На основе HMCA изображений пластина представлен для вторжения анализа производительности. Эта пластинка облегчает формирование трехмерной (3D) опухоли сфероидов и измерение раковых клеток вторжения в внеклеточного матрикса (ECM). Квантификация assay вторжения достигается полуавтоматического анализа.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Анализ вторжения клеток рака и борьбы с метастатическим наркотиков Скрининг с использованием массива гидрогеля микро камеры (HMCA)-на основе плиты
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Метастазами рака известно причиной 90% рака летальность. Метастазирование представляет собой многоэтапный процесс, который инициирует с нашествия/проникновения опухолевых клеток в соседние ткани. Таким образом вторжение представляет собой решающий шаг в метастазов, делая вторжение процесса исследований и разработок анти метастатического наркотиков, весьма значительный. Для удовлетворения этого спроса, существует необходимость разработки моделей 3D в пробирке , которые имитируют архитектура твердых опухолей и их микроокружения наиболее близко к в естественных условиях государства, с одной стороны, но в то же время быть воспроизводимость, надежные и подходит для высокая урожайность и высокое содержание измерения. В настоящее время, большинство анализов вторжения опереться на сложные microfluidic технологий, которые являются адекватными для научных исследований, но не для большого объема наркотиков скрининг. Другие анализы, с помощью устройств на основе плиты с изолированной отдельных сфероидов в каждой скважине материал потребления и имеют низкий выборки за состояние. Цель нынешнего протокола является обеспечение простой и воспроизводимые biomimetic 3D на основе ячеек системы для анализа потенциала вторжения в больших популяциях опухоли сфероидов. Мы разработали 3D модель для assay вторжения на основе изображений плита HMCA для исследования прорастание опухоли и анти метастатического лекарственных препаратов. Это устройство позволяет производство многочисленных единообразных сфероидов за хорошо (высокая выборки за состояние) окружении компоненты ECM, при этом постоянно и одновременно наблюдения и измерения сфероидов разрешением одного элемента для средних пропускная способность скрининг анти метастатического наркотиков. Эта платформа здесь представлено производство HeLa и MCF7 сфероидов для иллюстрирующих одну ячейку и коллективные вторжения. Мы сравнить влияние ECM компонент гиалуроновой кислоты (HA) на инвазивные способность коллагена, окружающих HeLa сфероидов. Наконец мы представляем Fisetin (вторжения ингибитор) HeLa сфероидов и оксида азота (NO) (вторжения активатор) для MCF7 сфероидов. Проанализированы результаты собственных программное обеспечение, которое позволяет полуавтоматический, простой и быстрый анализ, который облегчает Многопараметрический экспертизы.
Введение
Смерти рака обусловлено главным образом распространение метастатическим клеток в отдаленные места. Многие усилия в лечении рака сосредоточены на ориентации или предотвращение формирования метастатического колоний и прогрессирования системных метастатической болезни1. Миграции клеток рака является важным шагом в процессе метастазов опухоли, таким образом, исследования рака вторжения Каскад очень важное и необходимое условие для нахождения анти метастатическим терапии.
Было установлено, что использование животных моделей как инструменты для изучения метастатической болезни очень дорого и не всегда представитель опухоли....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. HMCA пластина тиснение
Примечание: Полный процесс проектирования и изготовление полидиметилсилоксан (PDMS) штамп и HMCA изображений пластины, используемые в настоящем протоколе подробно в наших предыдущих статьях15,16. Отметку PDMS (отрицательные формы) используется для тиснения HMCA (положительные формы), которая состоит из приблизительно 450 МКН в колодец (рис. 1A). Как показано на рисунке 1B, каждый из МКС имеет форму усеченной пирамиды квадратная вверх вниз (высота: 190 мкм, небольшая базовая область: 90 мкм x 90 мкм и....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Уникальный HMCA изображений пластина используется для вторжения assay 3D опухоли сфероидов. Всего, начиная с формирования сфероида и заканчивая процессом вторжения и дополнительные манипуляции, генотипирования в пределах же пластины. Для формирования сфероида клетки HeLa загружаются в бассейне массива и поселиться в гидрогеля MCs самотеком. Гидрогель МКН, которые имеют характеристики non сторонник Лоу вложений, облегчить ячеек взаимодействия и формирования 3D опухоли сфероидов.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Это хорошо документированы, что живые организмы, характеризуются их сложные 3D многоклеточных Организации весьма отличаются от широко используемых 2D монослоя культивируемых клеток, подчеркивая настоятельную необходимость использования сотовой модели, которые лучше имитировать функции и процессы живого организма для наркотиков скрининг. Недавно многоклеточных сфероидов, organotypic культур, organoids и органов на чипе были введены8 для использования в стандартных лекарственных препаратов. Однако б.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.
Благодарности
Эта работа поддерживается завещание о Шимон Моше и Джудит Weisbrodt.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 6 микролуночных стеклянных нижних пластин с 14 мм микролунка #1.5 крышное стекло | Cellvis | P06-14-1.5-N | Коммерческие стеклянные донные пластины, которые используются для тиснения HMCA |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520100 | Раствор 6% агарозы нагревается до 80 градусов; С перед применением раствор 1% агарозы подогревают до 37°; C |
| Трипсин ЭДТА раствор B | Biological Industries | 03-052-1A | Нагретый до 37 градусов; C перед применением |
| DMEM средний, с высоким содержанием глюкозы | Biological Industries | 01-055-1A | Подогретый до 37 °°; C перед применением |
| Специальная сыворотка для новорожденных телят (NBCS) | Biological Industries | 04-122-1A | Термоинактивированная |
| DPBS (10x), без кальция, без магния | Biological Industries | 02-023-5A | Выдерживается на льду перед применением |
| NaOH, безводный | Sigma-Aldrich | S5881-500G | Используется для приготовления 1 М раствора NaOH |
| Cultrex Type I коллаген из крысиного хвоста, 5 мг/мл | Тревиген | 3440-100-01 | Держать на льду перед применением |
| Гиалуроновая кислота натриевая соль | Sigma-Aldrich | H5542-10MG | Держать на льду перед применением |
| Fisetin | Sigma-Aldrich | F505-100MG | Добавить в питательную среду, ингибитор инвазии |
| DETA/NO | Enzo Life Sciences | alx-430-014-m005 | Добавить в питательную среду, донор оксида азота |
| PI | Sigma-Aldrich | P4170 | Используется при очень низкой концентрации без необходимости промывки |
| УФ-лампы Dymax 5000-EC в комплекте с световым экраном и Блок питания Dymax EC мощностью 400 Вт | Dymax Corporation | PN 39823 | Используется для стерилизации пластин HMCA с помощью |
| микроскопа UV Inverted IX81 | Olympus | Используется для автоматического получения изображений | |
| Инкубатор для микроскопа | Услуги | Необходим для покадровых экспериментов с получением изображений, предварительно настроенных на 37 градусов; C, 5% CO2 и поддержание влажной атмосферы | |
| Субмикронный моторизованный столик типа SCAN-IM | Marzhauser Wetzlar GmbH | Используется для предварительного определения областей получения изображений, для автоматического получения изображений | |
| 14-битный, охлаждаемая камера ORCA II C4742-98 | Hamamatsu Photonics | Высокочувствительный, используется для визуализации | |
| Куб флуоресцентного фильтра для обнаружения PI | Chroma Technology Corporation | Характеристики фильтра-куба: фильтр возбуждения 530-550 нм, дихроичное зеркало длиной 565 нм и эмиссионный фильтр 600-660 нм | |
| Операционное программное обеспечение Olympus Cell^P | Программное обеспечение Olympus | , используемое для управления микроскопом, моторизованным столиком, камерой и получением изображений | |
| Программное обеспечение для анализа Matlab R2014B Программное обеспечение для анализа | Mathworks | Используется для разработки собственного графического пользовательского интерфейса для анализа изображений | |
| Программное обеспечение Excel | Microsoft | Используется для управления данными, расчетов, создания графиков и статистики |
Ссылки
- Guan, X. Cancer metastases: challenges and opportunities. Acta pharmaceutica Sinica. B. 5 (5), 402-418 (2015).
- Sapudom, J., et al. The phenotype of cancer cell invasion controlled by fibril diameter and pore size of 3D collagen networks.<....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
