert, P., Huey, R., Gilchrist, G. Locomotor performance of Drosophila melanogaster: Interactions among developmental and adult temperautures, age, and geography. Evolution. 55 (1), 205-209 (2001).
  6. Trotta, V., et al. Thermal plasticity in Drosophila melanogaster: A comparison of geographic populations. BMC Evolutionary Biology. 6, 1-13 (2006).
  7. Klepsatel, P., Gálikova, M., De Maio, N., Huber, C. D., Christian, S., Flatt, T. Variation in thermal performance and reaction norms among populations of Drosophila melanogaster. Evolution. 67 (12), 3573-3587 (2013).
  8. Latimer, C. A. L., Wilson, R. S., Chenoweth, S. F. Quantitative genetic variation for thermal performance curves within and among natural populations of Drosophila serrata. Journal of Evolutionary Biology. 24, 965-975 (2011).
  9. Chen, J., Nolte, V., Schlotterer, C. Temperature-related reaction norms of gene expression: Regulatory architecture and functional implications. Molecular Biology and Evolution. , (2015).
  10. Kellermann, V., Overgaard, J., Hoffmann, A. A., Flojgaard, C., Svenning, J. -C., Loeschcke, V. Upper thermal limits of Drosophila are linked to species distributions and strongly constrained phylogenetically. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (40), 16228-16233 (2012).
  11. Andersen, J. L., Manenti, T., Sørensen, J. G., Macmillan, H. A., Loeschcke, V., Overgaard, J. How to assess Drosophila cold tolerance: Chill coma temperature and lower lethal temperature are the best predictors of cold distribution limits. Functional Ecology. 29 (1), 55-65 (2015).
  12. Krstevska, B., Hoffmann, A. A. The effects of acclimation and rearing conditions on the response of tropical and temperate populations of Drosophila melanogaster and D. simulans to a temperature gradient (Diptera: Drosophilidae). Journal of Insect Behavior. 7 (3), 279-288 (1994).
  13. Frank, D. D., Jouandet, G. C., Kearney, P. J., Macpherson, L. J., Gallio, M. Temperature representation in the Drosophila brain. Nature. 519 (7543), 358-361 (2015).
  14. Gallio, M., Ofstad, T. A., Macpherson, L. J., Wang, J. W., Zuker, C. S. The coding of temperature in the Drosophila brain. Cell. 144 (4), 614-624 (2011).
  15. Hamada, F. N., et al. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 454 (7201), 217-220 (2008).
  16. Ni, L., et al. A gustatory receptor paralogue controls rapid warmth avoidance in Drosophila. Nature. 500 (7464), 580-584 (2013).
  17. Liu, W. W., Mazor, O., Wilson, R. I. Thermosensory processing in the Drosophila brain. Nature. 519 (7543), 353-357 (2015).
  18. Neely, G. G., et al. TrpA1 Regulates Thermal Nociception in Drosophila. Public Library of Science ONE. 6 (8), e24343(2011).
  19. Zhong, L., et al. Thermosensory and non-thermosensory isoforms of Drosophila melanogaster TRPA1 reveal heat sensor domains of a thermoTRP channel. Cell Reports. 1 (1), 43-55 (2012).
  20. Barbagallo, B., Garrity, P. A. Temperature sensation in Drosophila. Current Opinion in Neurobiology. 34, 8-13 (2015).
  21. Tang, X., Platt, M. D., Lagnese, C. M., Leslie, J. R., Hamada, F. N. Temperature integration at the AC thermosensory neurons in Drosophila. Journal of Neuroscience. 33 (3), 894-901 (2013).
  22. Petavy, G., David, J. R., Gibert, P., Moreteau, B. Viability and rate of development at different temperatures in Drosophila: A comparison of constant and alternating thermal regimes. Journal of Thermal Biology. 26 (1), 29-39 (2001).
  23. Diegelmann, S., Zars, M., Zars, T. Genetic dissociation of acquisition and memory strength in the heat-box spatial learning paradigm in Drosophila. Learning & Memory. 13 (1), 72-83 (2006).
  24. Zars, M., Zars, T. High and low temperatures have unequal reinforcing properties in Drosophila spatial learning. Journal of Comparative Physiology A: Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 192 (7), 727-735 (2006).
  25. Zars, T., Wolf, R., Davis, R., Heisenberg, M. Tissue-specific expression of a type I adenylyl cyclase rescues the rutabaga mutant memory defect: in search of the engram. Learning & Memory. 7 (1), Cold Spring Harbor, NY. 18-31 (2000).
  26. Jones, M. A., Grotewiel, M. Drosophila as a model for age-related impairment in locomotor and other behaviors. Experimental Brain Research. 46 (5), 320-325 (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Drosophila

Похожие статьи